Bacillus licheniformis T13

来源：Bacillus licheniformis T13: A bifunctional strain for sequential lignin depolymerization and biohydrogen production from agro-wastes（Renewable Energy）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

木质纤维素生物质与食物垃圾是极具潜力的可再生资源，但木质素的顽抗性严重阻碍了其生物转化效率。本研究从厌氧消化污泥中分离获得一株地衣芽孢杆菌T13，该菌株在有氧条件下可实现木质素解聚（脱色率72.1%），在厌氧条件下可进行暗发酵产氢（最高228 mL H₂/g VS）。全基因组测序揭示了其编码多铜氧化酶、AA10裂解性多糖单加氧酶及[FeFe]-氢化酶的完整代谢网络。该菌株为未处理农业废弃物的分步整合生物加工提供了单菌株平台。

研究背景

木质纤维素生物质和食物垃圾是丰富但未充分利用的可再生资源。木质素可占木质纤维素材料的30%，其顽抗性严重限制了酶和微生物对内部碳水化合物的获取。全球每年产生超过13亿吨食物垃圾，富含碳水化合物、蛋白质和残留木质纤维素，但管理不善。传统物理化学预处理能耗高且常产生发酵抑制剂。通过暗发酵生产的生物氢是清洁能源载体，但其经济可行性取决于低成本未处理废弃物和稳健的微生物催化剂。利用能够修饰木质素和水解多糖的微生物进行生物预处理，可实现整合生物加工（CBP），在同一容器中完成降解和发酵，降低成本与工艺复杂性。真菌系统主导木质素降解研究，但细菌菌株在生长速率、遗传可操作性及对恶劣条件的适应性方面具有优势。芽孢杆菌属，特别是地衣芽孢杆菌，以其多样的酶谱和应激耐受性而闻名。近期研究已报道具有木质素解聚和产氢双重能力的细菌菌株。

研究方法

2.1 样品采集、化学品与培养基

分析级化学品购自Sigma-Aldrich（木质素、Azure B）和当地供应商（木聚糖、CMC、淀粉、葡萄糖、脱脂牛奶）。所有培养基均用蒸馏水配制，除非另有说明，均在121°C下高压灭菌15–20分钟。从山东理工大学一座全规模厌氧反应器采集厌氧消化污泥（1 L），冰上运输并立即处理。

【数据】灭菌条件：121°C，15–20 min；样品来源：厌氧消化污泥1 L

2.2 T13菌株的分离

将均质化污泥（100 mL，0.9% NaCl）在80°C下热激处理3小时，以富集产孢细菌——这是耐热芽孢杆菌的标准选择性方法。在含以下成分（g/L）的无机盐培养基（MSM）中进行连续富集：KH₂PO₄ 1.0，NaCl 0.5，NH₄Cl 1.0，MgSO₄·7H₂O 0.2，FeCl₃ 0.01，以及1 g/L木质素（pH 7.0）。经过三个富集周期（72小时，37°C，150 rpm）后，将稀释液涂布于木质素-MSM琼脂平板。挑取产生清晰透明圈的菌落进行纯化。基于全基因组测序，该分离株被鉴定为地衣芽孢杆菌——一种已知在营养限制条件下产生耐热内生孢子的物种。纯培养物保存在−80°C的20%甘油中。

【数据】热激条件：80°C，3 h；富集培养基成分：KH₂PO₄ 1.0 g/L，NaCl 0.5 g/L，NH₄Cl 1.0 g/L，MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L，FeCl₃ 0.01 g/L，木质素1 g/L，pH 7.0；富集周期：72 h，37°C，150 rpm；保存条件：−80°C，20%甘油

