来源：Evolution of acetohydroxyacid synthase from Bacillus subtilis for L-valine production using error-prone PCR（Molecular Catalysis）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
L-缬氨酸是支链氨基酸生物合成途径中的关键产物，而乙酰羟酸合酶（AHAS）作为该途径的限速酶，其活性受L-缬氨酸反馈抑制。本研究构建了基于mCherry的诱导型全细胞生物传感器pVal，通过易错PCR构建AHAS突变文库并结合高通量筛选，获得一株L-缬氨酸高产菌株B. subtilis Val-41.1，摇瓶发酵产量达20.3 ± 1.9 g/L。进一步通过定点突变解析关键氨基酸残基，获得去敏化变体IlvHG151D/N29H，将其过表达于饲用益生菌B. subtilis ACCC11025后，L-缬氨酸产量提升至21.7 ± 1.8 g/L，较野生型AHAS过表达菌株提高90.4%。
研究背景
L-缬氨酸是九种必需氨基酸之一，广泛用作饲料添加剂、食品添加剂和药物前体。研究表明，在饲料中添加L-缬氨酸可改善畜禽肉品质和产量、提高家禽产蛋率及家畜乳脂含量。然而，植物蛋白中L-缬氨酸含量较低，使其成为低蛋白日粮中第五限制性氨基酸，饲料工业对L-缬氨酸的需求日益增长。目前，微生物发酵是工业规模化生产L-缬氨酸的主要途径，谷氨酸棒杆菌和大肠杆菌及其衍生菌株是核心工业底盘菌株。已有多种策略用于构建L-缬氨酸高产菌株，包括过表达关键酶编码基因、敲除或弱化竞争途径相关基因、定向修饰关键酶及转录调控因子以解除反馈抑制和转录抑制、增加NADPH供应以平衡胞内辅因子等。乙酰羟酸合酶（AHAS）是支链氨基酸生物合成中的关键限速酶，但其活性受支链氨基酸尤其是L-缬氨酸的反馈抑制，这成为提高L-缬氨酸产量的主要瓶颈。
研究方法
2.1 菌株与质粒
本研究所用菌株和质粒列于表1。枯草芽孢杆菌ACCC11025作为亲本菌株，购自中国农业菌种保藏中心（ACCC），在中国广泛用作饲用益生菌。
构建温度敏感型生物传感器质粒pVal用于响应胞内L-缬氨酸，具体步骤如下：（1）将含氨苄青霉素抗性（Ampr）的质粒pUC19和含红霉素抗性（Eryr）的质粒pE194分别用PstI酶切，随后连接并转化至大肠杆菌JM109。在含Amp（100 mg/L）和Ery（10 mg/L）的LB平板上筛选目标重组子，从该重组子中提取质粒pTS，经PCR验证确认其同时含有pUC19和pE194片段；（2）mCherry编码基因由GENEWIZ生物技术有限公司（中国苏州）合成，3'端带有BamHI位点，5'端带有Shine-Dalgarno序列（即TAAGGAGG）。ptb基因启动子（即Pptb，ptb编码枯草芽孢杆菌中的磷酸丁酰辅酶A转移酶）用引物Pptb-F/Pptb-R扩增，5'端带SalI位点，3'端带mCherry同源序列（即TAAGGAGGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGAC）。随后，上述片段用ClonExpress II一步克隆试剂盒（Vazyme，南京）连接构建Pptb-mCherry片段，再将该片段连接到pTS的BamHI/SalI位点，得到质粒pTS-Pptb-mCherry；（3）bkdR基因用引物bkdR-F/bkdR-R扩增，5'和3'端均带有pMA5质粒同源序列，然后用ClonExpress II一步克隆试剂盒（Vazyme，南京）连接到pMA5中构建pMA5-bkdR。随后，以pMA5-bkdR为模板、使用引物PHpaII-F/PHpaII-R扩增含PHpaII启动子和fd终止子的bkdR片段，5'端带EcoRI位点、3'端带KpnI位点，再将上述片段连接到pTS-Pptb-mCherry的KpnI/EcoRI位点，得到生物传感器质粒pVal（图S1）。
