来源：Insight into novel biochemical features and function of novel antifungal GH16-β-glucanase from Bacillus velezensis（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
真菌细胞壁的核心结构成分是β-葡聚糖，降解这一屏障已成为生物防治的重要策略。本研究从贝莱斯芽孢杆菌CECT 8237中鉴定并表征了一种新型GH16家族β-1,3-葡聚糖酶BvlzGluc。该酶具有严格的底物专一性，能高效降解灰葡萄孢菌细胞壁中的高分子量β-葡聚糖，抑制孢子萌发、破坏菌丝完整性并降低植物体内的致病力。结构建模与定点突变揭示其缺乏经典催化沟槽的非典型特征，为理解最小化酶结构在生防策略中的价值提供了新视角。
研究背景
β-葡聚糖是真菌细胞壁中的主要多糖，由β-1,3和β-1,6糖苷键构成纤维状网络，为细胞壁提供结构完整性和机械强度。β-1,3-葡聚糖形成的螺旋结构充当支架，β-1,6连接则将螺旋交联成高度网状化的基质。这种组合赋予真菌细胞壁抵抗环境胁迫和渗透压的能力，并在出芽、菌丝生长和孢子形成等过程中维持细胞壁完整性。
β-葡聚糖酶属于糖苷水解酶家族，催化β-葡聚糖中糖苷键的水解，生成低聚糖或葡萄糖。根据作用方式不同，可分为内切-β-1,4-葡聚糖酶、内切-β-1,3(4)-葡聚糖酶等多种类型。微生物来源的β-葡聚糖酶在真菌病害防控中展现出应用潜力，但对其底物识别机制和结构基础的认知仍不充分。本研究从B. velezensis CECT 8237基因组文库中筛选到具有抗真菌活性的分泌蛋白BvlzGluc，并对其进行了系统的生化与功能解析。
研究方法
2.1 植物材料
甜瓜植株（Cucumis melo；品种Rochet Panal）由种子（Semillas Fitó）培育，培养条件为25°C、60%相对湿度，光源为荧光灯和白炽灯，光通量率约120 μmol m⁻² s⁻¹，光周期12/12小时。
2.2 真菌菌株——培养与植物接种
灰葡萄孢（Botrytis cinerea）分离株B05.10在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA，Oxoid）上培养，培养箱条件为20°C、荧光灯照明、光通量率12 μmol m⁻² s⁻¹、光周期12/12小时。分生孢子从光照培养的培养基上用含0.001%（v/v）Triton X-100（J.T. Baker）的无菌蒸馏水收集，经40-μm细胞筛过滤去除残余菌丝。细胞生物学研究使用在马铃薯葡萄糖肉汤（PDB，Scharlau）中萌发的分生孢子，接种孢子悬浮液后于28°C、150 rpm振荡培养24小时。
B. cinerea植物接种按此前描述的方法进行。简要而言，将分生孢子悬浮液调整至10⁵ conidia mL⁻¹，溶剂为半强度过滤（0.45 μm）的葡萄汁（100%纯有机）。选用5–6周龄甜瓜植株，每片叶接种5-μl孢子悬浮液滴（5×10²个分生孢子）。植株覆盖塑料拱罩后置于生长箱中。接种后72小时对叶片成像，使用ImageJ 2.0软件分析病斑大小。
2.3 B. cinerea B05.10胁迫分析：活性组分鉴定与临界浓度估算
对B. cinerea B05.10进行胁迫分析以鉴定具有抗菌活性的克隆上清液。所有克隆在LB培养基中于37°C、150 rpm培养24小时。随后收集上清液，过滤灭菌，与B. cinerea萌发孢子共同孵育于96孔微量培养板中。以10 mM过氧化氢作为阳性对照分析活性氧（ROS）产生。ROS检测使用二氢罗丹明123（DHR123，Sigma–Aldrich）。荧光用酶标仪（FluoStar Omega，BMG LabTech）记录，激发滤光片485 nm，发射波长520 nm，每10分钟读数一次，持续24小时。当阳性对照达到饱和时终止实验。
2.4 序列分析
