来源：Methanol valorization into glycerol by engineering Bacillus methanolicus with thermostable enzymes and a tunable promoter library（Journal of Bioscience and Bioengineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
甘油是重要的C3平台化合物，广泛应用于制药、日化、食品等领域。本研究以嗜热甲基营养菌 Bacillus methanolicus 为底盘细胞，引入源自嗜热菌的耐热甘油-3-磷酸脱氢酶（GPD）和甘油-3-磷酸磷酸酶（GPP），并开发了包含100个变体的合成启动子文库，成功实现了以甲醇为唯一碳源的甘油生物合成。最终工程菌株在摇瓶和生物反应器中分别达到0.62 g/L和8.9 g/L的甘油产量，为甲醇经由甘油中间体合成高值化学品奠定了基础。
研究背景
甘油作为多功能C3平台化合物，在医药、个人护理、食品、化妆品等领域应用广泛，同时也是生产高附加值化学品、燃料和材料的可再生原料。甲醇可从CO₂、生物质和沼气等可持续资源获得，为甘油生产提供了绿色路径。然而，传统中温来源的甘油合成途径酶在高温下极不稳定，严重制约了嗜热微生物细胞工厂的开发。本研究选用嗜热甲基营养菌 B. methanolicus 作为底盘，通过引入耐热酶和精细调控异源途径表达，探索甲醇向甘油生物转化的可行性。
研究方法
菌株与培养条件
本研究所用菌株列于原文表1。质粒克隆和酶表达使用 E. coli DH5α 和 BL21(DE3) 菌株，于37°C在Luria–Bertani（LB）培养基中好氧培养。根据需要向培养基中添加氯霉素（20 μg/mL）、卡那霉素（50 μg/mL）或氨苄青霉素（100 μg/mL）。B. methanolicus MGA3 及其衍生菌株于50°C在TSB培养基或极限培养基中好氧培养。以甲醇（250 mM）作为碳源加入极限培养基，必要时添加氯霉素（5 μg/mL）。
【数据】菌株：E. coli DH5α、BL21(DE3)；培养温度：37°C；培养基：LB；抗生素：氯霉素20 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、氨苄青霉素100 μg/mL；B. methanolicus MGA3培养温度：50°C；培养基：TSB或极限培养基；碳源：甲醇250 mM；氯霉素5 μg/mL
质粒构建
本研究所用质粒和引物分别详列于原文表S1和表S2。质粒构建通过 ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit（Vazyme，南京）进行重组。高保真DNA聚合酶和DNA标记购自TransGen Biotech（北京）。限制性内切酶购自Thermo Scientific（上海）。DNA纯化试剂盒、质粒小提试剂盒和基因组DNA提取试剂盒购自Tiangen Biotech（北京）。DNA合成和测序服务由Tsingke Biotech（北京）提供。完整质粒构建流程详见原文表S3。
【数据】试剂盒：ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit；DNA聚合酶来源：TransGen Biotech；限制酶来源：Thermo Scientific；试剂盒来源：Tiangen Biotech；测序服务：Tsingke Biotech
异源酶表达与纯化
B. methanolicus MGA3（Bm）和 Parageobacillus thermoglucosidasius DSM 2542（Pth）来源的 gpd_Bm、gpp_Bm、gpd_Pth、gpp_Pth 基因使用表S2所列引物从基因组DNA扩增获得。基因与经 NdeI 和 XhoI 酶切的 pET-21a 载体连接。融合C-His标签的基因在 E. coli BL21(DE3) 中表达，以0.1 mM异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（IPTG）于16°C诱导。异源酶使用 His Spin Trap 柱（GE Healthcare，芝加哥，IL，美国）纯化。蛋白浓度使用 Improved Bradford Protein Concentration Assay Kit（Sangon Biotech，上海）测定。纯化蛋白经15% SurePAGE凝胶（GenScript，南京）分析。
