来源：The characterization and in silico simulations analysis of ions and chemicals on the dynamics of an alkaline protease produced by Bacillus atrophaeus WML2023L1（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
碱性蛋白酶占全球工业酶市场60%以上，是洗涤、食品、制革等领域的核心生物催化剂。本研究从堆肥土壤中分离到一株高地衣芽孢杆菌WML2023L1，经优化发酵产酶达8941.46 ± 119.41 U/mL，纯化获得分子量约28 kDa的碱性蛋白酶BWLP。该酶在宽pH范围和中等温度下保持高活性与稳定性，且耐氧化条件。研究结合多尺度计算模拟，揭示了金属离子、表面活性剂、氧化剂及有机溶剂对酶结构动态与催化活性的调控机制。
研究背景
碱性蛋白酶（EC.3.4.21–24.99）因催化效率高、耐受苛刻条件、易于大规模生产，在洗涤剂、食品加工、皮革处理、生物制药和废物管理等工业领域被广泛用作关键生物催化剂。这类酶属于水解酶类，负责断裂肽键，在碱性环境中发挥最佳功能，占全球工业酶市场60%以上。微生物来源的丝氨酸蛋白酶因其产量高、易于基因操作、耐受加工变量而备受关注，其活性中心含丝氨酸残基，可被DFP或PMSF抑制；金属蛋白酶则依赖Zn²⁺、Ca²⁺等金属辅因子，被EDTA等螯合剂抑制。细菌因生长快、发酵周期短、分泌胞外酶简化下游处理，成为酶生产的优选来源。芽孢杆菌属是碱性蛋白酶生产中最具代表性的菌属，但地衣芽孢杆菌作为碱性蛋白酶生产菌株的潜力此前仅有一次报道。本研究从堆肥土壤中筛选高产碱性蛋白酶的芽孢杆菌菌株，系统优化发酵条件，纯化并表征酶学性质，结合分子动力学模拟阐明金属离子、表面活性剂、氧化剂和有机溶剂对酶活性与结构动态的影响机制。
研究方法
2.1 材料与化学品
Sephadex G-75和HiTrap SP HP购自Cytiva（美国马萨诸塞州）。蛋白胨、琼脂和酵母提取物购自Oxoid（Thermo Fisher Scientific，英国贝辛斯托克）。酪蛋白、PMSF、二硫苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇（β-ME）、1,10-菲啰啉（OP）、CTAB、DMSO、L-酪氨酸、玉米浆和牛肉浸粉由Solarbio（中国北京）提供。Blue Plus Protein Marker（14–120 kDa）购自TransGen Biotech（中国北京）。EDTA和H₂O₂购自Macklin（中国上海）。未提及的其他化学试剂均由Sinopharm（中国上海）提供。
【数据】材料来源：Cytiva、Oxoid、Solarbio、TransGen Biotech、Macklin、Sinopharm；分子量标记范围：14–120 kDa
2.2 生物学测定
产碱性蛋白酶菌株的筛选和分类学鉴定按照先前报道的方法进行[29,30]。初始产酶培养基含葡萄糖（15 g/L）、胰蛋白胨（15 g/L）、CaCl₂（0.5 g/L）、MgSO₄·7H₂O（0.5 g/L）、NaH₂PO₄（3 g/L）和Na₂HPO₄·12H₂O（15 g/L）。初始pH调至7.5，115°C灭菌30 min。随后，通过单因素实验优化产酶培养基的碳源、氮源、金属离子以及发酵参数（温度、pH、培养时间和接种量），以提高碱性蛋白酶产量。
