来源：Cloning and expression of a β-mannanase gene from Bacillus sp. MK-2 and its directed evolution by random mutagenesis（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
β-甘露聚糖酶在食品、饲料、造纸及生物精炼等领域应用广泛，但野生型酶普遍存在比活性低、热稳定性不足等缺陷，制约其工业化应用。本研究从 Bacillus sp. MK-2 中克隆得到一个 GH26 家族 β-甘露聚糖酶基因 Bman26，并在枯草芽孢杆菌 WB800 中实现高效异源表达，随后通过易错 PCR 随机突变结合高通量筛选，获得三个比活性显著提升的正向突变体。其中最优突变体 K291E 的 kcat/Km 值较野生型提高 3.5 倍。结构分析揭示了影响比活性与热稳定性的关键氨基酸位点，为工业用 β-甘露聚糖酶的分子改造提供了新靶点。
研究背景
内切-1,4-β-甘露聚糖酶（EC3.2.1.78）随机切割甘露聚糖主链中的 β-1,4-甘露糖苷键，释放不同长度的直链和支链甘露寡糖。甘露寡糖已被证明有利于乳酸菌和双歧杆菌的生长；β-甘露聚糖酶还能降低甘露聚糖的抗营养因子效应，促进玉米-豆粕型禽饲料的利用。此外，该酶在造纸、纸浆工业以及椰干和咖啡废料回收中均有广泛应用，市场需求持续增长。
尽管β-甘露聚糖酶基因已从细菌、真菌、植物和软体动物等多种生物中克隆获得，但能满足生物精炼工业高要求的酶寥寥无几。野生型β-甘露聚糖酶即使在最适温度和 pH 条件下，比活性仍维持在较低水平，这意味着生产成本居高不下。分子工程——包括随机突变和理性设计——已被证明是开发优良酶制剂的有效手段，但针对 β-甘露聚糖酶比活性提升的研究仍然有限。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养基
本研究所用 Bacillus sp. MK-2（MK-2）保存于中国农业微生物菌种保藏中心（ACCC），保藏编号为 ACCC19935。枯草芽孢杆菌 WB800 和质粒 pP43NMK 分别作为 β-甘露聚糖酶过表达的表达宿主和表达质粒。大肠杆菌 DH5α 用于质粒扩繁。台盼蓝固体培养基（0.5% 酵母提取物、1% 蛋白胨、0.5% NaCl、0.1% 魔芋葡甘聚糖、0.01% 台盼蓝、1.5% 琼脂）用于高产突变株的高通量筛选。β-甘露聚糖酶生产的超富培养基成分如下：2.0% 酵母提取物、2.5% 蛋白胨、0.3% 磷酸氢二钾、3.0% 葡萄糖。
【数据】菌株：Bacillus sp. MK-2（ACCC19935）、Bacillus subtilis WB800、E. coli DH5α；培养基：台盼蓝固体培养基、超富培养基（2.0% 酵母提取物、2.5% 蛋白胨、0.3% K2HPO4、3.0% 葡萄糖）
2.2 MK-2 的分离与鉴定
MK-2 接种于 Luria-Bertani 培养基（每升蒸馏水含 10 g 胰蛋白胨、10 g NaCl、5 g 酵母提取物），在摇床上好氧培养（37°C、180 rpm）约 24 h。使用基因组 DNA 提取试剂盒（Axygen，中国江苏）提取 MK-2 基因组 DNA，作为模板，用通用引物 27F/1492R 扩增 16S rDNA。基于 BLAST 序列比对结果，使用 MEGA5.0 构建系统发育树。
【数据】培养条件：37°C、180 rpm、约 24 h；培养基：LB 培养基；引物：27F/1492R
2.3 β-甘露聚糖酶基因的测序与分析