【数据】诱导剂：IPTG 0.1 mM；诱导温度：16°C；纯化柱：His Spin Trap；蛋白定量试剂盒：Improved Bradford Protein Concentration Assay Kit；凝胶：15% SurePAGE
酶活性测定
GPD活性通过分光光度法于340 nm、50°C下测定，依据先前方法修改后进行，检测反向反应中底物依赖性NADH形成的初始速率。反应混合物含100 mM HEPES-NaOH、1 mM DHAP、0.2 mM NADH，以及适量酶溶液，pH 7.0，终体积200 μL。酶活性单位（U）定义为每分钟产生1 μmol NADH所需的酶量。
GPP活性通过测定50°C下磷酸盐形成量来确定，依据先前方法修改进行。200 μL反应体系含100 mM Tris–HCl、1 mM DTT、5 mM MgCl₂、5 mM G3P和50 μL酶溶液，pH 7.0。孵育5分钟后，加入50 μL 6 M HCl终止反应，混合物置于冰上。在磷酸盐测定前，加入50 μL 6 M NaOH将pH调至7.4。游离磷酸盐含量使用钼蓝比色法测定。酶活性单位（U）定义为每分钟释放1 μmol磷酸盐所需的酶量。
为确定纯化GPD和GPP的动力学参数，DHAP和G3P浓度分别在0.2–4 mM和1–20 mM范围内变化。不同底物浓度下的活性测定数据使用GraphPad Prism 6.0软件酶动力学包进行非线性回归，拟合Michaelis–Menten方程，直接计算V_max和K_m。
为评估GPD和GPP的热稳定性，纯化酶在50°C下孵育。离心去除上清后，取适量酶溶液加入反应混合物。在不同时间点测定残余酶活性以研究酶的热稳定性。
酶的最适pH通过在不同缓冲液体系中测定活性来确定：pH 4.0–6.0使用醋酸钠缓冲液，pH 6.0–8.0使用HEPES-NaOH缓冲液，pH 8.0–10.0使用甘氨酸-NaOH缓冲液。
为研究金属离子对酶活性的影响，向测定体系中加入终浓度5 mM的各种金属离子。无金属离子时测定的活性定义为100%。所有酶活性实验均进行三次重复。
【数据】GPD测定波长：340 nm；温度：50°C；底物：DHAP 1 mM、NADH 0.2 mM；缓冲液：HEPES-NaOH 100 mM，pH 7.0；反应体积：200 μL；GPP底物：G3P 5 mM、MgCl₂ 5 mM、DTT 1 mM；Tris–HCl 100 mM，pH 7.0；反应时间：5 min；终止液：6 M HCl 50 μL；中和液：6 M NaOH 50 μL；pH调至7.4；动力学底物范围：DHAP 0.2–4 mM、G3P 1–20 mM；热稳定性孵育温度：50°C；pH范围：4.0–10.0；金属离子浓度：5 mM；重复次数：3次
合成启动子文库的构建与评估
采用荧光报告蛋白超折叠绿色荧光蛋白（sfGFP）评估启动子强度。由P_mdh或P_hps启动子调控的 sfgfp 表达盒被组装到pNW33N质粒（GenBank: AY237122.1）中。重组质粒转化至 B. methanolicus，转化子在含甲醇为碳源的极限培养基的24孔板中接种。培养在50°C、800 rpm振荡条件下进行。定期收集样品，使用 Infinite E Plex 酶标仪测定OD600和sfGFP荧光强度。
B. methanolicus 感受态细胞制备和DNA电转化按照优化方案进行。为构建P_hps启动子文库，在−35区（TTTTTA）、−10区（TATATT）和/或相邻区域引入随机突变。从 B. methanolicus 基因组DNA扩增 hps 基因上游275 bp（P_hps启动子）。启动子与sfGFP报告基因及pNW33N质粒连接，构建重组质粒pNW33N-P_hps-sfGFP用于文库构建。以该质粒为模板，使用含简并碱基的引物通过PCR构建启动子文库。PCR产物连接并转化至 E. coli，收集所有转化子提取质粒。质粒文库电穿孔导入 B. methanolicus。随机挑取单菌落接种于含TSB培养基的24孔板，800 rpm振荡培养10小时。该培养物作为种子，以初始OD600为0.1接种至含甲醇为碳源的极限培养基的24孔板。培养在50°C、800 rpm振荡条件下进行。定期收集样品，使用 Infinite E Plex 酶标仪测定OD600和sfGFP荧光强度。选定的启动子变体汇总于原文表S4。