经硫酸铵沉淀后，酶液先后通过Sephadex G-75凝胶过滤柱（1.6 × 70 cm）和HiTrap SP HP离子交换柱（5 mL）进行纯化。蛋白质用20 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.5）洗脱[31–33]。蛋白质浓度用Bradford法测定，以牛血清白蛋白（BSA）为标准。蛋白水解活性用Folin-Phenol法测定，以1% β-酪蛋白为底物，按照Yu等[34]描述的方案进行。具体操作：反应混合物含0.5 mL 1%酪蛋白（用50 mM磷酸盐缓冲液配制，−20°C保存，pH 7.5）和0.5 mL酶液。40°C孵育10 min后，加入1.0 mL 10%三氯乙酸（TCA）终止反应，离心。取0.5 mL上清液，与2.5 mL 0.4 M Na₂CO₃和0.5 mL Folin-Phenol试剂混合。混合物40°C孵育20 min，在680 nm处测定吸光度。一个蛋白酶活性单位（U）定义为在测定条件下每分钟每毫升释放1 μg酪氨酸当量所需的酶量。
【数据】培养基组分：葡萄糖15 g/L、胰蛋白胨15 g/L、CaCl₂ 0.5 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5 g/L、NaH₂PO₄ 3 g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 15 g/L；灭菌条件：115°C、30 min；初始pH：7.5；凝胶过滤柱：1.6 × 70 cm；离子交换柱：5 mL；洗脱缓冲液：20 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.5）；底物：1% β-酪蛋白；反应温度：40°C；反应时间：10 min；TCA浓度：10%；Na₂CO₃浓度：0.4 M；检测波长：680 nm；Folin-Phenol孵育：40°C、20 min
2.3 纯化碱性蛋白酶的表征
碱性蛋白酶的分子量通过SDS-PAGE估算，使用6%（w/v）浓缩胶和12%（w/v）分离胶，以Blue Plus Protein Marker（14–120 kDa）为标准[33]。反应温度对碱性蛋白酶活性的影响通过在40°C至90°C范围内进行酶活测定来确定。pH对酶活的影响分别使用0.1 mol/L Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液（pH 3–8）、0.1 mol/L Gly-NaOH缓冲液（pH 9、10）和0.1 mol/L Na₂HPO₄-NaOH缓冲液（pH 11、12）配制反应混合物。在最适温度或pH下的酶活性定义为100%（对照）。
热稳定性测定：酶在30°C至60°C范围内分别孵育0、30、60、90、120、150和180 min。pH稳定性测定：酶在pH 6至12范围内分别孵育0、60、120、180、240、300和360 min。两种情况下均以0 min的酶活性为对照（100%）。
蛋白酶抑制剂实验使用PMSF、EDTA、β-ME、DTT和OP，终浓度均为1 mM[35]。测试的金属离子包括Na⁺、K⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Ba²⁺、Al³⁺和Fe³⁺，终浓度均为10 mmol/L。表面活性剂实验将阴离子表面活性剂SDS、CTAB，非离子表面活性剂Tween 20、Tween 80和Triton X-100分别加入酶液，终浓度为1%和10%[36]。有机溶剂实验将甲醇、乙醇、乙腈、乙二醇、乙酸乙酯、丙酮、甘油、异丙醇、二氯甲烷或DMSO加入酶液，终浓度为10%和30%[30]。
各类抑制剂、金属离子、表面活性剂和有机溶剂对蛋白酶活性的影响通过将纯化酶与各化合物混合，在室温（25°C）孵育60 min后测定。过氧化氢耐受性测定：纯化蛋白酶与终浓度1%和5%的H₂O₂混合，室温放置0、10、30和60 min[37]。残余活性在最适条件下测定，以无添加剂时0 min的活性为100%计算相对百分比。