以引物对 P1/P2（根据已报道的 β-甘露聚糖酶基因（GenBank 登录号 CAB12407.2）设计）从 MK-2 基因组 DNA 扩增 DNA 片段，测序后使用开放阅读框（ORF）Finder、SignalP4.0 和 NEBcutterV2.0 进行分析。β-甘露聚糖酶的氨基酸序列由 EMBOSS Transeq 推导，并进一步使用 ProtParam 和 ProtScale 分析。引物对 P3/P4 用于扩增不含信号肽序列的 β-甘露聚糖酶基因。目的基因通过 T4 连接酶连接到质粒 pP43NMK 中，转化大肠杆菌 DH5α。阳性克隆中的重组质粒 pP43NMK-Bman26 用质粒提取试剂盒（Axygen，中国江苏）提取，并经测序进一步确认。
【数据】引物：P1/P2、P3/P4；工具：ORF Finder、SignalP4.0、NEBcutterV2.0、EMBOSS Transeq、ProtParam、ProtScale；连接酶：T4 连接酶
2.4 β-甘露聚糖酶基因在枯草芽孢杆菌 WB800 中的表达
为实现 β-甘露聚糖酶的高产，将 pP43NMK-Bman26 转化至枯草芽孢杆菌 WB800 感受态细胞。阳性转化子在上述台盼蓝固体培养基平板上筛选，菌落周围形成透明水解圈。同时，含有重组质粒（pP43NMK-Bman26）的阳性转化子通过 DNA 测序确认。合适的转化子在超富培养基中于 37°C、220 rpm 摇瓶培养 168 h，收集上清液进行 β-甘露聚糖酶活性测定。
【数据】培养条件：37°C、220 rpm、168 h；培养基：超富培养基；筛选方法：台盼蓝平板透明圈
2.5 突变文库构建与高通量筛选
突变文库采用易错 PCR（epPCR）方法构建，参照文献并略作修改。具体而言，使用 Instant error-prone PCR Kit（TIANDZ，中国北京）以引物对 P3/P4 对 Bman26 进行易错 PCR，根据用户手册将突变率控制在每个基因 2.0 bp 替换。质粒 pP43NMK-Bman26 通过高保真 PCR 用引物对 P5/P6 线性化。前述过程中获得的两种 PCR 片段经凝胶回收纯化，用于制备质粒多聚体。多聚化过程使用高保真 PCR 进行（dNTP 各 0.2 mM；易错 PCR 产物 5 ng μL⁻¹；PCR 线性化 pP43NMK-Bman26 0.3 ng μL⁻¹；聚合酶 0.06 U μL⁻¹），条件如下：95°C 变性 1 min；20 个循环的 95°C 变性 15 s、72°C 退火延伸 7 min；15 个循环的 95°C 变性 15 s、72°C 退火延伸 14 min；最后 72°C 延伸 10 min。随后将多聚体转入枯草芽孢杆菌 WB800，涂布于含 10 μg/mL 卡那霉素的台盼蓝固体培养基平板上。同时制备 pP43NMK-Bman26 多聚体并转入枯草芽孢杆菌 WB800 作为对照。37°C 培养 16 h 后，挑取选择培养基上透明圈较大的阳性转化子，接种于含 1 mL 液体超富培养基的 48 深孔板中进行第一轮筛选。37°C、220 rpm 培养 48 h 后，测定每孔酶活性，酶活性明显提高（提高 30% 以上）的阳性克隆进入第二轮筛选——在含 20 mL 超富培养基的 100 mL 摇瓶中培养 168 h（37°C、220 rpm）。
【数据】突变率：2.0 bp/基因；dNTP：各 0.2 mM；epPCR 产物：5 ng μL⁻¹；线性化质粒：0.3 ng μL⁻¹；聚合酶：0.06 U μL⁻¹；卡那霉素：10 μg/mL；第一轮筛选：48 深孔板、1 mL 培养基、37°C、220 rpm、48 h；第二轮筛选：100 mL 摇瓶、20 mL 培养基、168 h；筛选阈值：酶活性提高 30% 以上
2.6 β-甘露聚糖酶的分分离纯化
BsP43-Bman26 及其阳性转化子（在超富培养基中 37°C 培养 144 h）的无细胞粗上清液通过 12,000 ×g、4°C 离心 10 min 收集。上清液加入固体硫酸铵至 80%（w/v）饱和度，4°C 放置过夜。沉淀重新溶解并对蒸馏水透析脱盐。蛋白质进一步通过 Ni sepharose 6 FF 柱（GE Healthcare，美国）纯化。His 标签融合蛋白用 50–150 mM 浓度梯度的咪唑洗脱。收集活性组分，对 50 mM 磷酸钾缓冲液（pH 6.0）透析，并在含 1 mM DTT（DL-二硫苏糖醇）的条件下于 4°C 保存。纯化蛋白通过 SDS-PAGE（12% 分离胶）检测。蛋白质浓度采用 Bradford 法测定，以牛血清白蛋白为标准。