【数据】启动子文库靶区域：−35区（TTTTTA）、−10区（TATATT）及相邻区域；P_hps扩增长度：275 bp；种子培养时间：10 h；初始OD600：0.1；培养温度：50°C；振荡转速：800 rpm；检测仪器：Infinite E Plex酶标仪
B. methanolicus 发酵生产甘油
摇瓶甘油生产实验中，B. methanolicus 及其衍生菌株在含50 mL TSB培养基的500 mL摇瓶中培养。该培养物作为种子，接种至含甲醇（250 mM）为唯一碳源的50 mL极限培养基中（500 mL摇瓶）。菌株在220 rpm、50°C条件下振荡培养。定期收集样品，测定OD600、甲醇浓度、pH和甘油滴度。通过添加NH₃·H₂O将pH调节至约7.0。
补料分批发酵在7 L生物反应器（TJX Bioengineering LLC，上海）中进行，使用UMN1培养基，含4.09 g/L K₂HPO₄、1.30 g/L NaH₂PO₄、2.11 g/L (NH₄)₂SO₄、0.25 g/L酵母提取物、6 mg/L d-生物素、0.01 mg/L维生素B12、1 mM MgSO₄、1 mL/L浓缩金属溶液和150 mM甲醇。种子培养使用含甲醇（250 mM）为碳源的极限培养基在摇瓶中制备，然后以10%接种量接种至含2.7 L发酵培养基的7 L生物反应器中。培养温度维持在50°C，通过添加NH₄OH自动控制pH为6.5。溶解氧通过自动调节搅拌速度维持在30%。
【数据】摇瓶发酵：500 mL摇瓶含50 mL TSB或极限培养基；甲醇浓度：250 mM；转速：220 rpm；温度：50°C；pH调节：NH₃·H₂O调至约7.0；反应器：7 L；培养基：UMN1（K₂HPO₄ 4.09 g/L、NaH₂PO₄ 1.30 g/L、(NH₄)₂SO₄ 2.11 g/L、酵母提取物0.25 g/L、d-生物素6 mg/L、维生素B12 0.01 mg/L、MgSO₄ 1 mM、浓缩金属溶液1 mL/L、甲醇150 mM）；接种量：10%；工作体积：2.7 L；温度：50°C；pH：6.5（NH₄OH自动控制）；溶解氧：30%
研究结果
推定耐热GPD和GPP直系同源物的鉴定
DHAP是 B. methanolicus 甲醇同化的关键代谢物。研究假设引入功能性GPD和GPP酶可在该宿主中建立从甲醇到甘油的完整生物合成途径。然而，来自中温酵母 S. cerevisiae 的GPD_Sc和GPP_Sc在 B. methanolicus 最适生长温度下极不稳定，在50°C下半衰期分别仅为2.5分钟和6.0分钟（图S1）。这种严重的热不稳定性凸显了寻找稳健替代酶的必要性。
尽管野生型 B. methanolicus 天然不产生甘油，但以 S. cerevisiae 的GPD_Sc和GPP_Sc为查询序列进行计算机分析，在其基因组中发现了推定内源同源物，命名为GPD_Bm和GPP_Bm。GPD_Bm与GPD_Sc、GPP_Bm与GPP_Sc之间的序列一致性分别为30%和27%（图1B和C）。此外，在嗜热菌 P. thermoglucosidasius 基因组中鉴定到推定同源物GPD_Pth和GPP_Pth。序列比对表明，GPD_Pth与GPD_Sc和GPD_Bm分别具有28%和74%的相似性。类似地，GPP_Pth与GPP_Sc和GPP_Bm分别具有35%和63%的相似性（图1B和C）。值得注意的是，甘油也不是野生型 P. thermoglucosidasius 的天然产物。
比较序列分析显示，GPD_Bm和GPD_Pth均含有典型的GXGXXG基序（图1B），这是所有已知NAD依赖性GPD中保守的NAD结合Rossmann折叠结构域的标志。通过将序列映射到已解析的人源GPD1与DHAP和NAD⁺结合的三元复合物结构上，发现负责底物配位的关键催化残基在GPD_Bm和GPD_Pth中大部分保守。这包括在催化机制中充当通用碱基的关键天冬氨酸残基（图1B中的D260）。然而，在 S. cerevisiae 和人源酶中稳定DHAP磷酸基团的精氨酸残基（图1B中的R269）在GPD_Bm和GPD_Pth中均被组氨酸（图1B中的H269）取代。
同样，GPP序列分析参考了 Mycobacterium tuberculosis GPP同源物的已报道结构。对Mg²⁺配位至关重要的三个天冬氨酸残基（图1C中的D14、D16和D209）——Mg²⁺是磷酸酶活性所必需的二价金属离子——在GPP_Sc、GPP_Bm和GPP_Pth中均保守。此外，参与底物结合的其他残基，特别是V152和P157，在这三种酶中也是保守的（图1C）。