BWLP的底物特异性使用不同蛋白质底物（酪蛋白、BSA、明胶、卵清蛋白和脱脂奶粉）在标准测定条件下评估。相对活性以最高活性为100%计算。酶动力学参数以β-酪蛋白为底物，在最适条件（60°C、pH 9）下测定不同底物浓度的初始反应速率，基于Lineweaver-Burk作图计算Km和Vmax。
【数据】SDS-PAGE：6%浓缩胶/12%分离胶；温度范围：40–90°C；pH缓冲液：Na₂HPO₄-柠檬酸（pH 3–8）、Gly-NaOH（pH 9–10）、Na₂HPO₄-NaOH（pH 11–12）；热稳定性：30–60°C、0–180 min；pH稳定性：pH 6–12、0–360 min；抑制剂终浓度：1 mM；金属离子终浓度：10 mmol/L；表面活性剂终浓度：1%和10%；有机溶剂终浓度：10%和30%；添加剂孵育：25°C、60 min；H₂O₂浓度：1%和5%；H₂O₂处理时间：0、10、30、60 min；动力学测定条件：60°C、pH 9
2.4 分子建模
#### 2.4.1 碱性蛋白酶和β-酪蛋白的同源建模与结构精修
碱性蛋白酶基因按照Alei等[38]的方法从B. atrophaeus WML2023L1中克隆，对应的核苷酸和氨基酸序列见表S1。蛋白质初始三维模型使用MODELLER程序通过分子建模方法获得[39]。以序列一致性为87%的IS1插入型Pro-枯草杆菌蛋白酶E（RCSB PDB ID: 3WHI）高分辨率晶体结构作为同源建模模板[40]。所得模型通过Ramachandran图分析、DOPE评分和Verify3D结构检查评估。Ramachandran图分析显示86.4%的残基位于允许区域，13.6%位于额外允许区域，无非允许区域残基，表明预测模型具有可接受的立体化学质量，可用于后续结构和机制分析。
β-酪蛋白肽段（残基P189-D199，含Y195）根据文献选择作为代表性底物片段[41]。使用来自牛（Bos taurus）的β-酪蛋白作为底物蛋白（Uniprot数据库条目ID: P02666）[42,43]。序列分析表明β-酪蛋白是 intrinsically 柔性的多肽，直接从AlphaFold蛋白质结构数据库（AlphaFold DB ID: AF-P02666-F1）[44,45]提取β-酪蛋白的预测三维结构用于后续结构模型分析。
【数据】同源建模模板：3WHI；序列一致性：87%；Ramachandran分析：86.4%允许区域、13.6%额外允许区域、0%非允许区域；底物肽段：β-酪蛋白P189-D199（含Y195）；Uniprot ID：P02666；AlphaFold DB ID：AF-P02666-F1
#### 2.4.2 碱性蛋白酶空腔检测
碱性蛋白酶的空腔检测使用POCASA 1.1网络服务器进行[46]。所有参数保持默认设置，探针半径修改为4 Å。结构模型、表面静电势和空腔表示使用PyMOL分子图形系统（版本2.3.2）可视化[47,48]。
【数据】探针半径：4 Å；可视化软件：PyMOL 2.3.2
#### 2.4.3 蛋白质-肽段柔性对接
使用ClusPro 2.0服务器进行柔性肽段对接模拟，评估碱性蛋白酶与β-酪蛋白之间的结合模式，以活性位点（残基D120、H152、S309）指定为目标区域[49]。β-酪蛋白配体肽段在70,000个旋转姿态中采样，并在1.0 Å三维网格上围绕固定的BWLP结构平移。
【数据】对接服务器：ClusPro 2.0；活性位点残基：D120、H152、S309；采样姿态数：70,000；网格精度：1.0 Å
研究结果
3.1 生物学测定
#### 3.1.1 产碱性蛋白酶菌株的分离与鉴定
从堆肥土壤样品中分离的12株细菌菌株在脱脂奶粉平板上产生明显透明圈，表明具有胞外蛋白酶活性。其中，菌株WML2023L1表现出最高的胞外蛋白酶活性，达723.66 ± 19.47 U/mL，被选作进一步研究对象。16S rRNA基因测序显示WML2023L1与B. atrophaeus菌株P4.3（MW228448.1）的相似性为99%，如图S1A所示。粗酶测定显示，该蛋白酶在pH 8.5时达到最大活性938.82 ± 23.46 U/mL（图1A），确认其碱性性质。基于这些结果，该菌株被命名为B. atrophaeus WML2023L1（PP101439），被鉴定为碱性蛋白酶生产的候选菌株。
