来源：Enhancing thermostabilization of a newly discovered α-amylase from Bacillus cereus GL96 by combining computer-aided directed evolution and site-directed mutagenesis（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
α-淀粉酶是工业酶市场中最重要的酶类之一，但热稳定性不足限制了其在高温工业过程中的应用。本研究从伊朗东南部泥火山区域分离到一株蜡状芽孢杆菌GL96，克隆并表征了其新型α-淀粉酶，随后通过计算机辅助定向进化（CADEE）与定点突变相结合的策略，成功将酶的最适反应温度提升5°C，并将80°C下的残余活性从近乎完全失活提升至40%以上。该研究展示了计算设计与实验验证闭环迭代的酶工程改造范式。
研究背景
全球工业酶市场预计在2021年底突破70亿美元，其中α-淀粉酶是研究最深入、应用最广泛的工业酶之一，涉及食品、烘焙、发酵、制药、洗涤、纺织乃至纳米粒子生物合成等领域。根据水解模式，α-淀粉酶分为糖化型和液化型两类，前者从淀粉中生产游离糖，后者则分解淀粉聚合物以降低反应介质黏度。细菌来源的α-淀粉酶因具备宽pH耐受范围、在抑制剂和金属离子存在下保持活性，以及在工业高温过程中维持稳定构象等特性，在工业生产中占据主导地位。然而，天然酶的热稳定性往往难以完全满足严苛的工业条件要求，因此通过蛋白质工程手段提升酶的热稳定性成为该领域的研究热点。
研究方法
2.1 材料与计算系统
所有化学品和培养基均购自商业供应商，级别为分子生物学级。分子生物学酶购自Vivantis、NEB、Bioneer和Takara等国际品牌。定点突变实验使用Agilent Technologies的QuikChange II定点突变试剂盒（目录号200524）。Ni-NTA离心柱购自QIAGEN（目录号31314）。所有计算模拟在高性能计算系统上完成，该系统配备AMD Ryzen 9 3900X CPU、32G内存和Nvidia GeForce GTX 1080 Ti显卡。
【数据】试剂级别：分子生物学级；定点突变试剂盒：QuikChange II（Agilent，Cat#200524）；纯化柱：Ni-NTA spin column（QIAGEN，Cat#31314）；计算平台：AMD Ryzen 9 3900X + 32G RAM + GTX 1080 Ti
2.2 菌株分离与鉴定
细菌来源分离自伊朗东南部恰巴哈尔市附近的泥火山区域。样品在无菌条件下采集并保存。将样品按1:100比例稀释后，先在普通营养琼脂平板上培养。随后将生长出的菌落逐一在含有1%淀粉的LB琼脂培养基上二次培养。根据Lugol碘液测定法鉴定产淀粉酶阳性菌株。选择产酶能力最佳的菌落，通过形态学观察和16S rDNA序列进行进一步鉴定。用于扩增16S rDNA的引物对和PCR程序已在其他文献中描述[27]。最终该菌株被鉴定为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），菌株编号GL96，并已存入GenBank数据库。
【数据】稀释比例：1:100；筛选培养基：LB琼脂+1%淀粉；鉴定方法：Lugol碘液测定法、形态学、16S rDNA测序；菌株：Bacillus cereus GL96
2.3 天然α-淀粉酶基因的鉴定与克隆
根据推导的16S rDNA序列及BLAST结果，确定了基因组序列最为相似的蜡状芽孢杆菌物种。随后从各基因组中提取胞外α-淀粉酶基因序列，使用Geneious Prime 20.1（Biomatters LTD，新西兰）进行比对，生成目标基因的共有序列。基于该序列设计引物对，用于从分离菌株中扩增α-淀粉酶基因。为将扩增基因克隆至pET28a表达载体，在正向和反向引物的5′端分别添加了XhoI和BamHI限制性内切酶酶切位点。扩增片段（1549 bp）经胶回收、酶切后，连接至经同样处理的pET28a载体。连接产物首先转化至大肠杆菌TOP10菌株。随后从阳性菌落中提取重组载体，亚克隆至大肠杆菌BL21 DE3菌株进行高表达。此外，使用通用T7启动子和终止子引物对重组载体进行测序，验证序列准确性。所有克隆操作均按照其他文献描述的方法完成[28]。