2.3 全基因组测序与生物信息学分析

T13在LB肉汤中培养（37°C，200 rpm，18小时）。使用QIAamp DNA Mini Kit提取基因组DNA。在Illumina MiSeq平台进行测序（2 × 300 bp双端，约100×覆盖度）。原始读段用Trimmomatic进行质量修剪，并用SPAdes进行从头组装。草图基因组（4.135 Mbp，85个contigs，N50 245 kb）使用Prokka和NCBI PGAP进行注释。功能注释包括COG、KEGG、CAZy（dbCAN2）和VFDB/CARD数据库。使用Roary对15个参考地衣芽孢杆菌基因组进行泛基因组分析。原始读段和组装结果已提交至NCBI（BioProject PRJNAxxxxxxxx，BioSample SAMN52017259）。详细组装统计见补充表S1–S5。

【数据】培养条件：37°C，200 rpm，18 h；测序平台：Illumina MiSeq，2 × 300 bp，约100×覆盖度；基因组大小：4.135 Mbp；contigs：85个；N50：245 kb

2.4 水解酶平板筛选

将过夜LB培养物（OD₆₀₀ = 0.5，10 μL）点样于相应琼脂培养基上，37°C培养。水解圈以菌落直径加晕圈宽度测量。淀粉酶（淀粉-碘）、纤维素酶和木聚糖酶（CMC/木聚糖-刚果红）以及蛋白酶（脱脂牛奶）的培养基组成和染色方法均遵循标准方案。

【数据】点样量：10 μL；OD₆₀₀ = 0.5；培养温度：37°C

2.5 定量酶活测定与优化

T13在添加1%（w/v）特定底物（CMC、木聚糖、淀粉、酪蛋白）的基础培养基中培养。无细胞上清液中的酶活使用二硝基水杨酸（DNS）法测定内切葡聚糖酶、木聚糖酶、淀粉酶和FPase，使用对硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷测定β-葡萄糖苷酶，使用酪氨酸释放法测定蛋白酶。一个酶活单位（U）定义为在测定条件下每分钟释放1 μmol产物。温度（30–70°C）和pH（3–9）优化均设三次重复。完整时间过程数据及结果描述见补充图S3–S5。

【数据】底物浓度：1%（w/v）；温度范围：30–70°C；pH范围：3–9；重复次数：3次

2.6 木质素和Azure B降解测定

定性筛选在补充1 g/L木质素或0.13 g/L Azure B的MSM琼脂上进行。定量木质素降解：将含1 g/L木质素和2 g/L葡萄糖的MSM接种T13至初始OD₆₀₀为0.5，在37°C、150 rpm下有氧培养7天。设非生物对照。脱色率分别在280 nm（木质素）和663 nm（Azure B）处用分光光度法监测。为定量真实木质素去除量，通过离心（10,000 × g，10分钟）回收残留生物质，用蒸馏水洗涤三次，60°C干燥至恒重。取干燥颗粒（5–10 mg）进行乙酰溴溶解析：加入1 mL 25%（v/v）乙酰溴的冰醋酸溶液，70°C孵育1小时，每10分钟轻轻混匀。冰上冷却后，加入5 mL冰醋酸稀释并充分涡旋。室温静置1小时使颗粒物完全沉淀。取300 μL上清液转移至石英比色皿，加入400 μL 1.5 N NaOH和300 μL新鲜配制的0.5 M盐酸羟胺。轻轻吹打混匀后立即在280 nm处对照试剂空白读取吸光度。木质素含量使用消光系数23.585 L g⁻¹ cm⁻¹计算并校正稀释因子。所有测定设三次重复。包括香草醛和阿魏酸在内的芳香族代谢物，使用C18柱和乙腈-甲酸梯度通过HPLC鉴定和定量。

【数据】木质素浓度：1 g/L；Azure B浓度：0.13 g/L；葡萄糖：2 g/L；初始OD₆₀₀：0.5；培养条件：37°C，150 rpm，7天；离心：10,000 × g，10 min；干燥：60°C至恒重；乙酰溴浓度：25%（v/v）；孵育：70°C，1 h；NaOH：1.5 N，400 μL；盐酸羟胺：0.5 M，300 μL；消光系数：23.585 L g⁻¹ cm⁻¹；检测波长：280 nm（木质素）、663 nm（Azure B）

