定向进化提高巨大芽孢杆菌酪氨酸酶合成茶黄素双没食子酸酯产量

来源：Improved yield of theaflavin-3,3ʹ-digallate from Bacillus megaterium tyrosinase via directed evolution（Food Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

茶黄素-3,3′-双没食子酸酯（TFDG）是红茶中具有多种健康功效的天然功能成分，但天然含量低、化学合成污染大，限制了其应用。本研究以巨大芽孢杆菌来源的酪氨酸酶（Bmtyrc）为对象，采用易错PCR和高通量筛选的定向进化策略，获得四突变体Bmtyrc-3（N205D/D166E/D167G/F197W），其对底物EGCG和ECG的比活力分别提高6.46倍和4.91倍，TFDG时空产率达35.35 g L⁻¹d⁻¹。分子对接分析揭示N205D突变扩大了底物结合口袋，为酪氨酸酶催化效率的理性改造提供了新思路。

研究背景

茶黄素（TFs）是红茶中具有苯并卓酚酮骨架的天然产物，由不同型儿茶素在发酵过程中氧化形成邻醌，再经自缩合和脱羧反应生成。红茶中主要TFs包括茶黄素（TF1）、茶黄素-3-没食子酸酯（TF-3-G）、茶黄素-3′-没食子酸酯（TF-3′-G）和TFDG。大量研究表明TFs对代谢综合征、牙周炎、病毒和骨质疏松等具有改善作用，其中TFDG尤其能抑制癌细胞增殖和细菌生长，在药物和保健品开发方面具有广阔前景。

然而，TFs仅占红茶干重的2–6%，从茶叶中直接提取和分离单体的成本效益极低；化学氧化合成又存在环境污染等问题。酶法合成虽已被探索——来自茶树和双孢蘑菇的多酚氧化酶（PPOs）曾被用于催化TFs合成——但蘑菇酪氨酸酶的工业应用至今未见报道，限制TFDG工业化的主要瓶颈在于酶源缺乏和催化性能低下。前期研究表明，巨大芽孢杆菌来源的酪氨酸酶比双孢蘑菇酪氨酸酶具有更优的热稳定性和更宽的底物特异性，是颇具潜力的工业候选酶。本研究旨在通过定向进化策略提升Bmtyrc的催化性能，最大化TFDG的合成产量。

研究方法

2.1 化学试剂与材料

(-)-表儿茶素（EC）、(-)-表儿茶素没食子酸酯（ECG）、(-)-表没食子儿茶素（EGC）、(-)-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）及茶黄素类标准品由湖南三福生物科技有限公司惠赠。TFDG标准品（98%）购自阿拉丁试剂（上海）有限公司。氯化钠购自上海源叶生物科技有限公司。胰蛋白胨和酵母提取物购自Oxiod Ltd.（上海）。分子生物学试剂包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、dATP、dGTP、dCTP、dTTP及DNA marker，均购自天根生化科技（北京）有限公司。所有限制性内切酶（Nde I、BamH I、Xho I和Dpn I）购自Thermo Fisher Scientific（上海）。T4 DNA连接酶和KOD Plus Neo聚合酶购自东洋纺（上海）生物科技有限公司。表达载体pET-30a(+)和宿主菌E. coli BL21(DE3)购自Novagen（上海）。所有引物合成、基因合成及DNA测序由擎科生物技术（北京）有限公司完成。其他试剂均为分析纯。

【数据】TFDG标准品纯度：98%；菌株：E. coli BL21(DE3)；载体：pET-30a(+)；限制性内切酶：Nde I、BamH I、Xho I、Dpn I

2.2 基因克隆与重组表达

来源于巨大芽孢杆菌TCCC11368的酪氨酸酶基因（GenBank登录号：MN509467.1），其C端带有6×His标签序列，按制造商说明合成并克隆至pET-30a(+)，随后用作易错PCR的模板。