【数据】扩增片段：1549 bp；表达载体：pET28a；酶切位点：XhoI + BamHI；宿主菌：E. coli TOP10（克隆）、E. coli BL21 DE3（表达）
2.4 天然α-淀粉酶的表达与纯化
含有重组pET28a质粒的大肠杆菌BL21 DE3在100 mL LB肉汤培养基中培养，培养基中添加适量卡那霉素。当培养基在600 nm处的吸光度达到0.5时，加入0.1 mM IPTG诱导α-淀粉酶表达。诱导4小时后终止。随后通过离心收集细胞，并使用超声破碎法裂解细胞，以避免损伤已表达的淀粉酶。表达水平通过10% SDS-PAGE电泳验证。最后，含有His-Tag标签的目的酶按照制造商说明书使用Ni-NTA离心柱进行纯化。
【数据】培养基：100 mL LB肉汤+卡那霉素；诱导剂：0.1 mM IPTG；诱导时机：OD600=0.5；诱导时间：4h；检测：10% SDS-PAGE；纯化：Ni-NTA离心柱
2.5 天然α-淀粉酶的表征
对表达酶的动力学参数和生物物理性质进行测定，包括温度和pH的活性及稳定性，测定范围覆盖两种性质的宽泛区间。此外，还测定了钙离子和钠离子对酶活性和稳定性的影响。最后，通过TLC方法考察了酶消化的终产物。这些性质评估的详细方案已在其他文献中描述，此处不再赘述[27,29]。需要指出的是，所有稳定性分析均在1小时孵育后进行。
【数据】表征内容：温度/pH活性与稳定性、Ca²⁺/Na⁺影响、TLC终产物分析；稳定性孵育时间：1h
2.6 天然α-淀粉酶的同源建模
为对酶进行计算机模拟定向进化研究，首先采用同源建模（HM）方法推导其三维结构。所有HM步骤均在Molecular Operating Environment（MOE）软件2019-01版（化学计算集团，加拿大）上完成。为使用成熟α-淀粉酶进行HM，首先通过Geneious Prime软件的InterPro Scan模块对酶序列进行注释，将信号肽、内部区域和跨膜区段从序列中切除。随后将成熟序列与PDB数据库进行BLAST比对，选择相似度为74%的PDBid:1VJS（地衣芽孢杆菌α-淀粉酶前体）作为HM的最佳模板。初始同源模型根据Generalized Born/Volume Integral（GB/VI）隐式溶剂模型进行筛选，最后通过能量最小化进行精修，直至能量RMS梯度降至0.01以下。模型结构质量使用Ramachandran图、SAVES v.6网络服务器和FoldX软件的对象稳定性模块进行评估[30]。为避免同源建模偏差对结构质量评估的影响，研究首先预测了1VJS的HM结构并用作模板（而非晶体结构）来模拟α-淀粉酶结构。
【数据】建模软件：MOE 2019-01；模板：PDBid:1VJS（相似度74%）；筛选模型：GB/VI隐式溶剂模型；能量最小化标准：RMS梯度<0.01；质量评估：Ramachandran图、SAVES v.6、FoldX
2.7 天然α-淀粉酶的计算机模拟定向进化
酶计算机模拟定向进化的第一阶段在BIOVIA Discovery Studio 2018（Dassault Systèmes Corporate，美国）上完成。首先对蛋白质进行组合扫描突变，生成所有酶残基向丙氨酸的单价点突变（丙氨酸扫描）。为实现研究目标，软件设置为在60°C下执行温度依赖计算算法，采用GBIM隐式溶剂模型，使用CHARMm力场和pH非依赖模式评估每个残基在高温下对蛋白质稳定性的贡献。将突变为Ala后具有稳定效应（负突变能量）的位点筛选出来进行进一步评估。计算每个突变能量效应的公式如下：ΔΔG_mut = ΔΔG_fold(突变体) − ΔΔG_fold(野生型)。第二阶段中，选择排名前10的稳定化突变位点进行进一步评估。将每个位点的天然残基分别突变为其他19种氨基酸。随后测量工程化蛋白质的稳定性并与天然酶进行比较。结果按蛋白质稳定性值排序，排名前3的突变体被选作分子动力学模拟对象。
【数据】计算软件：BIOVIA Discovery Studio 2018；扫描温度：60°C；溶剂模型：GBIM；力场：CHARMm；筛选策略：Ala扫描→Top 10位点→19种氨基酸替换→Top 3突变体
2.8 分子动力学模拟