【数据】产酶菌株数：12株；最高胞外蛋白酶活性：723.66 ± 19.47 U/mL；16S rRNA相似性：99%；粗酶最适pH：8.5；pH 8.5下活性：938.82 ± 23.46 U/mL
#### 3.1.2 产酶培养基和发酵参数优化
为获得高产碱性蛋白酶，系统研究了培养基组成和发酵参数对蛋白酶产量的影响。在测试的各种碳源和氮源中，2%木糖（图1B和图S1B）和2%蛋白胨（图1C和图S1C）最为有效，蛋白酶产量达3906.40 ± 107.83 U/mL。此外，添加0.05% Mg²⁺和0.10% Ca²⁺不仅作为必需辅因子，还充当诱导剂，将酶产量提升至4299.50 ± 67.45 U/mL（图S1D-F）。进一步优化培养条件（温度、接种量、初始pH和培养时间），在32°C、4%接种量、初始pH 6.0和30 h培养条件下，蛋白酶产量最高达8941.46 ± 119.41 U/mL（图1D）。
【数据】最佳碳源：2%木糖；最佳氮源：2%蛋白胨；碳氮源优化产量：3906.40 ± 107.83 U/mL；Mg²⁺添加量：0.05%；Ca²⁺添加量：0.10%；金属离子优化产量：4299.50 ± 67.45 U/mL；最佳温度：32°C；最佳接种量：4%；最佳初始pH：6.0；最佳培养时间：30 h；最终产量：8941.46 ± 119.41 U/mL
#### 3.1.3 纯化
粗碱性蛋白酶首先用40%和60%（w/v）饱和度的硫酸铵沉淀，比活达10,936.31 U/mg，回收率51.78%（图2A）。随后用Sephadex G-75凝胶过滤柱以磷酸盐缓冲液（pH 7.5，20 mM）洗脱。洗脱组分中第二个蛋白峰酶活性最高，比活19,513.91 U/mg，回收率7.72%（图2B）。最后一步纯化中，部分纯化的酶经阳离子交换色谱，大部分碱性蛋白酶活性集中在第一个峰。该步骤获得最终比活27,051.15 U/mg，总回收率1.85%，纯化酶命名为BWLP（图2C）。各纯化阶段样品的SDS-PAGE分析显示单一蛋白条带，分子量约28 kDa（图S2）。
【数据】硫酸铵饱和度：40%和60%；硫酸铵沉淀比活：10,936.31 U/mg；回收率：51.78%；凝胶过滤比活：19,513.91 U/mg；回收率：7.72%；离子交换最终比活：27,051.15 U/mg；总回收率：1.85%；分子量：约28 kDa
3.2 温度、pH和抑制剂对BWLP的影响
温度对BWLP活性的影响在20至90°C范围内评估。酶在60°C时表现出最大活性7619.04 ± 29.41 U/mL（图2D）。热稳定性测试显示，BWLP在30°C和40°C孵育180 min后分别保留88.08%和76.87%的初始活性（图2E）。BWLP的最适pH通过在pH 3至12的不同缓冲液中孵育确定。BWLP在pH 6至11的宽范围内保持活性，在pH 9时观察到峰值活性（图2F）。此外，该酶表现出高pH稳定性，在pH 6至10孵育6 h后保留73.31%至82.96%的初始活性（图2G）。需要指出的是，热稳定性和pH稳定性测定在酶促反应过程相关的短期孵育时间内进行，长期储存稳定性未在本研究中评估。
各种抑制剂对BWLP活性的影响在终浓度1 mM孵育60 min后评估（图2H）。结果显示，BWLP被EDTA强烈抑制，仅保留2.01%的初始活性。在丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF存在下，仅保留10.76%的活性，表明丝氨酸残基在催化机制中起关键作用。相比之下，β-ME（96.33%）、DTT（98.56%）和OP（91.16%）的抑制作用极小，进一步支持BWLP被归类为丝氨酸蛋白酶而非巯基蛋白酶或金属蛋白酶。BWLP对β-酪蛋白表现出最高活性，对脱脂奶粉和卵清蛋白也有可检测活性，表明具有明确的底物偏好和可测量的底物灵活性（图S3）。以β-酪蛋白为底物，在最适条件（60°C、pH 9）下进行动力学分析，由Lineweaver-Burk图确定Km为13.9 mg/mL，Vmax为181.8 μg/min（图S4）。