【数据】基因来源：B. megaterium TCCC11368；GenBank登录号：MN509467.1；标签：C端6×His

2.3 突变体文库构建

采用易错PCR方法构建突变文库。50 μL易错PCR反应体系包含：1 mM dCTP和dTTP、0.2 mM dNTPs、7 mM MgCl₂、0.1 mM MnCl₂、各30 pmol寡核苷酸引物（T7F/T7R）、5×缓冲液（5 μL）、50 ng Bmtyrc DNA模板及1 U Taq DNA聚合酶。PCR反应程序如下：95°C变性5 min一个循环；随后30–35个循环的94°C变性30 s、56°C退火30 s、72°C延伸30 s；最后72°C延伸7 min。纯化的PCR产物作为大引物（megaprimer），按照全质粒大引物PCR法（MEGAWHOP）克隆至pET-30(+)。50 μL MEGAWHOP反应体系包含：5×缓冲液（5 μL）、0.4 mM dNTPs、7 mM MgCl₂、50–100 ng大引物、50 ng pET-30a(+)载体及1 U KOD Plus Neo聚合酶。PCR程序为：94°C变性3 min一个循环；随后25–30个循环的94°C变性10 s、68°C延伸3.5 min；最后68°C延伸7 min。纯化的MEGAWHOP产物用Dpn I于37°C消化30 min，再于80°C热灭活20 min。Dpn I消化后的纯化产物（2–5 μg）电转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞中。最后，细胞涂布于含50 μg mL⁻¹卡那霉素的LB琼脂平板。

【数据】易错PCR体系：dCTP/dTTP 1 mM、dNTPs 0.2 mM、MgCl₂ 7 mM、MnCl₂ 0.1 mM、引物各30 pmol、模板50 ng、Taq聚合酶1 U；PCR条件：95°C 5 min；30–35循环（94°C 30 s，56°C 30 s，72°C 30 s）；72°C 7 min；MEGAWHOP体系：dNTPs 0.4 mM、MgCl₂ 7 mM、大引物50–100 ng、载体50 ng、KOD Plus Neo 1 U；PCR条件：94°C 3 min；25–30循环（94°C 10 s，68°C 3.5 min）；68°C 7 min；Dpn I消化：37°C 30 min；热灭活：80°C 20 min；电转化量：2–5 μg；卡那霉素浓度：50 μg mL⁻¹

2.4 文库筛选

挑取Bmtyrc突变体文库的单菌落，接种至含320 μL LB培养基（含50 μg mL⁻¹卡那霉素）的96深孔板中。在37°C、700 rpm条件下培养5–6 h后，取50 μL所有挑取克隆的培养物转移至新的96孔微量滴定板作为拷贝板。随后向96深孔板中加入30 μL 10%（w/v）乳糖，于25°C、700 rpm过夜培养以诱导Bmtyrc表达。取100 μL菌液，离心（3,000 × g，4°C，10 min）收集菌体，用ddH₂O洗涤。重悬菌体通过反复冻融裂解——先于37°C孵育30 min，再于-80°C冷冻1 h，然后37°C孵育2 h。离心（3,000 × g，4°C，10 min）后取20 μL上清液。加入5 mM ECG、5 mM EGCG和0.1 mM CuSO₄，用磷酸-柠檬酸缓冲液（0.1 M，pH 4.0）将反应体系总体积补至100 μL。在30°C、200 rpm振荡孵育10 min后，用酶标仪（Multiskan™ FC，Microplate Photometer，Thermo Scientific，美国）于405 nm处测定形成的氧化聚合产物。选择活性提高的突变体进行后续实验和基因测序。

【数据】培养条件：37°C、700 rpm、5–6 h；诱导：30 μL 10%乳糖，25°C、700 rpm过夜；收集：3,000 × g、4°C、10 min；冻融：37°C 30 min→-80°C 1 h→37°C 2 h；反应体系：5 mM ECG、5 mM EGCG、0.1 mM CuSO₄、磷酸-柠檬酸缓冲液（0.1 M，pH 4.0），总体积100 μL；反应条件：30°C、200 rpm、10 min；检测波长：405 nm