为构建表达质粒pilvBH Muts以在枯草芽孢杆菌中表达AHAS编码基因ilvBH及其变体，以pMA5为原始质粒。ilvBH基因的随机突变文库通过易错PCR构建，引物ilvBH-F/ilvBH-R的5'端带BamHI位点、3'端带NheI位点，然后连接到pMA5的BamHI/NheI位点，得到表达质粒pilvBH Muts（图S2）。易错PCR使用QuickMutation™随机突变试剂盒（Beyotime生物技术有限公司，上海），操作步骤按说明书进行。
2.2 生长培养基与培养条件
大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在37°C的Luria-Bertani（LB）培养基中培养，用于细胞生长和/或重组蛋白表达。必要时，添加Amp（100 mg/L）、Ery（10 mg/L）和卡那霉素（Kan，50 mg/L）以筛选目标质粒和菌株。
SPI培养基（/L）含490 mL SPI-A溶液（即Na3C6H5O7·2H2O 2 g/L、(NH4)2SO4 4 g/L、K2HPO4·3H2O 28 g/L、KH2PO4 12 g/L）、490 mL SPI-B溶液（即MgSO4·7H2O 0.4 g/L）、10 mL 100 × CAYE溶液（即酪蛋白水解物20 g/L、酵母提取物100 g/L）和10 mL 500 g/L葡萄糖溶液。SPII培养基（/L）含980 mL SPI培养基、10 mL 50 mmol/L CaCl2和10 mL 250 mmol/L MgCl2，用于制备枯草芽孢杆菌感受态细胞。
最小培养基（即MM，含葡萄糖30.0 g/L、(NH4)2SO4 12.0 g/L、KH2PO4 13.1 g/L、K2HPO4 6.0 g/L、NaC6H5O7·2H2O 1.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L、25 mg/L L-色氨酸、25 mg/L L-苯丙氨酸和25 mg/L L-酪氨酸）用于荧光生物传感器筛选目标菌株。
摇瓶发酵生产L-缬氨酸的发酵培养基组成（g/L）：葡萄糖100.0、(NH4)2SO4 30.0、KH2PO4 1.5、MgSO4·7H2O 1.0、FeSO4·7H2O 0.04、玉米浆10、CaCO3 30、Kan 50 mg，pH 7.0。分批发酵在500 mL锥形瓶中进行，装液量50 mL，37°C、100 rpm往复摇床培养。
【数据】抗性筛选浓度：Amp 100 mg/L、Ery 10 mg/L、Kan 50 mg/L；SPI培养基组分：Na3C6H5O7·2H2O 2 g/L、(NH4)2SO4 4 g/L、K2HPO4·3H2O 28 g/L、KH2PO4 12 g/L、MgSO4·7H2O 0.4 g/L、酪蛋白水解物20 g/L、酵母提取物100 g/L、葡萄糖500 g/L；SPII培养基组分：CaCl2 50 mmol/L、MgCl2 250 mmol/L；MM培养基：葡萄糖30.0 g/L、(NH4)2SO4 12.0 g/L、KH2PO4 13.1 g/L、K2HPO4 6.0 g/L、NaC6H5O7·2H2O 1.2 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L、L-色氨酸25 mg/L、L-苯丙氨酸25 mg/L、L-酪氨酸25 mg/L；发酵培养基：葡萄糖100.0 g/L、(NH4)2SO4 30.0 g/L、KH2PO4 1.5 g/L、MgSO4·7H2O 1.0 g/L、FeSO4·7H2O 0.04 g/L、玉米浆10 g/L、CaCO3 30 g/L、Kan 50 mg、pH 7.0；培养条件：37°C、100 rpm、500 mL锥形瓶装液50 mL