【数据】离心：12,000 ×g、4°C、10 min；硫酸铵饱和度：80%（w/v）；咪唑浓度：50–150 mM；透析缓冲液：50 mM 磷酸钾缓冲液（pH 6.0）；DTT：1 mM；SDS-PAGE：12% 分离胶；蛋白定量：Bradford 法
2.7 酶活性测定
β-甘露聚糖酶活性通过测定底物释放的还原糖量来确定，使用 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂。标准反应体系含 0.4 mL 适当稀释的酶液和 0.4 mL 含 0.5%（w/v）魔芋葡甘聚糖的磷酸盐缓冲液（pH 6.0）。55°C 孵育 10 min 后，加入 0.4 mL DNS 试剂终止反应，煮沸 10 min。还原糖量通过测定 540 nm 处吸光度进行比色定量，以甘露糖（Sigma）为标准。1 个单位（U）的 β-甘露聚糖酶活性定义为每分钟释放 1 μmol 还原糖（以 D-甘露糖计）所需的酶量。
【数据】底物：0.5%（w/v）魔芋葡甘聚糖；缓冲液：磷酸盐缓冲液（pH 6.0）；反应温度：55°C；反应时间：10 min；检测波长：540 nm；酶活单位定义：1 U = 1 μmol 还原糖/min
2.8 生化特性表征
酶的最适温度在磷酸盐缓冲液（pH 6.0）中于 30–80°C 温度范围内测定。热稳定性通过将纯化酶在磷酸盐缓冲液（pH 6.0）中于 40–70°C 不同温度下预孵育 30 min 后测定残余活性来考察。β-甘露聚糖酶的最适 pH 在 55°C 下使用不同缓冲液测定，包括柠檬酸钠缓冲液（pH 3.0–6.0）、磷酸钠缓冲液（pH 6.0–8.0）和甘氨酸-NaOH 缓冲液（pH 9.0–10.0），以 0.5%（w/v）魔芋葡甘聚糖为底物。pH 稳定性测定时，将酶与缓冲液（pH 3.0–9.0）在 4°C 孵育 30 min，然后在标准条件下测定残余活性。为考察不同金属离子和化学试剂对纯化重组 β-甘露聚糖酶的影响，在含 2 mM K⁺、Na⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Sn²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Ni²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺、NH₄⁺、Ba²⁺、Li⁺、Ag⁺、SDS、尿素和 EDTA 的条件下进行酶活性测定。酶活性在 55°C、pH 6.0 条件下测定。不添加任何离子和化学试剂的反应组作为对照。重组 β-甘露聚糖酶的 Km、Vmax 和 kcat 值使用 1–10 mg mL⁻¹ 的底物浓度测定。
【数据】最适温度测定范围：30–80°C；热稳定性测定范围：40–70°C、30 min；最适 pH 测定缓冲液：柠檬酸钠（pH 3.0–6.0）、磷酸钠（pH 6.0–8.0）、甘氨酸-NaOH（pH 9.0–10.0）；pH 稳定性测定：pH 3.0–9.0、4°C、30 min；金属离子/试剂浓度：2 mM；动力学参数测定底物浓度：1–10 mg mL⁻¹
研究结果
3.1 MK-2 的分离与鉴定
产甘露聚糖酶菌株从中国不同省份采集的土壤样品中分离获得。基于唯一碳源培养和魔芋粉平板透明圈筛选，选择甘露聚糖酶活性最高的菌株进行进一步研究。根据其 16S rDNA 序列的系统发育分析（图1），该菌株归属于芽孢杆菌属，命名为 Bacillus sp. MK-2。
【数据】菌株来源：中国不同省份土壤样品；筛选方法：唯一碳源培养 + 魔芋粉平板透明圈
