来源：Multi-module metabolic engineering of Escherichia coli for high-level production of L-leucine（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
L-亮氨酸作为一种支链氨基酸，在食品与饲料行业应用广泛。微生物细胞工厂是生产L-亮氨酸的可行途径，但复杂的调控网络和NADPH高需求限制了产量提升。本研究对大肠杆菌进行多模块代谢工程改造，通过优化丙酮酸与乙酰辅酶A前体供给、重定向碳流、动态调控NADPH水平等策略，最终在5-L补料分批发酵中22小时内实现75.77 g/L的L-亮氨酸产量，产率达0.37 g/g葡萄糖，生产强度3.44 g/L/h，为目前大肠杆菌中报道的最高水平。
研究背景
支链氨基酸（BCAAs）是细胞内重要的氮供体，参与多种非必需氨基酸、核苷酸和多胺的合成，同时为其他生物分子提供碳源。L-亮氨酸在调节肌肉合成代谢、脂质代谢、能量稳态及促进蛋白质合成方面发挥关键生理作用，在食品、化妆品、饲料添加剂及制药等行业具有广阔应用前景。微生物发酵合成氨基酸契合碳中和与绿色制造趋势，同时满足医药和膳食补充剂等下游领域对高纯度产品的需求。过去十年间，大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌是L-亮氨酸生物生产的两大主要平台。尽管已有代谢工程研究提高了L-亮氨酸产量，如重定向L-丙氨酸合成的竞争性代谢流、阻断丙酮酸分流至旁路途径等，但复杂的调控网络与NADPH高需求仍制约产量进一步提升。
研究方法
2.1 菌株与质粒
以大肠杆菌W3110为亲本菌株构建L-亮氨酸生产菌株。所用菌株、质粒及引物列于附表S1和S2。质粒构建采用pTOPO载体与所需DNA片段组装，随后转化至大肠杆菌DH5α进行扩增。除特别注明外，所有化学试剂均购自国药集团化学试剂有限公司（中国上海）。质粒小提试剂盒购自Omega Bio-tek（美国）。大肠杆菌DH5α、DNA聚合酶、凝胶回收试剂盒及细菌DNA提取试剂盒均购自TransGen（中国北京）。
【数据】菌株：E. coli W3110；质粒载体：pTOPO；试剂来源：Sinopharm、Omega Bio-tek、TransGen
2.2 培养条件
大肠杆菌菌株使用Luria-Bertani（LB）培养基培养。根据需要添加琼脂糖（1.5% w/v）、卡那霉素（50 μg/mL）和链霉素（40 μg/mL）。种子培养基组成：20 g/L葡萄糖、5 g/L酵母提取物、5 g/L蛋白胨、4 g/L KH₂PO₄、5 g/L (NH₄)₂SO₄、2 g/L柠檬酸钠、2 g/L MgSO₄·7H₂O、0.04 g/L FeSO₄·7H₂O、0.03 g/L MnSO₄·4H₂O、6 g/L Na₂HPO₄、0.02 g/L VB混合物、0.002 g/L微量元素、0.5 g/L蛋氨酸、0.5 g/L谷氨酸钠、0.05 g/L异亮氨酸、0.05 g/L苏氨酸、0.05 g/L赖氨酸、0.05 g/L天冬氨酸。发酵培养基组成：20 g/L葡萄糖、2 g/L酵母提取物、2 g/L柠檬酸盐、1 g/L MgSO₄·7H₂O、7 g/L KH₂PO₄、3 g/L (NH₄)₂SO₄、1 g/L L-蛋氨酸、0.02 g/L VB混合物。pH通过pH电极监测，用NH₄OH（25%，V/V）维持在7.0。
【数据】LB培养基；琼脂糖：1.5% w/v；卡那霉素：50 μg/mL；链霉素：40 μg/mL；种子培养基葡萄糖：20 g/L；发酵培养基葡萄糖：20 g/L；pH：7.0
2.3 基于CRISPR/Cas9系统的基因组编辑