2.3 蛋白表达与纯化
AHAS编码基因ilvBH及其变体克隆到pET28a中，然后转化至大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达。重组大肠杆菌在Terrific Broth（TB）培养基（即蛋白胨12.0 g/L、酵母提取物24.0 g/L、甘油4 mL/L、K2HPO4·3H2O 12.54 g/L、KH2PO4 2.313 g/L）中培养，含50 mg/L Kan，37°C、100 rpm。当OD600达到0.5∼0.6时，向培养物中加入1 mmol/L IPTG，然后在30°C、100 rpm条件下孵育12 h以诱导ilvBH及其变体的表达。细胞沉淀通过4500 g离心5分钟收集，然后用超声破碎（Sonics & Materials, Inc., CT）。无细胞上清液用于纯化AHAS，纯化方法参照先前报道。蛋白浓度用BCA蛋白定量试剂盒（Vazyme，南京）分析，以牛血清白蛋白（BSA）为标准。
【数据】TB培养基：蛋白胨12.0 g/L、酵母提取物24.0 g/L、甘油4 mL/L、K2HPO4·3H2O 12.54 g/L、KH2PO4 2.313 g/L；Kan浓度：50 mg/L；IPTG浓度：1 mmol/L；诱导条件：OD600 0.5∼0.6时加入IPTG，30°C、100 rpm、12 h；离心：4500 g、5 min
2.4 酶活测定
AHAS酶活分析基于Mendel、Elkayam、Sella、Vinogradov、Vyazmensky、Chipman和Barak的方案。AHAS及其变体的动力学分析通过梯度改变丙酮酸钠浓度进行。动力学参数即Km和kcat通过GraphPad Prism将数据拟合至Michaelis-Menten方程确定。为测定支链氨基酸对AHAS及其变体的抑制，通过梯度改变支链氨基酸浓度测定AHAS及其变体的相对活性。
【数据】动力学参数：Km和kcat（原文未详述具体数值）；抑制测定：梯度改变支链氨基酸浓度（原文未详述具体浓度范围）
2.5 生物信息学分析
不同微生物来源的AHAS氨基酸序列用ClustalW（https://www.genome.jp/tools-bin/clustal）和ESPript3.0（https://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）进行比对。突变AHAS（包括IlvB和IlvH）的蛋白结构用AlphaFold3预测，并用SAVES 6.0验证。蛋白可视化用PyMOL完成，底物与AHAS之间的相互作用用EasyMD分析。
【数据】序列比对工具：ClustalW、ESPript3.0；结构预测：AlphaFold3；结构验证：SAVES 6.0；可视化：PyMOL；相互作用分析：EasyMD
2.6 分析方法
每4小时从锥形瓶中取样一次。一半样品用分光光度计（SP-756P；Spectrum，上海）在600 nm处适当稀释后分析生物量。另一半样品稀释100倍，然后用SBA-40E固定化酶生物传感器（山东）分析葡萄糖浓度，用高效液相色谱（LC-20A；Shimadzu，京都，日本）分析L-缬氨酸浓度，方法参照先前描述。荧光强度用酶标仪（Synergy H4；BioTek，佛蒙特州，美国）在570 nm激发和607 nm发射条件下分析，方法参照先前报道。
【数据】取样间隔：4 h；生物量测定：OD600；葡萄糖分析：SBA-40E固定化酶生物传感器；L-缬氨酸分析：高效液相色谱LC-20A；荧光测定：激发570 nm、发射607 nm；样品稀释倍数：100倍
研究结果
3.1 响应胞内L-缬氨酸的诱导型mCherry全细胞生物传感器的设计