2.5 定点饱和突变

定点Bmtyrc突变体通过MEGAWHOP方法获得，定点突变引物列于表S1。50 μL PCR反应体系包含：0.2 mM dNTPs、7 mM MgCl₂、30 pmol寡核苷酸引物、20–50 ng DNA模板、5×缓冲液（5 μL）及1 U KOD Plus Neo聚合酶。PCR程序为：94°C变性3 min一个循环；随后25–30个循环的94°C变性10 s、68°C延伸3.5 min；最后68°C延伸7 min。PCR产物用Dpn I于37°C消化30 min以去除模板质粒。纯化产物转化至E. coli BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含50 μg mL⁻¹卡那霉素的LB琼脂平板，37°C过夜培养。选择活性提高的突变体进行后续实验和基因测序。

【数据】PCR体系：dNTPs 0.2 mM、MgCl₂ 7 mM、引物30 pmol、模板20–50 ng、KOD Plus Neo 1 U；PCR条件：94°C 3 min；25–30循环（94°C 10 s，68°C 3.5 min）；68°C 7 min；Dpn I消化：37°C 30 min；卡那霉素浓度：50 μg mL⁻¹；培养：37°C过夜

2.6 酶表达与纯化

重组E. coli BL21(DE3)菌株（含Bmtyrc及突变体）在10 mL含50 μg mL⁻¹卡那霉素的LB培养基中于37°C、200 rpm过夜培养。随后将1 mL培养物接种至100 mL TB培养基中，于37°C、200 rpm培养。当OD₆₀₀达到0.6时，加入终浓度为1%（w/v）的乳糖，于25°C继续培养10–12 h诱导酶表达。离心（10,000 × g，4°C，10 min）收集菌体，用10 mL Tris-HCl缓冲液（0.1 M，pH 8.0）洗涤。重悬菌体经超声破碎，离心（10,000 × g，4°C，10 min）获得粗酶液。离心后上清液上样至25 mL Ni-IDA亲和层析柱，静置1 h使上清液与介质充分结合。使用不同浓度的咪唑（100–500 mM）洗脱层析柱。目标酶合并后经超滤浓缩。纯化酶经SDS-PAGE确认，蛋白浓度以BSA为标准采用Bradford法测定。

【数据】培养：10 mL LB（50 μg mL⁻¹卡那霉素），37°C、200 rpm过夜；接种：1 mL→100 mL TB；诱导：OD₆₀₀=0.6时加乳糖至1%（w/v），25°C、10–12 h；收集：10,000 × g、4°C、10 min；洗涤：10 mL Tris-HCl（0.1 M，pH 8.0）；层析柱：25 mL Ni-IDA；咪唑洗脱：100–500 mM；蛋白定量：Bradford法，BSA标准

2.7 酶活测定与动力学分析

采用已建立的方法（Mishra et al., 2012; Tao et al., 2013），以ECG和EGCG为底物，通过分光光度法测定Bmtyrc及突变体的酶活。通过测定醌类产物生成的初始速率来确定酶活。酶促反应在1.5 mL Eppendorf管中进行，反应体系含50 μL酶液（含0.1 mM Cu²⁺）、5 mM底物及磷酸-柠檬酸缓冲液（0.1 M，pH 4.0），终体积200 μL。标准反应条件为30°C、200 rpm、5 min；随后加入50 μL 2 M三氯乙酸终止反应。离心（12,000 × g，1 min）取上清液，以不含酶液的反应混合物为阴性对照，记录405 nm处吸光度变化。一个酶活单位（U）定义为标准条件下每分钟引起吸光度变化0.01所需的酶量。参照Tao和Asako Narai-Kanayama报道的方法（Narai-Kanayama et al., 2016; Tao et al., 2013）并略作修改，在0.1 M磷酸-柠檬酸缓冲液（pH 4.0）中、30°C、5 min条件下，使用固定量的酶和不同浓度的底物测定Bmtyrc及突变体的动力学参数。