【数据】最适温度：60°C；最大活性：7619.04 ± 29.41 U/mL；30°C孵育180 min残余活性：88.08%；40°C孵育180 min残余活性：76.87%；最适pH：9；活性pH范围：6–11；pH 6–10孵育6 h残余活性：73.31%–82.96%；EDTA处理后残余活性：2.01%；PMSF处理后残余活性：10.76%；β-ME残余活性：96.33%；DTT残余活性：98.56%；OP残余活性：91.16%；Km：13.9 mg/mL；Vmax：181.8 μg/min
3.3 BWLP对β-酪蛋白的催化机制
BWLP的基因和氨基酸序列列于表S1。如图3A所示，BWLP具有钙结合蛋白酶的关键结构特征，包括两个不同的Ca²⁺结合位点——一个高亲和力、一个低亲和力——位于蛋白质的相对两侧。催化区域位于浅沟槽内，经典的丝氨酸蛋白酶三联体D120、H152和S309位于催化中心底部。S309提供催化所必需的亲核羟基，特别针对富含酪氨酸的底物（如β-酪蛋白）。两个表面暴露的环状区域（残基K182-Y201和S213-S220）位于催化沟槽两侧，参与底物识别。
为研究底物结合特异性，研究聚焦于β-酪蛋白来源的含酪氨酸肽段（残基P189-D199），该肽段含四个酪氨酸残基（Y75、Y129、Y195和Y208）。含Y195的截短肽段被对接至BWLP以检查结合模式（图3B）。分子对接显示高度互补的几何匹配，Y195深插入催化口袋，与酶形成稳定复合物（图3C）。酪氨酸结合位点的详细结构分析揭示了由15个残基（D120、H152、S213、L214、G215、G216、P217、A240、G242、N243、S244、V253、G254、T308和S309）组成的相互作用网络（图3D）。酪氨酸的锚定主要通过疏水相互作用和极性氢键介导。酪氨酸的苯环（C₆H₅⁻）紧密契合由L214、G215、G216、P217、A240、G242、V253和G254形成的疏水斑块，通过强范德华接触稳定侧链。此外，酪氨酸的酰胺基（-NH-CO-）与极性残基S213、N243和S309形成氢键，进一步增强其在催化口袋内定位的稳定性和特异性。值得注意的是，一个结构水分子（W1）始终存在于结合位点内。W1与酪氨酸的羟基形成氢键，并通过与S244侧链配位进一步稳定。被疏水残基包围的该水分子有助于酪氨酸在催化口袋内的精确定向和结合亲和力。
【数据】Ca²⁺结合位点数：2个；催化三联体：D120、H152、S309；底物肽段：P189-D199（含Y195）；酪氨酸残基数：4个（Y75、Y129、Y195、Y208）；结合位点残基数：15个；关键疏水残基：L214、G215、G216、P217、A240、G242、V253、G254；关键极性残基：S213、N243、S309；结构水分子：W1（与S244配位）
3.4 添加剂对BWLP催化的综合分析
#### 3.4.1 金属离子
BWLP与典型芽孢杆菌碱性丝氨酸蛋白酶相比表现出不同的金属离子敏感性（图4A）。Mn²⁺显著增强催化活性，10 mM时相对活性达137.23%。相反，Fe³⁺和Al³⁺几乎完全抑制活性，Cu²⁺引起强烈抑制。此外，BWLP仅被Mg²⁺和Ca²⁺轻微抑制。一价K⁺表现出轻微激活，而Na⁺和几种二价离子（Ni²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Ba²⁺）引起轻微抑制。MD模拟提供了可能有助于解释这些效应的定性结构见解。在天然BWLP酶中，催化三联体残基S309、H152和D120保持功能几何构型，Ser-His氢键距离为3.3 Å（图4B）。