基因组修饰采用基于双质粒pCas9和pTargetF的CRISPR/Cas9系统，方法如前所述（Li et al., 2023）。gRNA序列使用在线工具（rgenome.net/cas-designer/）设计。将含有20 bp靶向特异性基因的pTargetF工程质粒和供体DNA片段电转化至菌株中。电转化细胞在添加10 mM L-阿拉伯糖的LB培养基中、30°C培养2小时以诱导λ-Red重组酶。随后，转化子在LB琼脂平板上30°C培养24-36小时。阳性克隆通过DNA测序确认。为消除pTargetF质粒，将正确转化子接种于含4 mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）的LB培养基中，30°C培养16小时。最后，为消除pCas9质粒，转化子在LB培养基中42°C培养16小时。
【数据】L-阿拉伯糖：10 mM；温度：30°C；时间：2h（诱导）、24-36h（平板培养）、16h（质粒消除）；IPTG：4 mM；温度：42°C（pCas9消除）
2.4 摇瓶发酵
种子制备：工程菌株在LB琼脂平板上37°C活化8小时。活化菌落接种至30 mL LB培养基中，37°C培养16小时。一级种子以10%（V/V）接种量转接至250 mL带挡板锥形瓶中的20 mL种子培养基，37°C、220 rpm培养8小时。随后，二级种子培养物以10%（V/V）接种量转接至500 mL带挡板锥形瓶中的30 mL发酵培养基。发酵在37°C、220 rpm条件下进行24小时。
【数据】接种量：10%（V/V）；种子培养基体积：20 mL；发酵培养基体积：30 mL；温度：37°C；转速：220 rpm；时间：8h（二级种子）、24h（发酵）
2.5 5 L生物反应器补料分批发酵
补料分批发酵在5-L生物反应器中进行，工作体积为3 L。补料分批发酵的种子活化方法与摇瓶培养相同。一级种子以10%（V/V）接种量转接至500 mL带挡板锥形瓶中的80 mL种子培养基，37°C、220 rpm培养8小时。随后，二级种子培养物以10%（V/V）接种量转接至5-L生物反应器。pH通过pH电极监测，用NH₄OH（25%，V/V）维持在7.0。溶解氧（DO）通过DO电极监测并控制在30%。
【数据】反应器：5-L生物反应器；工作体积：3 L；种子培养基体积：80 mL；接种量：10%（V/V）；pH：7.0；DO：30%；温度：37°C；转速：220 rpm
2.6 定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）分析
使用FreeZol Reagent（Vazyme，中国南京）提取细胞总RNA。逆转录PCR使用PrimeScript RT reagent Mix（TaKaRa，中国北京）进行。定量PCR使用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）试剂盒（TIANGEN，中国北京）进行，程序设定如下：95°C 5分钟激活，40个循环的95°C 15秒和60°C 1分钟。以16S rRNA作为内参。相对mRNA水平根据2^(−ΔΔCT)方法计算。
【数据】qRT-PCR程序：95°C 5min；40个循环（95°C 15s，60°C 1min）；内参基因：16S rRNA；分析方法：2^(−ΔΔCT)
2.7 荧光强度测定
菌株在LB琼脂平板上37°C活化8小时，转接至LB培养基中37°C过夜培养。收集培养物，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤并重悬后，测定荧光强度和600 nm处吸光度（OD600）。绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）的荧光强度使用spectraMax微板读取器（Molecular Devices，中国上海）在激发/发射波长485 nm/525 nm和575 nm/620 nm处测定。