3.2 来自 Bacillus sp. MK-2 的 β-甘露聚糖酶基因克隆与序列分析
β-甘露聚糖酶基因的 ORF 长度为 1104 bp，编码 367 个氨基酸。该 β-甘露聚糖酶的氨基酸序列命名为 Bman26。SignalP 分析表明，信号肽最可能的切割位点位于 Ala31 和 His32 之间。ProtParam 推导的成熟蛋白分子量（Mw）和等电点（pI）分别为 38.04 kDa 和 5.46。蛋白质 BLAST 分析显示，Bman26 的氨基酸序列与大多数来自枯草芽孢杆菌的 β-甘露聚糖酶具有高度序列同一性（94–99%），但其中只有少数通过异源表达被鉴定和表征。保守结构域分析显示，该 β-甘露聚糖酶属于糖苷水解酶家族 26（GH26）。在图2所示的保守氨基酸中，通过 Phyre2 分析在 336 个氨基酸内发现了 9 个活性位点（Phe37-Tyr40-Trp72-His105-Tyr242-Trp298-Trp302）和 2 个催化位点（Glu167-Glu266）。Glu198 和 Glu297 分别充当催化质子供体和亲核试剂。
【数据】ORF 长度：1104 bp；氨基酸数：367 aa；信号肽切割位点：Ala31-His32；分子量：38.04 kDa；pI：5.46；序列同一性：94–99%；GH 家族：GH26；活性位点：9 个；催化位点：Glu167-Glu266
3.3 β-甘露聚糖酶在枯草芽孢杆菌 WB800 中的表达与纯化
为实现高水平表达，Bman26 在 P43 启动子驱动下于枯草芽孢杆菌 WB800 中表达。优良转化子（命名为 BsP43-Bman26）接种于超富液体培养基，37°C 培养 168 h。如图3所示，在 P43 启动子控制下，β-甘露聚糖酶活性在前 144 h 持续积累，达到最大活性 2852 U mL⁻¹，是野生型菌株 MK-2 摇瓶培养产量（173.7 U mL⁻¹）的 15.4 倍。SDS-PAGE 对枯草芽孢杆菌 WB800 和 BsP43-Bman26 上清液蛋白的比较分析表明，重组 β-甘露聚糖酶的分子量约为 41 kDa，与纯化酶的分子量一致（图4a）。同时，纯化的突变体与野生型酶表现出相似的分子量（图4b）。
【数据】最大酶活：2852 U mL⁻¹（144 h）；野生型 MK-2 产量：173.7 U mL⁻¹；产量提高倍数：15.4 倍；分子量：约 41 kDa
3.4 重组 β-甘露聚糖酶的一般性质
重组 β-甘露聚糖酶的最适温度为 55°C（图5a），在 50–60°C 范围内，酶保持最大活性的 85% 以上。热稳定性分析显示，重组酶在 50°C 孵育 30 min 后稳定，约 85% 的酶活性得以保留。60°C 孵育 30 min 后，仅约 10% 的酶活性保留。然而，70°C 孵育 30 min 后，总酶活性的 95% 丧失（图5b）。重组酶的最适 pH 为 6.0，在 pH 5.0–7.0 范围内观察到最高活性的 80%，而 pH 低于 5.0 或高于 7.0 时酶活性显著下降（图5c）。酶在 pH 4.0–5.0 范围内稳定，30 min 内保留 85% 以上的活性（图5d）。各种金属离子和化学试剂对 Bman26 酶活性的影响见表2。Bman26 的酶活性被化学试剂 EDTA 和 SDS 强烈抑制。Na⁺、Zn²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Ni²⁺、Fe³⁺ 和 Ba²⁺ 等离子似乎损害酶活性，其中 Zn²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺ 和 Ni²⁺ 抑制 Bman26 达 20–80%。K⁺、Co²⁺ 和 Mn²⁺ 存在下观察到部分激活（8–20%）。5 mM Sn²⁺ 和 Ag⁺ 诱导更明显的增强效果（63–126%）。纯化的重组 Bman26 对魔芋葡甘聚糖表现出最大活性（100%），对 LBG 表现出中等活性（76%），对淀粉或果胶作为底物无活性。因此，使用魔芋葡甘聚糖作为底物测定重组 β-甘露聚糖酶的动力学参数。如表3所示，纯化的 β-甘露聚糖酶比活性为 2802 U mg⁻¹。Bman26 的 Km 和 Vmax 值分别为 4.5 mg mL⁻¹ 和 5000 μmol min⁻¹ mg⁻¹。