构建温度敏感型生物传感器质粒pVal，用于高通量筛选胞内存在L-缬氨酸时形成红色菌落的L-缬氨酸高产菌株。生物传感器pVal包含两个功能模块，即含有bkdR的感应模块用于检测L-缬氨酸，以及含有Pptb启动子和红色荧光蛋白（即mCherry）的报告模块用于比色信号输出（图2a）。此前报道指出，BkdR（由bkdR基因编码）作为bkd操纵子（包含七个参与L-异亮氨酸和L-缬氨酸降解的基因）的转录激活因子，对枯草芽孢杆菌胞内L-异亮氨酸或L-缬氨酸的变化做出响应。BkdR与bkd操纵子的启动子区域（即Pptb）相互作用，在L-异亮氨酸或L-缬氨酸存在时激活bkd操纵子的转录。理论上，质粒pVal中mCherry的表达水平随L-异亮氨酸或L-缬氨酸浓度的增加而升高，从而使菌落更红（图2b）。
为验证pVal作为L-缬氨酸生物传感器的可行性，将质粒pVal转入bkdR缺陷型枯草芽孢杆菌菌株，构建菌株B. subtilis ∆bkdR/pVal。枯草芽孢杆菌基因组中bkdR的敲除保证了Pptb启动子的活性仅由质粒上的BkdR控制。从图2c可以看出，菌株B. subtilis ∆bkdR/pVal在不同L-缬氨酸浓度下表现出肉眼可见的颜色差异。此外，荧光/OD600随L-缬氨酸浓度的增加而升高（图2d）。需要注意的是，当L-缬氨酸浓度低于5 mmol/L和高于50 mmol/L时，荧光/OD600没有明显增加（图2d）。上述结果表明，生物传感器pVal能够响应胞内L-缬氨酸，并表现出剂量依赖性响应。
【数据】生物传感器响应范围：L-缬氨酸浓度5∼50 mmol/L范围内荧光/OD600随浓度升高而增加；低于5 mmol/L或高于50 mmol/L时荧光无明显增加
3.2 高通量可视化筛选具有最佳乙酰羟酸合酶突变体的L-缬氨酸高产菌株
乙酰羟酸合酶（AHAS）在支链氨基酸（即L-缬氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸）的生物合成中发挥重要作用，但AHAS的活性受L-缬氨酸抑制。为筛选对缬氨酸不敏感的最佳AHAS突变体以促进L-缬氨酸生产，利用易错PCR构建了AHAS编码基因（即ilvBH）的突变文库，然后用上述生物传感器pVal筛选最佳突变体。为此，将B. subtilis ∆bkdR/pVal基因组中的ilvBH基因敲除，构建AHAS缺陷菌株B. subtilis ∆bkdR ∆ilvBH/pVal，然后将携带ilvBH基因随机突变文库的表达质粒pilvBH Muts转化至菌株B. subtilis ∆bkdR ∆ilvBH/pVal。转化细胞涂布于含Kan（50 mg/L）和Ery（10 mg/L）的MM琼脂平板，37°C培养≥24 h。如果菌株含有对缬氨酸不敏感的AHAS，其菌落因胞内L-缬氨酸积累而呈红色。所有红色菌落转接至新鲜MM琼脂平板，37°C培养≥24 h。连续两轮筛选后仍保持稳定红色的菌落接种至含新鲜MM液体培养基的摇瓶中，用于后续L-缬氨酸滴度测定。使用pVal生物传感器构建和筛选最佳AHAS突变体的总体流程如图3a所示。
经过多轮易错PCR突变和pVal生物传感器筛选，选择50个红色菌落突变体进行摇瓶发酵L-缬氨酸产量分析。从图3b可以看出，大多数突变体产生1.0 g/L ∼ 3.0 g/L的L-缬氨酸。有9个枯草芽孢杆菌突变体的L-缬氨酸产量超过3.0 g/L，其中B. subtilis Val-41的L-缬氨酸滴度最高（即达到6.6 ± 0.5 g/L；图3c）。与这一结果一致，荧光强度测定进一步验证了B. subtilis Val-41具有优越的L-缬氨酸生物合成能力，因为B. subtilis Val-41的荧光/OD600显著高于对照菌株B. subtilis ∆bkdR/pVal（即B. subtilis Val-0）。