2.7 产氢发酵试验

批次发酵在250 mL血清瓶中进行，工作体积为100 mL基础培养基（pH 7.0），含（g/L）：NaH₂PO₄·H₂O 6.9，Na₂HPO₄ 7.1，NH₄Cl 3.0，FeSO₄·7H₂O 0.05，MgSO₄·7H₂O 0.05，酵母提取物（2.0 g/L，或在最低培养基试验中为0.5 g/L）和蛋白胨（1.0 g/L）。虽然添加有机氮源（酵母提取物、蛋白胨）以支持初始生长，但其浓度相对于标准培养基保持在较低水平（0.5–2 g/L），发酵过程中不进行额外pH控制。底物添加量为20 g总固体（TS）/L。食物垃圾和玉米秸秆均均质化并研磨至<2 mm，单独及以1:1（w/w）混合进行整合生物加工测试。接种物由T13过夜培养物制备，以1%（v/v）添加至初始OD₆₀₀为0.5。培养前，瓶子用氮气吹扫5分钟以确保厌氧条件，用丁基橡胶塞密封并压盖。发酵在37°C、搅拌（150 rpm）条件下进行4天。每种底物均设未接种对照。在食物垃圾上进行仅含无机盐的对照（不含酵母提取物或蛋白胨），以评估营养独立性。累计产氢量通过水置换法测定顶空气体体积，并使用配备热导检测器的气相色谱（GC-TCD；Agilent 490）分析气体组成。氢产量使用亨利定律在37°C下校正液相中溶解氢，报告为mL H₂/g挥发性固体（VS）和mol H₂/mol己糖当量（针对确定底物）。挥发性脂肪酸（VFAs）使用Aminex HPX-87H柱通过HPLC定量，流动相为5 mM H₂SO₄，流速0.6 mL/min，柱温60°C，检测方式为示差折光或210 nm紫外。发酵动力学拟合修正Gompertz方程（Eq-1），以确定最大产氢潜力（P）、最大产氢速率（Rm）和迟滞期（λ）。所有实验设三次重复。动力学用修正Gompertz方程建模：

Y(t) = P × exp{−exp[R × e/P × (λ − t) + 1]}

其中Y(t)为时间t（h）时的累计产氢量（mL），P为产氢潜力（mL），R为最大产氢速率（mL/h），λ为迟滞时间（h），e为欧拉数（2.71828）。模型通过非线性回归拟合实验累计产氢数据。所得参数基于每100 mL反应器添加2 g VS进行归一化，表示为mL/g VS和mL/g VS·h⁻¹。原始拟合参数（绝对单位mL和mL/h）见补充表S20。

【数据】发酵瓶规格：250 mL血清瓶；工作体积：100 mL；培养基成分（g/L）：NaH₂PO₄·H₂O 6.9，Na₂HPO₄ 7.1，NH₄Cl 3.0，FeSO₄·7H₂O 0.05，MgSO₄·7H₂O 0.05，酵母提取物2.0/0.5，蛋白胨1.0；pH 7.0；底物浓度：20 g TS/L；接种量：1%（v/v），OD₆₀₀ = 0.5；氮气吹扫：5 min；发酵条件：37°C，150 rpm，4天；GC-TCD：Agilent 490；HPLC柱：Aminex HPX-87H；流动相：5 mM H₂SO₄，0.6 mL/min，60°C

2.8 分析方法

食物垃圾组成（TS、VS、葡聚糖、木聚糖、木质素）按照标准LAP方案测定。木质素降解产物和VFAs按前述方法通过HPLC定量。所有实验设三次重复。数据以平均值±标准差表示。