为确定突变对酶热稳定性随时间变化的精确影响，分别在37°C（310 K，环境温度）和60°C（333 K，高温）下进行分子动力学模拟。首先，每个结构通过1000步最速下降能量最小化进行准备，RMS梯度容差为3，随后进行共轭梯度最小化。之后，使用显式周期性边界溶剂化算法将结构置于立方体形盒子中，与周期性边界的最小距离为7 Å。采用TIP3P水分子模型作为溶剂。通过添加0.01M抗衡离子中和所有电荷。随后，整个系统最小化1 ns，然后分别加热至310 K（环境温度）和333 K（高温情况），加热过程持续5 ns以避免系统动力学上陷入局部最小值。下一步，通过在目标温度下进行10 ns的平衡步骤使系统松弛。
【数据】模拟温度：310 K（37°C）和333 K（60°C）；能量最小化：1000步最陡下降（RMS容差3）+共轭梯度；溶剂盒子：立方体，最小距离7 Å；水模型：TIP3P；抗衡离子：0.01M；系统最小化：1 ns；加热：5 ns；平衡：10 ns
研究结果
3.1 菌株鉴定
对分离菌株的初步形态学检查推测其属于芽孢杆菌属。该菌呈杆状形态，革兰氏染色阳性。对分离菌株16S rDNA基因的1418 bp扩增片段进行Sanger测序，结果清楚地表明该菌株为蜡状芽孢杆菌——BLAST结果中前100个匹配序列与该物种的一致性均超过99%，且来源多样。测序扩增子已存入GenBank，登录号为MN989007。
【数据】16S rDNA扩增片段：1418 bp；BLAST一致性：>99%（前100个结果）；GenBank登录号：MN989007
3.2 天然α-淀粉酶基因与蛋白质
为从分离的蜡状芽孢杆菌GL96中扩增α-淀粉酶基因，设计并使用了两个寡核苷酸引物，正向引物序列为CGC GGATCC GCGCAGATGTTTAAAAGAATAACAA，反向引物序列为CCG CTCGAG CGGCAAATTACTGCTGAACAT。加粗下划线序列分别为BamHI和XhoI限制性内切酶的酶切位点。扩增片段包含1542 bp的开放阅读框（ORF）。该序列可编码513个氨基酸的蛋白质，序列起始端含有27个氨基酸的信号肽，成熟蛋白中不存在该信号肽。通过InterProScan搜索序列发现，成熟蛋白包含两个结构域：第33至421位氨基酸属于“淀粉酶催化结构域”（Glyco_hydro_13_cat_dom），第466至510位编码淀粉酶C端结构域。成熟蛋白的分子量和等电点分别计算为约58.2 kDa和5.49。BLAST结果显示，核苷酸和蛋白质序列与其他蜡状芽孢杆菌α-淀粉酶分别具有99.68%和99.61%的相似性。检查BLAST-P结果发现两个独特的氨基酸替换（D267G和S452P），这两个替换在其他蜡状芽孢杆菌α-淀粉酶中完全不存在。将该序列与BLAST结果中最相似的序列（GenBank登录号EEK93834.1）进行初步生物信息学分析——结合同源建模（按照2-6节所述方法）和FoldX 5稳定性评估——发现本研究的酶稳定性显著高于另一蜡状芽孢杆菌物种中的对应酶，高出约14.16 kcal/mol。由于该对应序列与其他蜡状芽孢杆菌物种几乎相同，上述结论可推广至该物种的所有成员。最终，酶序列已提交至GenBank，登录号为OK398022。
如方法部分所述，酶表达水平和纯化质量通过SDS-PAGE凝胶电泳评估。如图2所示，诱导样品（泳道D）中在58 kDa附近有一条条带，而对照样品（泳道C）中不存在该条带，与酶的计算分子量一致。最后一次纯化步骤的样品也显示单一条带，大小与诱导样品提取物中的条带相当（泳道A）。因此可以得出结论，蛋白质纯度足以进行后续实验。如表1所示，酶富集超过95倍，总活性损失低于8%。酶的动力学参数以可溶性淀粉为底物进行测定。酶的最大反应速度（Vmax）、米氏常数（Km）和催化转换数（Kcat）分别测定为约97.9 μM/min、0.107 mM和312 S⁻¹。由于Km与酶的亲和力呈反比关系，根据BRENDA酶数据库（BRENDA可在www.brenda-enzymes.org获取），本研究的α-淀粉酶Km值在368个已记录的α-淀粉酶（EC 3.2.1.1）Km值中排名第15位。在细菌中，只有地衣芽孢杆菌[32]和枯草芽孢杆菌[33]的淀粉酶Km值低于本研究。然而，就Kcat值而言，本研究的α-淀粉酶比大多数微生物来源的α-淀粉酶（包括地衣芽孢杆菌）表现出更高的转换数（Kcat越大，酶对底物的特异性越高）（数据来自BRENDA）。酶的淀粉水解活性按照Bernfeld方法测定[27]。