【数据】最适温度：55°C；50–60°C 保留活性：>85%；50°C/30 min 残余活性：约 85%；60°C/30 min 残余活性：约 10%；70°C/30 min 活性丧失：95%；最适 pH：6.0；pH 5.0–7.0 活性：最高活性的 80%；pH 4.0–5.0/30 min 残余活性：>85%；EDTA 和 SDS：强烈抑制；Zn²⁺、Cu²⁺、Ca²⁺、Ni²⁺ 抑制率：20–80%；K⁺、Co²⁺、Mn²⁺ 激活率：8–20%；Sn²⁺、Ag⁺（5 mM）激活率：63–126%；魔芋葡甘聚糖相对活性：100%；LBG 相对活性：76%；比活性：2802 U mg⁻¹；Km：4.5 mg mL⁻¹；Vmax：5000 μmol min⁻¹ mg⁻¹
3.5 突变体的筛选、生化表征及对魔芋葡甘聚糖的动力学参数
为提高比活性，采用易错 PCR 在枯草芽孢杆菌 WB800 中对 Bman26 进行定向进化。含有约 10,000 个克隆的突变文库用台盼蓝固体培养基平板预筛选。与亲本酶（Bman26）相比，超过 10% 的克隆显示出更大的水解圈。每块平板上 Bman26 的水解圈直径为 5–6 mm。选择水解圈较大（直径 8 mm 以上）的克隆进行 48 深孔板第一轮筛选，随后在含 25 mL 超富液体培养基的 100 mL 摇瓶中进行第二轮筛选。三个表现出明显改善酶活性的正向变异体被选作进一步研究。如图3所示，摇瓶培养 144 h 后，三个阳性克隆（命名为 BsP43-Q112R、BsP43-L211I、BsP43-K291E）的最大活性分别为 10,129 U mL⁻¹、11,848 U mL⁻¹ 和 9747 U mL⁻¹。BsP43-L211I 的表达水平是 BsP43-Bman26 的 3.15 倍。在 pH 和温度谱方面，变异体与亲本酶之间未观察到显著差异（图5）。如表3所示，三个阳性突变体的比活性较亲本酶大幅提高。这也说明突变位点（Q143、L242 和 K322）与 Bman26 的比活性密切相关。基于 Lineweaver-Burk 方法，在标准条件下（pH 6.0、55°C）以魔芋葡甘聚糖为底物计算 Bman26 及其突变体的 Km 和 Vmax 值。Bman26 的 Km 和 kcat 分别为 4.5 mg mL⁻¹ 和 767.41 mL s⁻¹ mg⁻¹。突变体 K291E 的 Km 为 3.3 mg mL⁻¹，为最低值；突变体 K291E 的 kcat 为 11,511.34 s⁻¹，为最高值。就催化效率而言，表现最佳的突变体是 K291E，其单氨基酸替换使 kcat/Km 提高了 3.5 倍。突变体 Q112R 和 L211I 对魔芋葡甘聚糖的 kcat/Km 也呈现明显增加，分别提高约 200% 和 80%。
【数据】突变文库规模：约 10,000 个克隆；更大水解圈克隆比例：>10%；Bman26 水解圈直径：5–6 mm；筛选阈值：>8 mm；BsP43-Q112R 最大活性：10,129 U mL⁻¹；BsP43-L211I 最大活性：11,848 U mL⁻¹；BsP43-K291E 最大活性：9747 U mL⁻¹；BsP43-L211I 表达水平：BsP43-Bman26 的 3.15 倍；Bman26 Km：4.5 mg mL⁻¹；Bman26 kcat：767.41 mL s⁻¹ mg⁻¹；K291E Km：3.3 mg mL⁻¹；K291E kcat：11,511.34 s⁻¹；K291E kcat/Km 提高：3.5 倍；Q112R kcat/Km 提高：约 200%；L211I kcat/Km 提高：约 80%