【数据】反应体系：50 μL酶液（0.1 mM Cu²⁺）、5 mM底物、磷酸-柠檬酸缓冲液（0.1 M，pH 4.0），终体积200 μL；反应条件：30°C、200 rpm、5 min；终止：50 μL 2 M三氯乙酸；离心：12,000 × g、1 min；检测波长：405 nm；酶活单位定义：标准条件下每分钟ΔA=0.01为1 U；动力学测定：30°C、5 min、pH 4.0

研究结果

3.1 针对EGCG和ECG高活性突变体的筛选

高通量筛选基于以下原理：酶促反应中，底物EGCG和ECG分别被氧化形成相应的邻醌，随后自聚合形成TFDG。氧化产物复合物的最大吸收波长（λ）为400–420 nm，因此可通过酶标仪进行测定分析。在96孔板筛选试验中，20 µL粗酶液与EGCG（3 mg mL⁻¹）和ECG（3 mg mL⁻¹）在30°C孵育30–60 min。颜色比对照组更深的克隆用于420 nm吸光度测定，吸光度值更高的样品被选作后续检测对象（图1）。

潜在有益氨基酸位点的鉴定按以下步骤进行。采用epPCR方法产生分子多样性。第一轮进化中，共筛选近20,000个菌落。仅获得一个对EGCG和ECG活性增强的单氨基酸突变体，测序显示其携带N205D突变（命名为Bmtyrc-1）。以Bmtyrc-1为模板，第二轮进化后获得对EGCG和ECG活性进一步增强的Bmtyrc-2（N205D/D166E/D167G）。定点饱和突变的产生与筛选如下：为获得具有最大可能活性的Bmtyrc突变体，以上述Bmtyrc-2为模板，选择底物结合位点的氨基酸残基（F197、R209和V218）引入组合饱和突变；最终获得含有四个氨基酸突变（N205D/D166E/D167G/F197W）的Bmtyrc-3突变株，在这些突变体中表现出最高的比活力。

突变体的鉴定与分析如下：将96孔板获得的野生型及突变体（Bmtyrc-1、-2、-3）在TB培养基中大规模（100 mL）培养，分析活性改变的粗酶，随后进行蛋白分离纯化和比活力测定。如表1所示，所有变体对EGCG和ECG的活性均高于野生型Bmtyrc。

【数据】筛选规模：第一轮约20,000个菌落；反应体系：20 µL粗酶液、EGCG 3 mg mL⁻¹、ECG 3 mg mL⁻¹；反应条件：30°C、30–60 min；检测波长：420 nm；突变体：Bmtyrc-1（N205D）、Bmtyrc-2（N205D/D166E/D167G）、Bmtyrc-3（N205D/D166E/D167G/F197W）；培养规模：100 mL TB培养基

3.2 野生型及突变体Bmtyrc的纯化与表征

为进行更精确的测定，在Bmtyrc及突变体的C端融合了6×His标签。Bmtyrc及其突变体在E. coli BL21(DE3)中表达，并通过Ni亲和层析柱纯化。纯化蛋白的SDS-PAGE分析表明，酪氨酸酶单体的分子量约为35 KDa（图S2）。SDS-PAGE分析显示各酶的纯度和分子量无明显差异。

与野生型相比（表1），突变体Bmtyrc-1、Bmtyrc-2和Bmtyrc-3对EGCG和ECG的活性均显著提高。Bmtyrc-3对EGCG和ECG的比活力分别为90.80 U mg⁻¹和56.34 U mg⁻¹，分别是野生型Bmtyrc的6.46倍和4.91倍。

【数据】分子量：约35 KDa；Bmtyrc-3比活力（EGCG）：90.80 U mg⁻¹（野生型的6.46倍）；Bmtyrc-3比活力（ECG）：56.34 U mg⁻¹（野生型的4.91倍）