【数据】ORF长度：1542 bp；蛋白长度：513 aa（含27 aa信号肽）；结构域：33-421催化域、466-510 C端域；分子量：58.2 kDa；pI：5.49；序列相似性：99.68%（核苷酸）/99.61%（蛋白质）；独特突变：D267G、S452P；稳定性差异：+14.16 kcal/mol；纯化倍数：>95倍；活性损失：<8%；Vmax：97.9 μM/min；Km：0.107 mM；Kcat：312 S⁻¹；GenBank登录号：OK398022
3.3 天然酶的生物物理性质
#### 3.3.1 pH的影响
评估了pH 3至12范围内不同pH值对天然表达的α-淀粉酶活性和稳定性的影响。如图3所示，酶在pH 4至11的宽范围内具有活性和稳定性。在此范围内，酶的两个参数从未低于最适值的40%。然而，在pH超过11.5时未显示显著活性和稳定性。最适酶活性出现在pH 9.5，最高稳定性出现在pH约8.5。根据这些观察结果，该酶似乎是中度嗜碱糖苷酶。在其他几项关于蜡状芽孢杆菌α-淀粉酶的研究中，酶活性的最适点在6至8之间，低于本研究的酶[34-36]。另一方面，目前尚无关于蜡状芽孢杆菌纯化α-淀粉酶pH稳定性的记录。然而，Awasthi等人[35]的一项研究评估了全细胞系统的残余酶活性，表明在pH 6至7之间孵育半小时后酶完全稳定。
【数据】pH测试范围：3-12；活性/稳定性范围：pH 4-11（保持>40%）；最适活性pH：9.5；最高稳定性pH：8.5；pH>11.5：无显著活性/稳定性
#### 3.3.2 温度的影响
在20至90°C范围内评估了酶的热活性和热稳定性。酶在20至70°C范围内具有显著活性（活性>40%），最适活性记录在50°C。在高达70°C的温度下孵育1小时后，酶仍能保持初始活性的40%以上（最适点时为80%）。超过80°C后活性和稳定性急剧下降，最终在高于85°C时完全失活（图4）。这些数值与其他蜡状芽孢杆菌物种同类酶的报道基本处于同一范围[34-36]。不过，这些报道在评估热稳定性和pH稳定性时的孵育时间较短（30分钟）。
【数据】温度测试范围：20-90°C；显著活性范围：20-70°C（>40%）；最适温度：50°C；70°C孵育1h残余活性：>40%；80°C后急剧下降；完全失活：>85°C
#### 3.3.3 金属离子的影响
由于蛋白质同源模型（图5）中存在推测的钙和钠结合位点（通过与PDB id 1BLI的结构比对推导得出），评估了浓度为5 mM的这两种离子对酶活性和稳定性的影响。结果表明，Ca²⁺可使酶活性提高15%，而使用EDTA作为Ca²⁺螯合剂可使酶活性降低20%。这一发现表明酶的活性对Ca²⁺离子有轻微依赖性。然而，Ca²⁺的存在并未增强酶的热稳定性，这对工业应用非常重要。钙离子依赖性在细菌α-淀粉酶中普遍存在，数值与本研究结果相近。例如，Ca²⁺可使解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶活性提高20%[37]，枯草芽孢杆菌提高35%[38]，Geobacillus sp. LH8提高80%和100%[39,40]，甚至对另一种Geobacillus sp.完全无依赖性[41]。另一方面，添加Na⁺对酶活性和稳定性均无影响。此外，去除钠离子的酶与其正常形式没有差异。
【数据】离子浓度：5 mM；Ca²⁺对活性提升：+15%；EDTA导致活性下降：-20%；Ca²⁺对热稳定性：无增强；Na⁺对活性/稳定性：无影响
#### 3.3.4 酶的终产物
使用简单TLC方法评估天然α-淀粉酶消化淀粉的终产物。结果表明，酶在10分钟孵育时间内产生麦芽糖、麦芽三糖和麦芽四糖的混合物。然而，将孵育时间延长至1小时后，产物主要是麦芽糖（数据未显示），这与许多关于细菌α-淀粉酶的报道一致[27,42,43]。能够作用于廉价底物（如淀粉）的高性能麦芽糖生成型水解酶（如α-淀粉酶）已获得显著关注。此类酶在食品、化工和制药行业具有许多潜在应用。
【数据】孵育10 min产物：麦芽糖+麦芽三糖+麦芽四糖混合物；孵育1h产物：主要为麦芽糖
3.4 计算机模拟定向进化结果