鉴于这些推定酶来自嗜热宿主，但其在甘油生物合成中的具体作用尚未确认，研究进一步异源表达并纯化这些蛋白以表征其酶活性和生化特性。四种蛋白在 E. coli 中表达后均主要存在于可溶部分（图2A）。粗酶提取物的初始活性筛选显示，GPD_Bm缺乏可检测的DHAP还原活性，而GPD_Pth具有催化活性。GPP_Bm和GPP_Pth均表现出对G3P的磷酸酶活性（图2B）。因此，GPD_Bm被排除在进一步分析之外，三种活性酶GPD_Pth、GPP_Bm和GPP_Pth被纯化用于详细的生化表征（图2A）。
【数据】GPD_Sc半衰期：50°C下2.5 min；GPP_Sc半衰期：50°C下6.0 min；GPD_Bm与GPD_Sc序列一致性：30%；GPP_Bm与GPP_Sc序列一致性：27%；GPD_Pth与GPD_Sc相似性：28%；GPD_Pth与GPD_Bm相似性：74%；GPP_Pth与GPP_Sc相似性：35%；GPP_Pth与GPP_Bm相似性：63%；关键残基：D260（催化通用碱基）、R269→H269（DHAP磷酸基团稳定残基取代）、D14/D16/D209（Mg²⁺配位）、V152/P157（底物结合）
耐热GPD和GPP直系同源物的酶学特性
动力学分析表明，GPD_Pth对其底物DHAP具有高亲和力，K_m为97 μM（图2C）。DHAP还原的催化效率（k_cat/K_m）为177.26 min⁻¹ mM⁻¹，k_cat为17.24 min⁻¹。对于磷酸酶，GPP_Bm对G3P的亲和力（K_m = 6.66 mM）高于GPP_Pth（K_m = 11.79 mM）。然而，GPP_Pth表现出显著更高的催化能力，其转换数（k_cat）为571.36 min⁻¹，是GPP_Bm（190.14 min⁻¹）的3倍。因此，GPP_Pth的催化效率（k_cat/K_m = 48.46 min⁻¹ mM⁻¹）是GPP_Bm（28.54 min⁻¹ mM⁻¹）的1.7倍（图2C）。
随后对纯化的GPD_Pth、GPP_Bm和GPP_Pth进行了系统的酶学性质分析。三种酶的温度最适均在50°C或以上（图3A），与其嗜热来源一致。值得注意的是，它们在该温度下表现出显著增强的热稳定性。50°C下半衰期测定为：GPD_Pth 7.7小时、GPP_Bm 2小时、GPP_Pth 5.3小时（图3B），分别较 S. cerevisiae 中温直系同源物提高185倍、20倍和53倍。这明确证实了其优越的热耐受性。
pH依赖性分析显示，GPD_Pth的最适pH为5.0，而GPP_Bm和GPP_Pth均在pH 6.0时表现出峰值活性（图3C）。此外，研究评估了各种金属离子对酶活性的影响（图3D）。GPD_Pth的活性易受多种离子抑制，包括Ni²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺和WO₄²⁻。相比之下，GPP_Bm的活性在大多数测试离子存在下基本不受影响，唯WO₄²⁻造成约25%的抑制。有趣的是，GPP_Pth表现出独特的激活特征，其活性在Mg²⁺、Cu²⁺和Ca²⁺等二价阳离子存在下显著增强（提高156–225%）。其活性也被WO₄²⁻抑制至40%（图3D）。
【数据】GPD_Pth对DHAP的K_m：97 μM；k_cat：17.24 min⁻¹；k_cat/K_m：177.26 min⁻¹ mM⁻¹；GPP_Bm对G3P的K_m：6.66 mM；k_cat：190.14 min⁻¹；k_cat/K_m：28.54 min⁻¹ mM⁻¹；GPP_Pth对G3P的K_m：11.79 mM；k_cat：571.36 min⁻¹；k_cat/K_m：48.46 min⁻¹ mM⁻¹；50°C半衰期：GPD_Pth 7.7 h、GPP_Bm 2 h、GPP_Pth 5.3 h；较中温酶提高倍数：185倍、20倍、53倍；最适pH：GPD_Pth 5.0、GPP_Bm和GPP_Pth 6.0；GPP_Pth在Mg²⁺/Cu²⁺/Ca²⁺存在下活性增强156–225%；WO₄²⁻对GPP_Bm抑制约25%、对GPP_Pth抑制至40%
合成P_hps启动子文库的开发