在fosmid克隆片段中搜索可能分泌的蛋白质，采用此前描述的工作流程。使用SignalP搜索含信号肽的蛋白质，使用TMHMM鉴定无跨膜结构域的蛋白质，使用DeepLoc筛选预测为胞外亚细胞定位的蛋白质。最后对选定的蛋白质进行保守结构域综合搜索以鉴定可能对其活性至关重要的功能基序。此外，使用HMMER搜索CAZy来源的GH16隐马尔可夫模型进行结构域注释。BvlzGluc与GH16谱系显示出高度显著匹配（E值<1e–40），支持其归入该家族。多序列比对通过CLC Main Workbench（Aarhus）进行。系统发育分析使用MEGA软件（v.11）完成，以MUSCLE作为比对算法。系统发育树构建采用最大似然统计方法，基于泊松校正模型。系统发育检验采用bootstrap方法，1000次重复。
2.5 B. velezensis CECT 8237 BvlzGluc的体外表达与纯化
使用引物7685F44F（5´-AAAAAGCAGGCTCTATGCGTAAAAAAATCTTAATGGCACTC-3′）和7685F44-R（5´-AGAAAGCTGGGTTTATCGATTAATTTTAAAAGAGTTTGTCG-3′）扩增BAMY6639_07685（GenBank登录号AMQ71412）编码序列。扩增片段克隆至入门载体pDONR207，随后通过Gateway®克隆技术（Invitrogen）转移至目的载体pDEST17，该载体在蛋白N端引入六个组氨酸标签。
BvlzGluc表达时，将含编码序列的pDEST17质粒通过热激法转化至化学感受态E. coli BL21-AI细胞（Invitrogen）。当OD600nm达到0.4时，加入10 mM阿拉伯糖（Sigma–Aldrich）诱导蛋白表达。细胞于37°C孵育3小时，离心收集。细胞沉淀经液氮冷冻后于−80°C保存过夜以提高蛋白回收率。
蛋白纯化时，将细胞沉淀解冻，重悬于裂解缓冲液（1×CellLytic™ B-Cell Lysis Reagent [Sigma–Aldrich]、1 mM蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）和0.2 mg mL⁻¹溶菌酶）中，室温孵育1小时；剩余细胞用UP100H超声破碎仪（Hielscher）在冰上超声破碎。粗裂解液经8000 ×g离心10分钟澄清。所得上清液经0.45-μm滤膜过滤后，使用AKTA Start FPLC系统（GE Healthcare）进行亲和层析纯化。裂解液上样至HisTrap HP 5 mL柱（GE Healthcare），该柱预先用结合缓冲液（50 mM Na₃PO₄ [pH 8]、0.5 M NaCl和10 mM咪唑）平衡。蛋白用洗脱缓冲液（50 mM Na₃PO₄ [pH 8]、0.5 M NaCl、500 mM咪唑）洗脱。随后将纯化蛋白上样至HiPrep 26/10脱盐柱（GE Healthcare），将缓冲液置换为20 mM Tris-HCl（pH 8）和50 mM NaCl。最后用Pierce® Concentrators 20K MWCO（Thermo Scientific）超滤浓缩，于−20°C保存待分析。
进一步分析前，表达蛋白经western blotting表征。免疫印迹分析时，纯化蛋白经12% SDS–PAGE电泳后，使用Trans-Blot Turbo电转仪（Bio–Rad）转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。以1:1000稀释的兔单克隆抗His标签抗体（Rockland） probing。膜随后与1:20000稀释的辣根过氧化物酶偶联抗兔抗体（Bio-Rad）孵育，通过增强化学发光（ECL）western blotting分析系统（Thermo Scientific）进行化学发光检测显色。
2.6 萌发率与芽管长度测定
为估算萌发率和测量芽管长度，先按上述方法收集B. cinerea孢子悬浮液，调整孢子浓度。将孢子接种于水琼脂培养基（无菌培养皿中），存在或不存在BvlzGluc，均匀涂布后于25°C孵育。定期用显微镜监测萌发情况，当芽管超过孢子直径时视为萌发。萌发率通过计数随机视野中孢子总数和萌发孢子数确定。萌发率和芽管长度数据记录并取平均值，实验设三次重复以确保可重复性。
2.7 透射与扫描电子显微镜
B. cinerea在含2.5%（v/v）戊二醛和4%（v/v）多聚甲醛的0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）中于4°C固定过夜。样品在含1%四氧化锇的PBS溶液中室温后固定90分钟，随后用PBS洗涤。