【数据】重复次数：3次；数据表示：mean ± SD

研究结果

3.1 地衣芽孢杆菌T13的分离与鉴定

对厌氧消化污泥进行热激富集（80°C，3小时），随后在添加木质素的无机盐培养基中连续传代培养，获得多个分离株。菌株T13在木质素-MSM琼脂上产生最大的清晰透明圈（25 ± 2 mm），并在Azure B平板上于37°C培养72小时后产生明显脱色圈（图1a和b）。革兰氏染色显示为革兰氏阳性杆菌。产孢特性与分离过程中使用的热激选择步骤一致。16S rRNA测序和全基因组系统发育分析确认其为地衣芽孢杆菌。

【数据】热激条件：80°C，3 h；透明圈直径：25 ± 2 mm；培养条件：37°C，72 h

3.2 木质素解聚与代谢产物分析

在补充1 g/L木质素的液体MSM中，菌株T13在第4天达到最大OD₆₂₀为2.43 ± 0.12（图2a）。7天后，在280 nm处实现72.1 ± 4%的木质素脱色率，在663 nm处实现58.4 ± 3%的Azure B脱色率（图2b）。为确认脱色反映的是真正的木质素分解而非非特异性吸附或发色团修饰，对残留不溶性颗粒应用了乙酰溴溶解析方法（方法详见2.6节）。培养上清液的HPLC分析确认了木质素衍生芳香族单体的释放，在添加木质素的培养物中检测到阿魏酸（2.456 mg/L，保留时间8.33分钟）和香草醛（0.907 mg/L，保留时间8.39分钟）（表1）。这些代谢物在Azure B培养物中不存在或含量极低。

【数据】最大OD₆₂₀：2.43 ± 0.12（第4天）；木质素脱色率：72.1 ± 4%（280 nm，7天）；Azure B脱色率：58.4 ± 3%（663 nm，7天）；阿魏酸：2.456 mg/L（RT 8.33 min）；香草醛：0.907 mg/L（RT 8.39 min）

3.3 水解酶产生

T13在平板测定中表现出强水解活性，产生的水解圈分别为：蛋白酶33.2 ± 2 mm，纤维素酶29.1 ± 2 mm，淀粉酶24.5 ± 1 mm，木聚糖酶38.9 ± 2 mm（图3）。在不同温度（30–70°C）和pH（3–9）条件下的详细时间过程产生曲线见补充图S3–S5。峰值活性通常在50–60°C和pH 6–7时观察到。

【数据】蛋白酶水解圈：33.2 ± 2 mm；纤维素酶：29.1 ± 2 mm；淀粉酶：24.5 ± 1 mm；木聚糖酶：38.9 ± 2 mm；最适温度：50–60°C；最适pH：6–7

3.4 全基因组测序与注释

T13的草图基因组约为4.135 Mbp，GC含量46.75%，包含4854个编码序列（补充表S5）。针对NR、COG、KEGG和CAZy数据库的功能注释揭示了其强大的代谢谱系（图4）。直系同源群簇（COG）分析突出显示了参与氨基酸转运和代谢（18%）、能量产生和转化（12%）以及信号转导（8%）的基因（图4c）。KEGG通路分析将基因分为五个分支：代谢（如碳水化合物代谢，45%）、遗传信息处理（20%）、环境信息处理（15%）、细胞过程（10%）和生物体系统（5%）（图4b）。功能注释鉴定出编码多铜氧化酶（mco, yfiH）、AA10裂解性多糖单加氧酶、AA3氧化还原酶以及[FeFe]-氢化酶（hydA）与丙酮酸脱氢酶（pdhA）的基因（表2）。共检测到82个CAZymes（补充表S12）。泛基因组分析和关键附属基因详见补充表S7–9。基因座标签对应T13草图基因组组装。基因功能整合了CAZy、KEGG和结构域注释。AA6和CE1家族中的旁系同源扩增位于附属基因组中。

【数据】基因组大小：4.135 Mbp；GC含量：46.75%；编码序列：4854个；COG分类：氨基酸转运代谢18%，能量产生转化12%，信号转导8%；KEGG分类：碳水化合物代谢45%，遗传信息处理20%，环境信息处理15%，细胞过程10%，生物体系统5%；CAZymes总数：82个