3.3 动力学分析

为进一步探究活性提高的原因，计算了野生型及突变酶对ECG和EGCG的动力学参数。如表2所示，以EGCG和ECG为底物的Lineweaver-Burk双倒数作图分析显示，Bmtyrc-3的Km和Vmax值分别为72.14 mM和1743.53 U min⁻¹mg⁻¹，以及14.19 mM和259.95 U min⁻¹mg⁻¹。

为比较不同酶对底物的催化能力，采用Vmax/Km比值（Tao et al., 2013）作为指标。尽管突变体Bmtyrc-3对EGCG的Km值比野生型高7.55倍，但Bmtyrc-3以EGCG和ECG为底物时的Vmax/Km分别为24.27 U min⁻¹mg⁻¹mM⁻¹和18.41 U min⁻¹mg⁻¹mM⁻¹，分别是野生型的6.76倍和8.60倍。可以得出结论：Bmtyrc-3以EGCG和ECG为底物时比野生型具有更高的催化能力，这也表明Bmtyrc-3在这些酶中对TFDG合成具有最显著的能力。

【数据】Bmtyrc-3动力学参数（EGCG）：Km=72.14 mM，Vmax=1743.53 U min⁻¹mg⁻¹；Bmtyrc-3动力学参数（ECG）：Km=14.19 mM，Vmax=259.95 U min⁻¹mg⁻¹；Vmax/Km（EGCG）：24.27 U min⁻¹mg⁻¹mM⁻¹（野生型的6.76倍）；Vmax/Km（ECG）：18.41 U min⁻¹mg⁻¹mM⁻¹（野生型的8.60倍）；EGCG的Km为野生型的7.55倍

讨论与解读

TFDG和TFs的酶法合成已被广泛探索。从茶树和双孢蘑菇中纯化的PPOs曾被成功用于催化TFs合成。尽管酪氨酸酶的大部分研究和应用集中于蘑菇酪氨酸酶，但体外催化合成TFDG的工业应用至今未见报道。限制TFDG工业应用的主要原因是酶源缺乏和催化性能低下。前期研究表明，与其他来源的酪氨酸酶相比，巨大芽孢杆菌来源的酪氨酸酶比双孢蘑菇酪氨酸酶具有更优的热稳定性和更宽的底物特异性，是颇具潜力的工业候选酶。

为最大化TFDG产量，本研究采用定向进化策略提升Bmtyrc的催化性能。通过该方法获得了含4个氨基酸位点突变的Bmtyrc-3（N205D/D166E/D167G/F197W），其TFDG产量比野生型提高5.30倍，时空产率达35.35 g L⁻¹d⁻¹。然而，距工业化生产目标仍有差距，主要原因是茶黄素形成过程涉及茶多酚的氧化和自聚合，反应复杂且合成机制尚未被充分阐明。

分子对接分析表明，Bmtyrc-3具有更宽的底物结合区域，这由覆盖活性位点的N205D突变引起。底物结合位点电势和氢键的变化，以及蛋白表面的静电效应，共同导致了对底物EGCG和ECG活性的提高。

编译者解读

本研究展示了定向进化在工业酶改造中的典型应用路径——从易错PCR随机突变到定点饱和突变的组合策略，逻辑清晰且可复制性强。Bmtyrc-3在保持底物亲和力基本不受损的前提下（Km仅升高7.55倍），通过Vmax的大幅提升（51.97倍）实现了整体催化效率的飞跃，这种"以Km换Vmax"的进化策略值得关注。值得一提的是，35.35 g L⁻¹d⁻¹的时空产率已具备中试放大潜力。但本研究的筛选通量（近20,000个菌落）在合成生物学时代仍属中等水平，若结合液滴微流控或荧光激活细胞分选等更高通量平台，有望进一步加速进化进程。此外，TFDG合成机理尚未完全阐明，后续可借助量子化学计算和分子动力学模拟深入解析反应路径。

参考来源

Zhou, J. (2022). Improved yield of theaflavin-3,3′-digallate from Bacillus megaterium tyrosinase via directed evolution. Food Chemistry, 2022. DOI: 10.1016/j.foodchem.2021.131848

DOI: 10.1016/j.foodchem.2021.131848