研究结果
3.1 BvlzGluc抑制灰葡萄孢孢子萌发并诱导严重菌丝畸形
为鉴定B. velezensis CECT 8237杀菌活性中涉及的蛋白因子，将基因组文库构建至fosmid pCC2FOS™载体中。共分离400个克隆，以4×深度实现芽孢杆菌基因组全覆盖。与未处理植株或H₂O₂处理的对照相比，基因组文库中12个不同克隆的无细胞上清液对B. cinerea孢子悬浮液诱导了显著的ROS响应（补充图1）。阳性克隆经测序和分析以鉴定具有潜在杀菌特性的分泌胞外蛋白。该分析考虑了信号肽搜索、无跨膜结构域和胞外定位。获得的序列还与已知数据库比对以确定负责抗真菌活性的特定基因或基因簇（补充表1）。
其中一个fosmid含有一段带有BAMY6639_07685位点的基因组片段，满足上述所有分析标准。推导的氨基酸序列（GenBank登录号WP_060674061）注释为假定蛋白，被选作进一步分析的候选。该蛋白序列与糖苷水解酶显著同源——这类酶以水解糖苷键的功能而闻名——因此被暂命名为BvlzGluc以反映其推定葡糖苷酶活性。
研究了BvlzGluc对灰葡萄孢的生物学效应，重点是真菌孢子萌发。该蛋白在E. coli中异源表达并纯化至均一后进行后续实验。该蛋白强烈抑制真菌孢子萌发，萌发出的芽管异常短小、扭曲且几乎不伸长（图1a）。部分孢子最终能萌发，但产生的芽管数量显著减少（图1b）。未处理孢子（图1a，插图）呈现正常且伸长的芽管，表明真菌生长健康。此外，将蛋白外源施加于成熟菌丝导致严重的形态畸形，表现为菌丝显著缩短、分枝增加以及明显空泡化（图1c）。这种结构破坏表明该蛋白干扰了真菌菌丝的正常生长和组织，导致异常细胞过程并损害真菌网络的整体完整性。细菌β-葡聚糖酶抑制真菌孢子萌发此前在B. subtilis CW14对赭曲霉和B. velezensis CE中已有报道。这些发现表明BvlzGluc的抑制活性可能与其他β-葡聚糖酶在靶向真菌病原体方面具有相似的机制——通过破坏孢子发育和萌发过程，进一步凸显其作为抗真菌剂的潜力。
【数据】基因组文库：400个克隆；覆盖深度：4×；阳性克隆数：12个；蛋白登录号：WP_060674061；萌发表型：芽管短小扭曲、分枝增加、空泡化
3.2 BvlzGluc破坏真菌细胞壁外层
菌丝形态改变的一个可能解释是对真菌细胞表面的破坏效应。扫描电子显微镜显示菌丝周围存在胞外基质，正常形成相互连接的网络（图2a，上），经BvlzGluc处理后该网络不再明显（图2a，下；代表性改变以箭头标示）。这种胞外基质在多种真菌（丝状和非丝状）中普遍存在，在维持菌丝间的结构凝聚和通讯中发挥作用。
真菌菌丝薄切片的透射电子显微镜显示，细胞壁物质似乎从结构中释放的区域（图2b，下，箭头），而用蛋白缓冲液处理的对照中未检测到此类特征（图2b，上）。这些观察结果与BvlzGluc影响细胞壁外层和连接菌丝的胞外基质一致，这可能削弱真菌网络的结构完整性并促成其抗真菌效果。
为验证该蛋白对真菌细胞壁和胞外基质组分的特异性，将纯化的细胞壁组分与BvlzGluc孵育并通过质谱分析（图2c）。未处理菌丝的色谱图中检测到对应高分子量多糖链的信号——符合完整真菌细胞壁的预期——同时在1000–1500 m/z范围内存在微弱且峰形不清晰的峰。这些次要信号很可能反映了纯化和处理过程中β-葡聚糖的部分降解，与其他复杂多糖制备的报道一致。相比之下，与BvlzGluc孵育后获得的质谱图显示高分子量物种显著减少，而在1000–1500 m/z区域出现更丰富且峰形更明确的峰（图2c）。重要的是，其中多个信号遵循约162 Da的增量间隔——对应一个葡萄糖单位的质量，被广泛认为是β-葡聚糖寡聚体的诊断特征（补充表3）。这些结构化峰系列的出现（在对照样品中缺失或仅勉强可见）与酶促水解导致可溶性葡聚糖片段释放一致。因此，处理样品中这些寡聚体梯状谱峰强度和有序性的增加提供了分子层面的证据，表明BvlzGluc切割真菌β-葡聚糖内的糖苷键，将高分子量多糖转化为较短的寡聚产物。该活性与BvlzGluc作为β-葡聚糖酶的拟议角色一致，并提示该酶削弱或重塑真菌细胞壁结构基质、从而促成抗真菌效果的机制。