3.5 系统发育与泛基因组分析

16S rRNA和基于SNP的核心基因系统发育分析证实地衣芽孢杆菌T13与参考菌株DSM 13和ATCC 14580紧密聚类（图5）。跨相关地衣芽孢杆菌菌株的泛基因组分析确定了约4200个基因的核心基因组，T13贡献了1503个附属基因（总泛基因组约5703个直系同源簇）。核心基因稀释曲线达到平台期，表明为封闭式泛基因组（图6）。T13特有的附属基因包括编码木质素降解酶（如多铜氧化酶）和应激耐受功能的基因，基因分布包括70%核心、20%外壳和10%云基因。基因组注释鉴定出一条紧凑的4.13–4.14 Mbp染色体，编码19个碳水化合物活性酶（CAZymes）功能模块和产氢基因。这些包括两个AA1、一个AA10、一个AA3、三个AA6、一个GH5、一个GH1、五个CE1、一个GH10、一个GH11、一个GH43、一个GH13和一个GH65家族成员，以及hydA（[FeFe]-氢化酶）和pdhA（丙酮酸脱氢酶）（表2）。

【数据】核心基因组：约4200个基因；T13附属基因：1503个；总泛基因组：约5703个直系同源簇；基因分布：70%核心，20%外壳，10%云基因；染色体大小：4.13–4.14 Mbp；CAZyme模块：19个

3.6 地衣芽孢杆菌T13在未处理食物垃圾和玉米秸秆上的产氢性能与动力学

地衣芽孢杆菌T13通过暗发酵在纯底物和复杂底物上均表现出高效的生物产氢能力，包括葡萄糖、木糖、羧甲基纤维素（CMC）、淀粉、食物垃圾和玉米秸秆，无需预处理或pH控制。产氢在24小时内达到峰值，葡萄糖和木糖的最高日产量分别为100 ± 7 mL和95.5 ± 8 mL。累计产量在木糖（228 ± 9 mL H₂/g VS）、葡萄糖（215 ± 9 mL H₂/g VS）和食物垃圾（213.3 ± 10 mL H₂/g VS）上最高，而CMC和淀粉分别为125 ± 8和115 ± 8 mL H₂/g VS。葡萄糖和木糖的摩尔产率分别达到0.085和0.070 mol H₂/mol己糖，与乙酸-丁酸发酵一致（图7，表3）。挥发性脂肪酸（VFA）谱以乙酸（1.9–2.4 g/L）和丁酸（0.9–1.8 g/L）为主，乙酸/丁酸比为2.1–2.7，表明电子流向有利于产氢，而低丙酸水平（≤0.6 g/L）最大程度减少了电子分流。T13有效利用未处理的食物垃圾和玉米秸秆，在食物垃圾上实现203 ± 8 mL H₂/g VS，在玉米秸秆上实现70 ± 5 mL H₂/g VS，在其共底物混合物上实现107 ± 6 mL H₂/g VS（图8）。混合物相对于单独玉米秸秆的产率提高了53%，表明存在协同效应，可能由于食物垃圾增强了缓冲能力和营养供应，减轻了木质纤维素的顽抗性。VFA产生与此趋势一致：食物垃圾发酵产生2.2 ± 0.2 g/L乙酸和1.3 ± 0.2 g/L丁酸，表明高效水解和典型产酸过程，而单独玉米秸秆产生较低水平（1.8 ± 0.3 g/L乙酸；1.0 ± 0.2 g/L丁酸），反映出有限的糖化作用。共发酵系统产生中等VFA浓度（2.0 ± 0.2 g/L乙酸；1.15 ± 0.2 g/L丁酸），丙酸始终低于0.25 g/L，证实了代谢稳定性。为进行跨底物比较，基于测得的葡聚糖和木聚糖含量（补充表S16），将氢产量归一化为可发酵碳水化合物含量。使用NREL脱水校正因子（葡聚糖：0.90，木聚糖：0.88），食物垃圾每公斤干重含15.6 g可发酵碳水化合物。食物垃圾的产率达到1.71 mol H₂/mol己糖当量，显著高于玉米秸秆（1.15 mol H₂/mol己糖当量），凸显了T13在获取和转化复杂底物方面的高效性。该归一化揭示T13达到了与预处理生物质上工程菌株相当的生化和效率。