【数据】GFP激发/发射波长：485/525 nm；RFP激发/发射波长：575/620 nm；仪器：spectraMax微板读取器
2.8 分析方法
代谢物分析：发酵液以12,000 rpm离心10分钟，上清液收集至EP管中，用0.22 μm尼龙滤膜过滤两次。游离氨基酸检测：发酵罐和摇瓶样品分别稀释2000倍和200倍。游离氨基酸使用氨基酸分析仪（Sykam，德国）定量，配备LCA K06/Na色谱柱（4.6 × 150 mm），以茚三酮为流动相。有机酸和糖使用高效液相色谱（HPLC）（Thermo Fisher Scientific，美国）分析，配备C18色谱柱（4.6 × 250 mm），流动相为98%的0.05% H₂SO₄和2%乙腈。使用紫外分光光度计（Shimadzu，日本）在600 nm（OD600）监测细胞生长。胞内NADPH/NADP⁺浓度使用Enhanced NADP⁺/NADPH Assay Kit（WST-8）（Beyotime，中国上海）测定。对于静态调控的大肠杆菌，在菌株生长至指数期时收集细胞；对于动态调控的大肠杆菌，每4小时收集细胞。收集的细胞通过离心收获，然后在室温裂解10分钟进行进一步分析。L-亮氨酸产率基于5-L生物反应器中L-亮氨酸产生量与葡萄糖消耗量的质量比计算。具体而言，产生的L-亮氨酸质量通过终点L-亮氨酸浓度乘以终点体积再减去初始L-亮氨酸质量确定。消耗的葡萄糖质量通过初始葡萄糖质量加上补料葡萄糖质量再减去残余葡萄糖质量获得。
【数据】离心：12,000 rpm，10min；滤膜：0.22 μm尼龙膜；稀释倍数：发酵罐2000倍、摇瓶200倍；氨基酸分析柱：LCA K06/Na（4.6×150mm）；HPLC柱：C18（4.6×250mm）；流动相：98% 0.05% H₂SO₄ + 2%乙腈；NADPH/NADP⁺试剂盒：WST-8法
2.9 统计分析
本研究所有实验均重复三次以确保生物学一致性。误差线代表标准偏差（n = 3）。∗/∗∗/∗∗∗表示统计显著性。图表使用Adobe Illustrator和GraphPad Prism 10.0生成。
【数据】重复次数：3次；误差线：标准偏差（n=3）；显著性标记：∗/∗∗/∗∗∗
研究结果
3.1 增强乙酰辅酶A供给促进L-亮氨酸生物合成
首先，在大肠杆菌W3110 ΔlacI中表达乙酰羟酸合酶（AHAS）和α-异丙基苹果酸合酶（IPMS）的反馈抑制抗性突变体，并改造L-亮氨酸转运系统，构建了亮氨酸生产菌株L9。在大肠杆菌中，乙酰辅酶A是亮氨酸合成的前体。乙酰辅酶A通过中心代谢途径产生，为细胞生长和代谢提供能量和底物。然而，内源乙酰辅酶A合成途径伴随CO₂释放，导致大量碳损失。非氧化糖酵解途径（NOG途径）为葡萄糖代谢提供了替代方案，能够在无CO₂排放的情况下将磷酸化葡萄糖转化为乙酰辅酶A，从而提高中心碳得率。然而，NOG途径与磷酸戊糖途径竞争木酮糖-5-磷酸，与糖酵解竞争果糖-6-磷酸。
为研究不同NOG途径通量对L-亮氨酸合成和菌株生长的影响，我们将由P102或P110启动子驱动的fpkt基因整合至菌株L9的gapC位点，构建了菌株L10和L11。与L9（4.06 g/L，OD600为24.50）相比，L10和L11的L-亮氨酸产量分别提高了16%和11%，而其OD600分别下降了8%和4%。虽然L10和L11中未观察到乙酰辅酶A积累，但与L9相比乙酸盐浓度增加，表明乙酰辅酶A通量增加。这些结果表明NOG途径增强了乙酰辅酶A的可利用性，从而提高了L-亮氨酸产量，尽管对生长有一定损害。然而，在L10中敲除ackA（编码乙酸激酶）并过表达pta（编码磷酸转乙酰酶）以将NOG途径产物乙酰磷酸导向乙酰辅酶A而非乙酸，对L-亮氨酸生产影响甚微。推测这可能是因为天然pta的转录活性足以将乙酰磷酸转化为乙酰辅酶A，或细胞内丙酮酸与乙酰辅酶A的比例不适当。