通过同源建模获得了天然α-淀粉酶的三维结构模型。图5显示了根据二级结构元素着色的同源模型，C端结构域以蓝色标记。红色虚线圆圈标示了两个独特突变（D240G和S425P）的位置。图6展示了酶同源模型上Asp残基占据的突变热点位点的三维位置，显示它们位于β-折叠链内部或紧邻其前端，D1和D149除外。对诱变最有利的位点D162位于酶的B结构域，该结构域涉及金属离子结合。
丙氨酸扫描结果显示，多个Asp残基位点突变为Ala后具有稳定化效应。将排名前10的稳定化位点逐一突变为其他19种氨基酸后，根据蛋白质稳定性值排序，D162W、D162R和D162K被确定为排名前3的稳定化突变体，进入分子动力学模拟阶段。
分子动力学模拟在310 K和333 K两种温度下进行。图7展示了四种不同形式的所研究α-淀粉酶在310 K和333 K下的RMSD、RMSF、Rg、H键和SASA的时间演变图。每个系统根据模拟温度进行颜色编码。为清晰起见，c和d部分的数据被绘制为四个单独叠加的图形。图8的热图显示了所有酶变体在150至170位残基间的RMSF数据，清楚地表明突变形式在候选突变位点（D162）附近的两个温度下该值均有所降低。
【数据】模拟温度：310 K和333 K；突变位点：D162（B结构域，金属离子结合区）；候选突变：D162W、D162R、D162K；独特突变位置：D240G、S425P
3.5 定点突变与突变酶表征
根据计算机模拟结果，D162K在分子动力学模拟中表现最佳，因此通过定点突变（SDM）构建了该突变体。对突变酶的表征结果显示（图9），其最适温度比天然酶高5°C（55°C），且活性高于天然酶。此外，突变体的稳定性显著优于天然形式。例如，天然酶在70°C以上几乎完全丧失功能，而D162K突变体在高达80°C时仍可保留初始活性的40%以上。突变体的pH谱与天然酶相比没有变化。值得注意的是，尽管突变靶向酶的金属结合结构域（靠近Na⁺结合位点），但并未对酶功能产生有害影响。
【数据】最适温度提升：+5°C（50→55°C）；80°C残余活性：>40%（野生型在70°C以上几乎完全失活）；pH谱：无变化；金属结合域突变：无有害效应
讨论与解读
本研究通过计算机辅助定向进化（CADEE）成功将新发现的蜡状芽孢杆菌GL96 α-淀粉酶改造为具有更高热稳定性的变体。计算模拟确定了D162K为最稳定化突变，并经定点突变实验验证。表征结果显示，突变体的最适活性温度提高了5°C，整体热稳定性较野生型提升了20%。酶的pH谱在引入突变后未发生变化。有趣的是，尽管突变靶向酶的金属结合结构域（靠近Na⁺结合位点），但未对酶功能产生有害影响，这为进一步研究提供了有价值的依据。
虽然这是令人鼓舞的进展，但要达到最初预期的约50%稳定性提升，仍需更多工作。应将这一突变体视为新的起点，在未来的研究中探索双重甚至三重同步突变等新的增强修饰，以更好地实现初始目标。
编译者解读
该研究展示了计算-实验闭环迭代在酶工程中的实用价值——先通过丙氨酸扫描和全氨基酸替换筛选锁定候选突变，再用分子动力学模拟在两种温度下验证动态行为，最终仅构建一个突变体即获得明确的热稳定性增益。这种策略大幅减少了实验筛选工作量。值得注意的是，D162位于金属离子结合结构域却未损伤酶功能，提示该位点的稳定化机制可能涉及局部构象刚性化而非离子结合能力的改变。局限在于仅验证了单点突变，距离50%稳定性提升目标尚有差距，后续可沿多点组合突变方向推进。从合成生物学角度看，该工作为“计算预测-实验验证”的酶工程循环提供了可复制的范例。
参考来源
Pouyan S, et al. Enhancing thermostabilization of a newly discovered α-amylase from Bacillus cereus GL96 by combining computer-aided directed evolution and site-directed mutagenesis. International Journal of Biological Macromolecules, 2022.
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2021.12.057
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2021.12.057