来源：Structure-guided evolution to improve the catalytic performance of aldo-keto reductase yhdN from Bacillus subtilis for preparing chiral diaryl α-hydroxy amides（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
手性二芳基α-羟基酰胺是多种手性药物合成的关键砌块，但其不对称催化制备长期受限于两个大体积芳基的空间位阻。本研究从枯草芽孢杆菌中鉴定出醛酮还原酶yhdN，通过结构引导进化获得一对立体互补突变体W126F/W21S/A56T和W126A/W21A/P325V，在3小时内分别以98.8%和98.3%的转化率、99.2%(S)和97.5%(R)的对映体过量值催化模型底物还原。分子对接与动力学模拟揭示了W21和W126位点重塑底物结合口袋的机制，为这类"难转化"底物的酶催化制备提供了新路径。
研究背景
手性二芳基α-羟基酰胺广泛存在于生物活性化合物中，并作为手性配体用于药物不对称合成，如RAR-γ激动剂、缓激肽拮抗剂及抗生素头孢孟多等。其中代表性化合物N-苯基-2-羟基-2-苯基乙酰胺(1b)是RAR-γ激动剂BMS270394和BMS961的关键前体，后者可通过调控细胞分化和抑制促炎因子治疗肿瘤和皮肤炎症。由于RAR-γ激动剂具有明确的市场需求，1b的合成备受关注。
目前手性二芳基α-羟基酰胺主要通过二芳基α-酮酰胺的不对称氢化获得。例如，手性CuO-NPs催化剂可实现94%产率和90%e.e.(S)，但需24小时反应时间；Rongalite虽可在70°C下以90–98%产率合成多种二芳基α-羟基酰胺，却无对映选择性。化学方法各有优势，但普遍受限于反应时间长、对映选择性不足或条件苛刻等问题，亟需开发新的生物催化途径。
研究方法
2.1 分子对接
yhdN晶体结构(PDB ID: 1PZ1)取自蛋白质数据银行，移除除辅因子NADPH外的所有共晶配体。删除水分子并添加氢原子后，yhdN三维结构作为受体使用。配体1a通过Avogadro v1.2.0构建并经能量最小化优化。yhdN及其变体与1a的分子对接使用AutoDock 4.2(http://autodock.scripps.edu)完成。在采样1a的各种结合构象时，以辅因子NADPH的C4原子为中心设置包含55×55×55格点的大立方盒进行对接计算[23]。选择具有最优构象的yhdN–及其变体–1a复合物用于后续研究。
【数据】蛋白结构：yhdN (PDB: 1PZ1)；辅因子：NADPH；对接软件：AutoDock 4.2；格点盒：55×55×55；中心：NADPH C4原子
2.2 定点/迭代突变
yhdN的定点/迭代突变采用全质粒PCR方法，使用PrimeSTAR DNA聚合酶，所用引物见Tables S1–S4。以重组质粒yhdN-pET28a为模板进行PCR以产生变体；含有yhdN单点变体基因的重组质粒作为模板构建后续迭代变体。PCR程序设定如下：98°C 3分钟；随后30个循环：98°C 10秒、60°C 15秒、72°C 6分30秒；最后72°C延伸10分钟。PCR产物经核酸电泳验证。纯化后的PCR产物用DpnI消化，消化产物转化至100 μL E. coli BL21(DE3)感受态细胞。细胞在含卡那霉素(50 μg/mL)的LB平板上过夜培养，挑取单菌落进一步培养。预期突变经Comate Bioscience Co., Ltd.(中国长春)DNA测序确认。
【数据】聚合酶：PrimeSTAR；模板：yhdN-pET28a；PCR条件：98°C 3min；30循环(98°C 10s, 60°C 15s, 72°C 6min30s)；72°C 10min；DpnI消化；感受态：E. coli BL21(DE3) 100μL；抗生素：卡那霉素50μg/mL；测序：Comate Bioscience
2.3 yhdN变体–GDH全细胞生物催化剂的构建
为构建含yhdN变体和GDH的重组全细胞，将本研究获得的双质粒yhdN变体-pET28a与本实验室保存的GDH-pET21a共转化至E. coli BL21(DE3)细胞[24]。获得的yhdN变体–GDH重组全细胞在含50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中生长。培养物在37°C振荡培养至600 nm光密度达0.6–0.8，随后加入终浓度0.1 mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。样品在25°C孵育12小时后，6796×g离心4分钟获得重组全细胞。yhdN变体与GDH的共表达通过SDS-PAGE分析确认(Fig. S2)。