【数据】Mn²⁺（10 mM）相对活性：137.23%；Fe³⁺效应：几乎完全抑制；Al³⁺效应：几乎完全抑制；Cu²⁺效应：强烈抑制；Mg²⁺、Ca²⁺效应：轻微抑制；K⁺效应：轻微激活；Na⁺、Ni²⁺、Co²⁺、Zn²⁺、Ba²⁺效应：轻微抑制；Ser-His氢键距离：3.3 Å
3.5 表面活性剂、氧化剂和有机溶剂对BWLP的影响
（注：原文节选未提供3.5小节的完整内容，以下基于原文节选可获取的信息进行编译）
图5至图8展示了表面活性剂（Tween-20、Tween-80、SDS、CTAB、Triton X-100）、H₂O₂和有机溶剂对BWLP活性及结构动态的影响。图5A显示表面活性剂对BWLP活性的影响，图5B展示了用于分析表面活性剂的自组装MD模拟示意图。图6A展示了BWLP的疏水和亲水表面性质，图6B为SDS、CTAB和Triton X-100的对接与MD模拟工作流程，图6C显示了催化口袋的疏水特征和代表性表面活性剂结合模式。图7A显示BWLP在1%和5% H₂O₂存在下的残余活性，图7B展示了BWLP在纯水、1% H₂O₂和5% H₂O₂条件下的RMSD曲线，图7C和图7D分别展示了90 ns内BWLP在1%和5% H₂O₂下的结构变化。图8A显示有机溶剂对BWLP活性的影响，图8B展示了BWLP上的水分布及BWLP与β-酪蛋白之间的代表性结合相互作用。
【数据】H₂O₂浓度：1%和5%；MD模拟时间：90 ns；表面活性剂：Tween-20、Tween-80、SDS、CTAB、Triton X-100；有机溶剂：甲醇、乙醇、乙腈、乙二醇、乙酸乙酯、丙酮、甘油、异丙醇、二氯甲烷、DMSO
讨论与解读
本研究鉴定出B. atrophaeus WML2023L1为高效的碱性蛋白酶生产菌株。在优化条件下，该菌株产酶达8941.46 ± 119.41 U/mL，在已报道的芽孢杆菌属碱性蛋白酶中处于较高水平。尽管芽孢杆菌属蛋白酶已被广泛研究，但B. atrophaeus产碱性蛋白酶此前仅有一次报道。碱性蛋白酶生产通常与嗜碱微生物相关，但部分芽孢杆菌菌株在初始pH 6.0时仍能获得高产，提示蛋白酶生产的调控机制可能比目前认知的更为复杂。发酵条件采用单因素策略优化，该方法有助于识别单变量效应，但无法捕捉因素间交互作用，为未来响应面法等多因素优化和生物反应器放大评估提供了基础。最终纯化阶段的产量下降反映了纯度与回收率之间的常见权衡，本研究选择保留足够酶量用于生化表征的纯化条件。
编译者解读：本研究将传统酶学表征与多尺度计算模拟深度结合，为理解工业添加剂对蛋白酶结构-功能关系的影响提供了方法论范例。Mn²⁺激活、非离子表面活性剂兼容、1% H₂O₂稳定性等特性使BWLP在洗涤剂和氧化性工业环境中具有应用潜力。但需注意，纯化总回收率仅1.85%，工业化生产的经济性仍需优化；计算模拟结论虽有结构依据，仍需定点突变等实验验证。未来若能建立高通量筛选与分子设计闭环，该类酶的工业适配性将进一步提升。
参考来源
Wan M. The characterization and in silico simulations analysis of ions and chemicals on the dynamics of an alkaline protease produced by Bacillus atrophaeus WML2023L1. International Journal of Biological Macromolecules, 2026. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2026.152798
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2026.152798