来自内源多拷贝质粒pBM19的甲醇脱氢酶基因启动子（P_mdh）是 B. methanolicus 代谢工程中最常用的启动子。转录组分析表明，编码甲醛同化酶3-己酮糖-6-磷酸合酶（Hps）和6-磷酸-3-己酮糖异构酶（Phi）的染色体操纵子组成型表达，且具有细胞内最高的mRNA水平之一。这促使研究假设其天然启动子P_hps可作为适合构建梯度强度文库的强组成型启动子。
使用pNW33N质粒以sfGFP为报告基因评估了P_mdh和P_hps的强度。结果证实P_hps是显著更强的启动子，其荧光强度比P_mdh高约8.1倍（图4A）。这一发现与先前研究一致——先前研究推测P_hps可能极强，因为克隆测试的尝试未成功。本研究的系统成功证明了其优越强度。
异源途径表达的精细调控通常需要不同强度的启动子，因为过强的表达可能造成代谢负担，反而不利于合成。为此，研究致力于开发宽范围启动子文库作为关键遗传资源。基于先前对 B. methanolicus 保守启动子元件的分析，研究鉴定了P_hps的−10和−35区域，并在其核心区域引入简并核苷酸以产生序列多样化（图4B）。
从超过5 × 10⁴个 B. methanolicus 转化子的文库中，首先基于平板成像的荧光强度筛选克隆。随后对约400个克隆进行液体培养测定和测序，获得100个具有宽强度范围的独特P_hps突变体（图4C）。值得注意的是，没有突变体超过野生型P_hps的强度，这凸显了其作为强效天然启动子的地位。可能强于野生型的突变体可能具有毒性，因其对细胞适应性的负面影响而在文库中代表性不足。
【数据】P_hps相对P_mdh的荧光强度倍数：约8.1倍；文库规模：>5 × 10⁴转化子；测序克隆数：约400个；获得独特突变体数：100个
利用P_hps启动子变体优化GPDPth和GPPPth表达用于甲醇生产甘油
基于上述启动子文库，研究选择了不同强度的启动子变体来优化耐热酶GPD_Pth和GPP_Pth在 B. methanolicus 中的表达。利用内源性质粒pBM19作为稳定表达载体，构建了不依赖抗生素且不含外源质粒的工程菌株。摇瓶发酵结果显示，工程菌株以甲醇为唯一碳源时能够有效生产甘油。最终工程菌株在摇瓶中达到0.62 g/L的甘油滴度，在生物反应器中达到8.9 g/L。
【数据】摇瓶甘油滴度：0.62 g/L；生物反应器甘油滴度：8.9 g/L；碳源：甲醇（唯一碳源）；表达载体：内源质粒pBM19；抗生素依赖：无
讨论与解读
本研究首次报道了以甲醇为底物生产甘油。通过引入源自嗜热菌的耐热GPD和GPP酶，解决了中温酶在 B. methanolicus 最适生长温度下极不稳定的问题——50°C下半衰期较 S. cerevisiae 来源酶提高20至185倍不等。研究开发的合成P_hps启动子文库包含100个变体，强度跨越五个数量级，为异源途径的精细调控提供了丰富的遗传工具箱。利用内源质粒pBM19作为表达载体，实现了不含抗生素标记和外源质粒的工程菌株构建，最终在摇瓶和生物反应器中分别获得0.62 g/L和8.9 g/L的甘油产量。
值得注意的是，GPD_Bm虽被预测为GPD同源物且含有保守催化残基，但实际检测不到DHAP还原活性，这提示序列同源性并不一定能保证功能活性。此外，启动子文库中未发现超过野生型P_hps强度的突变体，暗示天然启动子可能已接近该位点的表达上限。
编译者解读
该研究体现了合成生物学中"酶工程+表达调控"双轮驱动的经典策略。从嗜热菌挖掘耐热酶解决热稳定性瓶颈，以天然强启动子为基础构建梯度文库实现途径表达的精细调控，方法学上具有高度可移植性。利用内源质粒pBM19作为表达载体实现无抗生素依赖，提升了菌株的工业适用性。不过，当前甘油产量（8.9 g/L）距离工业化仍有差距，后续可通过进一步优化甲醇同化途径通量、增强DHAP供给或开发更高效的补料策略来提升。该平台以甘油为中间节点，理论上可拓展至更多C3衍生化学品的甲醇合成路线，具有广阔的下游延伸空间。
参考来源
Xin, B. Methanol valorization into glycerol by engineering Bacillus methanolicus with thermostable enzymes and a tunable promoter library. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2026. DOI: 10.1016/j.jbiosc.2026.03.009
DOI: 10.1016/j.jbiosc.2026.03.009