【数据】质粒：yhdN变体-pET28a + GDH-pET21a；宿主：E. coli BL21(DE3)；抗生素：卡那霉素50μg/mL + 氨苄青霉素50μg/mL；诱导温度/时间：25°C/12h；IPTG终浓度：0.1mM；离心：6796×g/4min；培养温度：37°C；OD600：0.6–0.8
2.4 变体–GDH全细胞催化的α-酮酰胺不对称还原
反应混合物包含1a–7a (25 mM)、甲醇(5%, v/v)、CHCl: Lys (1:2) (10%, v/v)、全细胞(0.3 g)和葡萄糖(36 mg/mL)，溶于Kpi缓冲液(100 mM, pH 7.0, 0.5 mL)，反应在30°C进行。用毛细管定期从混合物中取样，点样于硅胶板(青岛海洋化工有限公司，中国)，以乙酸乙酯/石油醚(1:5, v/v)为展开剂。当展开剂接近板前沿时，取出硅胶板，干燥后在254 nm紫外灯下观察以监测底物还原。反应完成后，反应混合物用乙酸乙酯(1.0 mL)萃取三次。分离有机层，无水Na2SO4干燥，减压浓缩。反应转化率和e.e.通过HPLC(大连依利特分析仪器有限公司，中国)检测，配备Daicel Chiralpack OD-H (5 μm, 250 × 4.6 mm)或AD-H色谱柱(5 μm, 250 × 4.6 mm)。详细检测条件和(R)-与(S)-α-羟基酰胺的保留时间见Figs. S9–S15。合成的外消旋1b–7a的所有NMR数据见Figs. S16–S22。
【数据】底物浓度：25mM；共溶剂：甲醇5%(v/v) + CHCl: Lys(1:2) 10%(v/v)；全细胞用量：0.3g；葡萄糖：36mg/mL；缓冲液：Kpi 100mM pH 7.0；反应体积：0.5mL；反应温度：30°C；萃取：乙酸乙酯1.0mL×3；HPLC色谱柱：Chiralpack OD-H或AD-H (5μm, 250×4.6mm)；检测波长：254nm
研究结果
3.1 二芳基α-酮酰胺的不对称还原
前期工作中，yhdN被发现对1a的不对称还原具有催化活性，但在DMSO作为共溶剂、NADPH作为辅因子的条件下，12小时内仅获得34.2 ± 0.3%的低转化率和13.3 ± 0.1%的e.e.(S)。为评估yhdN催化还原的辅因子偏好性，首先分别在NADPH和NADH作为辅因子条件下改变1a浓度进行动力学分析。如Table S5A所示，当NADPH作为辅因子时，yhdN催化1a还原的Km为2.36 ± 0.19 mM，而NADH作为辅因子时Km为2.52 ± 0.12 mM。这表明在NADPH辅因子存在下yhdN与1a的亲和力较高。此外，在1a浓度为2.5 mM条件下改变辅因子浓度测定动力学参数。Table S5B结果显示，yhdN催化1a还原中NADPH的Km(2.62 ± 0.26 mM)略低于NADH(2.78 ± 0.28 mM)。NADPH作为电子供体的kcat/Km为1.07 s⁻¹mM⁻¹，高于NADH的0.97 s⁻¹mM⁻¹。这些发现表明yhdN–NADPH的亲和力优于yhdN–NADH，yhdN对NADPH具有辅因子偏好性。
为避免额外添加辅因子，随后构建了重组yhdN–GDH全细胞(0.1 g)并用于1a的还原。结果表明，全细胞比游离yhdN表现出更高的催化活性，3小时内获得59.2 ± 1.5%的转化率和2.3 ± 0.5%的e.e.(S)(Table 1)。鉴于全细胞在催化活性、无需添加辅因子和繁琐的酶纯化方面的优势，后续所有实验均使用全细胞催化体系。
基于前期经验，上述yhdN催化反应使用DMSO作为共溶剂。然而，合适的共溶剂可能对酶催化反应产生积极影响，因此本研究还评估了其他共溶剂。所选共溶剂包括亲水性溶剂DMSO、甲醇、DMF、乙醇、异丙醇、THF和乙腈，以及疏水性溶剂己烷和异辛烷[25]。Table S6中的实验数据表明，共溶剂可影响yhdN–GDH全细胞还原1a的活性和对映选择性，但未发现对映选择性与共溶剂特性之间的相关性。分别使用亲水性DMSO、甲醇、乙醇、异丙醇作为共溶剂时，反应均表现出(S)-构型选择性，转化率从41.5 ± 0.1%到59.2 ± 1.5%不等。含DMSO和甲醇的反应体系分别呈现59.2 ± 1.5%和58.4 ± 0.5%的高转化率。相比之下，含己烷和异辛烷等疏水性共溶剂的反应体系比含亲水性共溶剂的体系转化率更低，尤其是异辛烷体系，转化率大幅降至9.7 ± 0.1%。共溶剂引起的yhdN活性和对映选择性变化可能归因于酶分子的构象变化。综合而言，后续全细胞催化反应选择DMSO作为共溶剂。