【数据】葡萄糖日产量峰值：100 ± 7 mL；木糖日产量峰值：95.5 ± 8 mL；累计产量：木糖228 ± 9，葡萄糖215 ± 9，食物垃圾213.3 ± 10，CMC 125 ± 8，淀粉115 ± 8 mL H₂/g VS；摩尔产率：葡萄糖0.085，木糖0.070 mol H₂/mol己糖；乙酸：1.9–2.4 g/L；丁酸：0.9–1.8 g/L；乙酸/丁酸比：2.1–2.7；丙酸：≤0.6 g/L；食物垃圾产氢：203 ± 8 mL H₂/g VS；玉米秸秆：70 ± 5 mL H₂/g VS；共底物：107 ± 6 mL H₂/g VS；产率提升：53%；食物垃圾VFA：乙酸2.2 ± 0.2 g/L，丁酸1.3 ± 0.2 g/L；玉米秸秆VFA：乙酸1.8 ± 0.3 g/L，丁酸1.0 ± 0.2 g/L；共发酵VFA：乙酸2.0 ± 0.2 g/L，丁酸1.15 ± 0.2 g/L；丙酸：<0.25 g/L；食物垃圾可发酵碳水化合物：15.6 g/kg干重；食物垃圾产率：1.71 mol H₂/mol己糖当量；玉米秸秆产率：1.15 mol H₂/mol己糖当量

讨论与解读

地衣芽孢杆菌T13展示了木质素修饰和产氢表型的罕见整合，使其成为顺序木质素解聚和产氢的有前景候选菌株。虽然未进行直接孢子染色或耐热性测定，但T13被鉴定为地衣芽孢杆菌——该物种被一致报道能形成耐热内生孢子——支持其在热激富集后恢复的生物学合理性。观察到的72.1%木质素脱色率与先前芽孢杆菌属木质素解聚活性的报道一致，但效率通常更高——例如，枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌对合成木质素衍生物的脱色率为40–60%，通常归因于漆酶或过氧化物酶活性。本研究中通过HPLC检测到阿魏酸和香草醛，确认了天然木质素解聚为可识别的芳香族单体。基因组中鉴定出的多铜氧化酶（mco, yfiH）和辅助活性酶，特别是AA10裂解性多糖单加氧酶（LPMOs），为此活性提供了机制基础。AA10酶虽然在细菌中更常与几丁质和纤维素氧化相关，但越来越多地与木质素-碳水化合物复合物的降解相关联。

编译者解读

该研究的意义在于将木质素降解与暗发酵产氢整合于单一菌株，避免了传统多菌群协同中菌群比例失衡的难题。T13对未处理底物的直接利用能力——尤其是食物垃圾与玉米秸秆共发酵时53%的产率提升——展示了实际应用中"以废治废"的潜力。但需注意，其木质素解聚（有氧）与产氢（厌氧）分属不同阶段，所谓"顺序整合"仍需两阶段操作。此外，产氢摩尔产率（0.042–0.089 mol/mol己糖）仍远低于理论值，且未涉及预处理后抑制物耐受性评估。未来若能在单一反应器中实现氧调控的时空切换，或通过适应性进化进一步提升木质素解聚速率，该菌株的工程应用价值将更为突出。

参考来源

Shah TA. Bacillus licheniformis T13: A bifunctional strain for sequential lignin depolymerization and biohydrogen production from agro-wastes. Renewable Energy, 2026. DOI: 10.1016/j.renene.2026.126258

DOI: 10.1016/j.renene.2026.126258