3.6 突变酶的结构分析
基于已报道的 BCman（2qha）结构（与 Bman26 有 99% 序列同一性）对 Bman26 进行三维结构建模。与 GH26 β-甘露聚糖酶 BCman 一样，Bman26 的结构是典型的（β/α）₈ 折叠类型，呈现出浅碟状活性中心（图6a）。催化酸/碱 Glu167 和亲核试剂 Glu266 位于 β4 和 β7 链上（图6b）。根据 Bman26 的结构，四个替换位点（G88S、K288R、Q112R 和 K291E）位于酶表面，另外两个替换位点（L212I 和 L211I）位于内部空间。具体而言，G88 和 K288 位于 α4 和 α6 螺旋上；L211 和 L212 位于 β5 链上；Q112 和 K291 分别位于环区 104–121 和 289–294 上。此外，突变体 K291E 替换位点的表面电荷从正电变为负电。通过 I-mutant 2.0 程序计算三个单点替换的 DDG 值，结果表明 S88G、I212L 和 R288K 可能降低 BCman 的热稳定性，DDG 值分别为 -1.51、-0.55 和 -0.52。
【数据】结构同源性：与 BCman（2qha）99% 序列同一性；折叠类型：（β/α）₈；催化残基：Glu167（酸/碱）、Glu266（亲核试剂）；DDG 值：S88G -1.51、I212L -0.55、R288K -0.52
讨论与解读
β-甘露聚糖酶因其广泛的工业应用而备受关注，但野生型酶通常存在酶学性质缺陷，制约了其工业应用。本研究从 Bacillus sp. MK-2 中克隆获得一个 GH26 家族 β-甘露聚糖酶基因 Bman26。与来自嗜热真菌 Myceliophthora thermophila 的 GH26 β-甘露聚糖酶不同，Bman26 不含 CBM 模块，是非模块化蛋白。结构分析显示，Bman26 与 BCman 之间仅存在三个氨基酸差异（Gly88-Leu212-Lys288 对应 BCman 的 Ser88-Ile212-Arg288），但 BCman 的热稳定性（80°C 孵育 2 h 保留 80% 活性）远优于 Bman26。I-mutant 2.0 计算表明，S88G、I212L 和 R288K 替换均降低热稳定性（DDG 值分别为 -1.51、-0.55 和 -0.52），证实这三个位点与酶的热稳定性密切相关。通过定向进化获得的三个突变体（Q112R、L211I、K291E）在保持相似 pH 和温度谱的同时，比活性和催化效率大幅提升，其中 K291E 的 kcat/Km 提高 3.5 倍，表明表面电荷改变可显著影响催化效率。
编译者解读： 本研究采用"理性筛选+随机突变"组合策略，在获得高表达重组酶的基础上进行定向进化，思路清晰且实用性强。K291E 突变使表面电荷由正转负的发现值得关注——这提示酶分子表面的静电环境对催化效率有不可忽视的影响。不过，研究对突变体热稳定性与比活性之间的权衡关系着墨较少，三个位点（Gly88-Leu212-Lys288）与热稳定性的关联主要依赖计算预测，缺乏实验验证。后续若能结合定点突变验证这些位点的实际贡献，将更完整地支撑其工业应用潜力。
参考来源
Zhang W. Cloning and expression of a β-mannanase gene from Bacillus sp. MK-2 and its directed evolution by random mutagenesis. Enzyme and Microbial Technology, 2019. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2019.02.003
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2019.02.003