【数据】WT yhdN催化1a：转化率34.2±0.3%，e.e.(S) 13.3±0.1%，12h，DMSO共溶剂；NADPH辅因子Km：2.36±0.19mM；NADH辅因子Km：2.52±0.12mM；NADPH的Km：2.62±0.26mM；NADH的Km：2.78±0.28mM；kcat/Km(NADPH)：1.07s⁻¹mM⁻¹；kcat/Km(NADH)：0.97s⁻¹mM⁻¹；yhdN–GDH全细胞：转化率59.2±1.5%，e.e.(S) 2.3±0.5%，3h；异辛烷体系转化率：9.7±0.1%
3.2 潜在氨基酸残基的鉴定
为进一步提升yhdN的催化能力，对野生型(WT) yhdN与1a进行分子对接，以鉴定可能影响酶性能的潜在氨基酸残基(图1A)。由于控制酶催化性质的氨基酸残基通常位于底物结合口袋和辅因子结合部分[26]，首先检查并分析了WT yhdN活性位点中靠近催化中心的大、小疏水腔以及NADPH结合位点。大底物结合口袋由K84、H125、W126、Y203、M323和P325组成，小口袋由W21、M27、D52、A56、Y57和L94组成(图1A)。排除催化四联体D52-Y57-K84-H125后，选择结合口袋周围的十三个关键氨基酸残基，包括W21、M27、A56、L94、W126、Y203、M323和P325，以及NADPH附近的G19、T20、G204、L278和G280进行研究。
为阐明每个残基对yhdN活性和对映选择性的影响，除A56外，这些残基最初均被替换为丙氨酸(A)。通过构建变体–GDH全细胞催化1a还原来评估丙氨酸变体的催化能力。如图1B所示，不同丙氨酸变体表现出不同的催化活性和立体选择性。G19A、W21A、G204A和G280A等变体呈现与WT相同的(S)-偏好，e.e.(S)分别提高至12.4 ± 0.4%、11.8 ± 0.3%、8.8 ± 0.1%和10.5 ± 0.4%，相应转化率分别为48.4 ± 1.0%、78.9 ± 0.9%、48.6 ± 1.4%和53.7 ± 0.4%。酶活性增幅最大且保持高(S)-立体选择性的是W21A变体。除上述四个变体外，其他丙氨酸变体均表现出反转的(R)-立体选择性，其中W126A是表现突出的变体，实现构型反转，e.e.(R)达17.5 ± 0.2%，转化率高达66.0 ± 0.6%。因此，第21和126位氨基酸残基被认为至关重要，值得深入研究。
为进一步探索W21和W126位氨基酸残基的作用，基于其不同的体积和疏水性[27]，将它们分别突变为Ala、Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr和Phe(图2A)。同时，根据图1B中丙氨酸扫描结果，对T20、L94和Y203等具有潜在催化活性和对映选择性优势的氨基酸残基也进行了同步突变。对图2A和Table S8中这些变体催化结果的分析表明，所有获得的W21变体均保留(S)-立体选择性，与其他位点变体相比，在活性和对映选择性方面的优势仍然明显。W21A、W21S、W21T和W21N等变体催化的还原反应转化率分别可达78.9 ± 0.9%、70.4 ± 0.6%、66.7 ± 1.5%和75.6 ± 0.8%，e.e.(S)分别为11.8 ± 0.3%、32.6 ± 0.5%、33.4 ± 0.7%和43.6 ± 1.2%，均高于WT(59.2 ± 1.5%转化率和2.3 ± 0.5%e.e.(S))。优异活性集中在W21A和W21N等变体。虽然W21Q变体的反应转化率低于WT，但仍观察到29.8 ± 0.8%的较高e.e.(S)。从图2B的WT–1a对接复合物可以看出，位于小口袋中的W21残基易产生空间位阻，阻碍1a与WT的正确结合。当第21位Trp突变为Ala、Ser或Asn时，变体的活性腔可通过loop 1的延伸而扩大[28]，从而增强变体的催化能力。显然，W21残基在改变yhdN活性方面发挥重要作用。
除W21变体外，T20、L94、W126和Y203位点的其他变体均可触发反转的(R)-偏好(Table S8)。T20L和W126A催化的1a还原中可观察到高转化率(78.1 ± 1.1%和66.0 ± 0.6%)和e.e.(R)(21.6 ± 0.3%和17.5 ± 0.2%)。虽然W126A的催化性能低于T20L，但考虑到W126F和W126Y变体也能表现出(S)-立体选择性，该位点的进一步研究仍具价值。
【数据】G19A：转化率48.4±1.0%，e.e.(S) 12.4±0.4%；W21A：转化率78.9±0.9%，e.e.(S) 11.8±0.3%；G204A：转化率48.6±1.4%，e.e.(S) 8.8±0.1%；G280A：转化率53.7±0.4%，e.e.(S) 10.5±0.4%；W126A：转化率66.0±0.6%，e.e.(R) 17.5±0.2%；W21S：转化率70.4±0.6%，e.e.(S) 32.6±0.5%；W21T：转化率66.7±1.5%，e.e.(S) 33.4±0.7%；W21N：转化率75.6±0.8%，e.e.(S) 43.6±1.2%；W21Q：转化率低于WT，e.e.(S) 29.8±0.8%；T20L：转化率78.1±1.1%，e.e.(R) 21.6±0.3%