乙酰辅酶A是三羧酸（TCA）循环的关键底物，从而限制L-亮氨酸生产。由于L-亮氨酸生物合成部分与生长偶联，TCA循环的静态调控可能造成代谢负担。因此，基于启动子响应胞内代谢物或生长阶段的动态调控策略将有助于构建高产菌株。P leuABCD启动子的转录受L-亮氨酸浓度抑制。我们将菌株L12中gltA（编码柠檬酸合酶）的启动子替换为P leuABCD以及生长依赖型启动子P fliA、P fliC和P flgC，分别构建了菌株L13至L16。与菌株L12相比，菌株L13（P leuABCD-gltA）的L-亮氨酸产量降低42%，OD600降低13%。这表明在P leuABCD启动子控制下的TCA循环通量可能不足以维持细胞生长，最终损害了L-亮氨酸的生产力。菌株L16（P fliA-gltA）意外地表现出L-亮氨酸产量（1.06 g/L）和OD600（4.72）的严重下降，这可能是由于P fliA启动子在稳定期的转录活性过低所致。L14和L15分别产生5.34 g/L和5.25 g/L的L-亮氨酸，比菌株L12分别提高11%和9%。qRT-PCR分析显示，与L12相比，生长依赖型启动子P fliC和P flgC在菌株L14和L15中动态下调gltA表达。然而，观察到菌株L14和L15在8-16小时期间的OD600低于L12。这一策略可能影响细胞生长性能，因为柠檬酸合酶催化乙酰辅酶A进入TCA循环的起始反应。
随后评估了菌株L14和L15在5 L生物反应器中的发酵和生长性能。结果显示，两株菌在高密度培养时均表现出明显的生长缺陷，尽管在发酵早期阶段其生长似乎相对正常。推测P fliC和P flgC启动子驱动的TCA循环通量仍不足以在高密度发酵条件下维持正常细胞生长。当柠檬酸浓度增加至3 g/L以消除TCA循环减弱的影响时，L14和L15的L-亮氨酸产量和OD600仍然较低。推测该结果可能源于生物合成前体如α-酮戊二酸以及包括核苷酸在内的基础大分子的缺乏。
前期研究表明，通过sucAB动态调控TCA循环——sucAB编码α-酮戊二酸脱氢酶，催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶A，为谷氨酸家族氨基酸的细胞合成提供基础前体——可将代谢流从细胞生长重定向至产物合成途径。当sucAB下调时，必需前体可通过乙醛酸循环等补偿途径合成。因此，我们将L12中P sucAB替换为P fliC、P flgC和P fliA以动态下调TCA循环，获得L17、L18和L19。摇瓶发酵中，L17和L18分别产生5.22 g/L和5.12 g/L的L-亮氨酸，比L12分别高8%和6%。L17和L18的OD600分别达到22.54和23.20，与L12相当。相比之下，L19仅产生1.99 g/L的L-亮氨酸，OD600为5.43。L17和L18在5 L生物反应器中未表现出生长抑制，最大OD600分别为58.76和59.62，分别产生26.96 g/L和28.72 g/L的L-亮氨酸。与L12（18.09 g/L L-亮氨酸）相比，L17和L18的L-亮氨酸产量分别提高了49%和58%。此外，qRT-PCR显示菌株L17和L18中sucAB被动态下调。这些结果表明下调sucAB是实现L-亮氨酸合成与细胞生长之间平衡的可行策略。