需要指出的是，在SEM和TEM分析中，我们有意聚焦于尚未完全塌陷的菌丝区域，以便仍能分辨外壁和胞外纤维基质。在损伤最严重的区域，这些结构已过于破坏而无法可靠分析。这解释了为何图2中的超微结构图像看起来比图1中观察到的整体菌丝表型变形程度轻——两组图像代表了BvlzGluc诱导损伤的互补表现。
为补充质谱分析并对细胞壁降解进行定量评估，测量了纯化真菌细胞壁与BvlzGluc孵育后可溶性糖的释放量。对照反应在120分钟孵育期间显示极少的增溶作用，与有限的自发水解一致。相比之下，BvlzGluc处理导致可溶性碳水化合物含量呈现清晰的时间依赖性增加，在120分钟时达到约80 μg mL⁻¹葡萄糖当量（图2d）。这些数据表明BvlzGluc促进真菌细胞壁多糖的增溶，提供了酶促水解的定量证据，与质谱观察到的寡聚碎片化模式完全一致（图2c）。
【数据】质谱m/z范围：1000–1500；葡萄糖单位质量间隔：约162 Da；可溶性糖释放量：约80 μg mL⁻¹葡萄糖当量（120 min）；孵育时间：120 min
3.3 BvlzGluc降解真菌β-葡聚糖，削弱细胞壁完整性并降低灰葡萄孢致病力
通过免疫细胞化学方法，使用真菌抗β-葡聚糖特异性抗体在体内可视化BvlzGluc对B. cinerea的作用。在对照样品中，β-葡聚糖层在真菌细胞壁最外层清晰可辨。荧光信号在整个菌丝中连续分布，在菌丝顶端强度更高，表明β-葡聚糖层结构完整且有序。然而，当经BvlzGluc处理后，荧光信号明显减弱且分布不再连续，表明β-葡聚糖层被降解或重塑。这种细胞壁结构的破坏与前述形态学观察和质谱数据相互印证，进一步证实BvlzGluc通过降解β-葡聚糖削弱细胞壁完整性，从而降低真菌的致病能力。
【数据】免疫荧光：对照信号连续、顶端增强；处理后信号减弱且不连续；处理方式：BvlzGluc处理真菌菌丝
讨论与解读
BvlzGluc是贝莱斯芽孢杆菌CECT 8237产生的一种β-葡聚糖酶，对β-1,3-葡聚糖表现出高度特异性——包括构成灰葡萄孢细胞壁结构核心的多糖。其酶活性将这些多糖片段化为较低分子量产物（质谱已证实），并与形态改变、真菌发育受损和植物体内致病力降低相关联。这些发现与内切-β-1,3-葡聚糖酶的活性一致，支持该酶的抗真菌潜力。
研究结果表明，BvlzGluc采用GH16家族典型的果冻卷折叠，但缺乏典型成员中多个保守特征。尽管整体折叠相同，其呈现独特的结构特征，如缺少经典催化沟槽和保守序列基序。对残基Y36和T216（分子对接预测参与底物相互作用）的定点突变分别揭示了它们在酶功能和蛋白折叠中的重要性。综合来看，这些数据表明BvlzGluc可能代表GH16家族中的非典型成员。此外，BvlzGluc在多种pH和温度条件下表现出稳定性，其相对简单的结构有利于重组生产。这些特性加上其底物特异性和观察到的抗真菌效果，使其成为规模化生产和作物保护定向应用的候选分子。
编译者解读
BvlzGluc的独特之处在于"小而精"——缺乏经典催化沟槽却保持高效特异催化，这挑战了GH16家族结构-功能关系的传统认知。从合成生物学应用角度看，该酶的底物严格专一性（仅水解β-1,3-葡聚糖）意味着对植物细胞壁（含β-1,4和β-1,3/1,4混合连接）的潜在损伤风险较低，这是生防制剂安全性设计的重要优势。其相对简单的架构和理化稳定性也为工程化改造（如融合表达、定向进化提高催化效率）提供了便利的起点。不过，该研究对BvlzGluc在田间条件下的防效验证仍有限，从体外抗真菌到实际作物保护之间还有较长的转化路径。此外，Y36和T216的功能解析仅涉及两个位点，更深层的催化机制和底物识别网络仍有待阐明。
参考来源
Vela-Corcia D. Insight into novel biochemical features and function of novel antifungal GH16-β-glucanase from Bacillus velezensis. International Journal of Biological Macromolecules, 2026. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2026.150106
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2026.150106