3.3 迭代突变与立体互补变体的获得
基于W21和W126位点的初步结果，研究进一步通过迭代突变组合优化。以W21S和W21A为母本，分别引入W126位点的有益突变，构建双位点变体。随后在双位点变体基础上，对A56和P325等位点进行第三轮突变，最终获得两个立体互补的优良变体：W126F/W21S/A56T和W126A/W21A/P325V。
图3和图4分别展示了W126F/W21X和W126A/W21X系列变体–GDH全细胞催化1a不对称还原的结果及分子对接分析。W126F/W21S/A56T变体在3小时内实现1b的转化率达98.8 ± 1.1%，e.e.达99.2 ± 0.8%(S)；W126A/W21A/P325V变体在3小时内实现转化率98.3 ± 1.3%，e.e.达97.5 ± 1.0%(R)。
图5显示了从WT到优良变体过程中1a-酶结合构象的变化，以及W126A/W21A/P325V与1a的分子对接复合物。对接分析表明，W21和W126位点的突变重塑了底物结合口袋，变体活性腔的扩大使1a能够以更有利于反应的方式结合。
图6展示了WT–1a(A)、W126F/W21S/A56T–与W126A/W21A/P325V–1a(B)复合物中∠NADPH-C4–O10–C8–C5和距离d(NADPH-C4–C7)的发散三维图，以及W126F/W21S/A56T–1a(C)和W126A/W21A/P325V–1a(D)的分子细节及其与yhdN WT的结构比对。分子动力学模拟进一步揭示了突变如何通过重塑口袋和形成π-π/π-烷基相互作用来调控立体选择性。
【数据】W126F/W21S/A56T：转化率98.8±1.1%，e.e. 99.2±0.8%(S)，3h；W126A/W21A/P325V：转化率98.3±1.3%，e.e. 97.5±1.0%(R)，3h
3.4 底物谱分析
图7展示了WT、W126F/W21S/A56T和W126A/W21A/P325V全细胞催化剂对不同二芳基α-酮酰胺底物的还原结果。两个优良变体对多种带有不同取代基的二芳基α-酮酰胺底物均表现出良好的催化活性和对映选择性，成功制备了多种手性二芳基α-羟基酰胺。
【数据】底物类型：多种二芳基α-酮酰胺(原文未逐一列出各底物具体转化率数值)
3.5 全细胞催化剂的可重复使用性
图8展示了WT–、W126F/W21S/A56T–和W126A/W21A/P325V–GDH全细胞的可重复使用性。两种优良变体–GDH全细胞在多次循环使用后仍保持良好的催化活性和对映选择性，展现出优异的操作稳定性和应用潜力。
【数据】循环使用次数及每次循环后的转化率/e.e.具体数值原文未在节选部分详述
讨论与解读
本研究通过结构引导进化成功提升了枯草芽孢杆菌醛酮还原酶yhdN催化二芳基α-酮酰胺不对称还原的性能。两个立体互补变体W126F/W21S/A56T和W126A/W21A/P325V分别在3小时内以>98%的转化率和97.5–99.2%的e.e.制备(S)-和(R)-构型产物1b。分子对接与MD模拟揭示了W21和W126位点突变通过扩大活性腔和形成π-π/π-烷基相互作用来重塑底物结合口袋的机制。变体–GDH全细胞催化剂在活性和可重复使用性方面均表现出优势，为难以获得的手性二芳基α-羟基酰胺提供了高效、可回收的生物催化途径。
编译者解读：本研究是典型的"酶工程+全细胞催化"组合策略——先用结构信息指导理性设计，再用全细胞体系规避辅因子再生和酶纯化的瓶颈。W21/W126双位点策略通过重塑口袋实现立体选择性反转，这一思路对同类"大体积底物"的酶催化改造具有借鉴价值。全细胞催化剂的可重复使用性数据直接回应了工业应用的经济性诉求。局限在于底物谱的广谱性和长周期操作稳定性仍有待验证，后续若能与高通量筛选结合，有望进一步释放该酶的合成潜力。
参考来源
Du X. Structure-guided evolution to improve the catalytic performance of aldo-keto reductase yhdN from Bacillus subtilis for preparing chiral diaryl α-hydroxy amides. International Journal of Biological Macromolecules, 2025. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.143381
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.143381