【数据】L9产量：4.06 g/L，OD600：24.50；L10/L11产量提升：16%/11%；L10/L11 OD600下降：8%/4%；L13产量下降：42%，OD600下降：13%；L16产量：1.06 g/L，OD600：4.72；L14/L15产量：5.34/5.25 g/L（比L12提高11%/9%）；L17/L18产量：5.22/5.12 g/L（比L12高8%/6%）；L17/L18 OD600：22.54/23.20；L19产量：1.99 g/L，OD600：5.43；5L发酵L17/L18最大OD600：58.76/59.62；5L发酵L17/L18产量：26.96/28.72 g/L；L12在5L发酵中产量：18.09 g/L；L17/L18产量提升：49%/58%；柠檬酸补充：3 g/L
3.2 丙酮酸调控对L-亮氨酸合成的影响
丙酮酸是L-亮氨酸合成的另一个关键前体，其胞内浓度不仅影响L-亮氨酸产量，还影响细胞生长。为丰富丙酮酸池，在L18中敲除poxB和ldhA基因，构建菌株L21，产L-亮氨酸5.30 g/L。与菌株L18相比，L21的乙酸盐含量和乳酸盐含量分别降低62%和68%。随后，将L21中pykA和pykF基因（编码丙酮酸激酶Ⅰ、Ⅱ，催化丙酮酸合成）的天然启动子替换为P trc，构建菌株L22和L23。L22和L23分别产生5.99 g/L和5.67 g/L的L-亮氨酸，比菌株L21分别提高13%和7%。这表明过表达pykA对提高L-亮氨酸产量的效果比过表达pykF更为显著。进一步将一份pykA拷贝整合至菌株L22的glpR位点，L-亮氨酸产量提高4%，达到6.24 g/L。为在低葡萄糖发酵条件下最大化利用内源丙酮酸用于L-亮氨酸合成，在菌株L24中对编码丙酮酸转运蛋白（属于碳饥饿反应蛋白）的yhjX和cstA基因进行了过表达和敲除操作。过表达cstA（菌株...
【数据】L21产量：5.30 g/L；L21乙酸盐降低：62%；L21乳酸盐降低：68%；L22产量：5.99 g/L（比L21提高13%）；L23产量：5.67 g/L（比L21提高7%）；L22额外整合pykA后产量：6.24 g/L（提高4%）
3.3 调控葡萄糖利用促进L-亮氨酸生产
（原文此节内容未在节选中完整呈现）
【数据】原文未详述
3.4 强化NADPH供给提高L-亮氨酸产量
（原文此节内容未在节选中完整呈现）
【数据】原文未详述
3.5 动态调控zwf对L-亮氨酸生产的影响
（原文此节内容未在节选中完整呈现）
【数据】原文未详述
3.6 5 L生物反应器补料分批发酵
（原文此节内容未在节选中完整呈现）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究通过多模块代谢工程系统改造大肠杆菌L-亮氨酸生物合成途径，成功构建了具有操作稳健性的高效细胞工厂。以葡萄糖为底物，实现了迄今最高的L-亮氨酸产量（75.77 g/L）和生产强度（3.44 g/L/h）。这些结果凸显了多模块代谢工程在L-亮氨酸及相关氨基酸工业化生物合成中的实用性，进一步证明确保前体和辅因子的适当供给是提高目标产物生物合成的关键策略。未来研究可开发动态调控和可逆的时空控制系统，以实现对合成途径中关键酶表达节点的精准调控。
编译者解读
该研究最值得借鉴之处在于"模块化"改造思路——将复杂的L-亮氨酸合成路径拆解为前体供给、碳流分配、辅因子再生等独立模块逐一优化，并采用动态调控策略避免生长与产酸之间的矛盾。5-L规模发酵中75.77 g/L的产量在大肠杆菌平台具有里程碑意义。不过，高产菌株对高密度发酵条件的敏感性提示，从实验室规模到工业化放大仍需解决代谢稳健性问题。此外，NOG途径与动态启动子组合的策略也可为其他氨基酸或萜类化合物的生产提供参考模板。
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.109514