为减少菌株Val-41的代谢负担，应去除生物传感器质粒pVal以避免mCherry和BkdR的表达。为此，将B. subtilis Val-41转接至无抗生素LB平板，51°C培养，因为生物传感器质粒pVal含有pE194的结构（图S1），不含生物传感器质粒pVal的菌株命名为B. subtilis Val-41.1。同时去除B. subtilis Val-0中的生物传感器质粒pVal，得到菌株Val-0.1。在发酵培养基中验证了B. subtilis Val-41.1的生产性能。摇瓶发酵48 h后，B. subtilis Val-41.1的L-缬氨酸滴度为20.3 ± 1.9 g/L，碳得率为20.3%，生产强度为0.423 g/(L∙h)（图3d）。
然而，需要注意的是，红色菌落或高荧光/OD600的菌株并不总是表现出高L-缬氨酸产量。例如，菌株Val-16呈深红色菌落，荧光/OD600为32573 ± 318（图3e和图S3a），但其仅产生0.37 ± 0.05 g/L的L-缬氨酸（图S3b）。相反，菌株Val-16产生了4.9 ± 0.3 g/L的L-异亮氨酸（图S3b）。这是因为BkdR也结合L-异亮氨酸，从而诱导bkd操纵子的转录。
【数据】筛选规模：50个红色菌落突变体；多数突变体产量：1.0∼3.0 g/L；产量超3.0 g/L的突变体数：9个；B. subtilis Val-41最高产量：6.6 ± 0.5 g/L；Val-41.1产量：20.3 ± 1.9 g/L；碳得率：20.3%；生产强度：0.423 g/(L∙h)；发酵时间：48 h；Val-16荧光/OD600：32573 ± 318；Val-16 L-缬氨酸产量：0.37 ± 0.05 g/L；Val-16 L-异亮氨酸产量：4.9 ± 0.3 g/L
3.3 进化乙酰羟酸合酶的表征及解除L-缬氨酸抑制的关键氨基酸残基鉴定
为找到通过高通量可视化筛选获得的进化AHAS中解除L-缬氨酸抑制的关键氨基酸残基，提取菌株B. subtilis Val-41.1中的质粒并测序。结果显示，与菌株B. subtilis ACCC11025的野生型AHAS编码基因相比，菌株B. subtilis Val-41.1的AHAS编码基因ilvBH有13个氨基酸替换突变（表2和图S4）。其中，6个突变位于AHAS的调节亚基（即IlvH）中（表2和图S5）。根据此前报道，IlvH对支链氨基酸的抑制敏感，而IlvB对反馈抑制不敏感。因此，IlvH中的这6个突变将在后续研究中进一步分析，以阐明其对AHAS酶活性的影响。
为确认IlvH中解除L-缬氨酸抑制的关键氨基酸残基，基于上述6个突变对野生型IlvH进行定点突变。为此，以表达质粒pMA5-ilvB Mut ilvH为模板，其中ilvB Mut基因编码携带L22E/A129V/A207S/A226G/V371P/S408T/K555E替换的突变IlvB蛋白（命名为IlvBMut），来源于B. subtilis Val-41.1。随后，构建了一系列重组质粒pMA5-ilvB Mut-ilvH X（其中X表示单个氨基酸突变）并转化至B. subtilis ACCC11025，用重组菌株分析L-缬氨酸产量。作为对照，野生型AHAS（由菌株B. subtilis ACCC11025的野生型ilvBH基因编码）和进化AHAS变体（即IlvBL22E/A129V/A207S/A226G/V371P/S408T/K555EIlvHR3H/N29H/H37A/R45E/Q60L/G151D，也称为IlvBMutIlvHMut，由菌株B. subtilis Val-41.1的进化ilvB Mut ilvH Mut基因编码）分别克隆到表达质粒pMA5中。所得重组质粒随后转化至B. subtilis ACCC11025。
【数据】突变总数：13个氨基酸替换；IlvH亚基突变数：6个；IlvBMut突变位点：L22E/A129V/A207S/A226G/V371P/S408T/K555E；IlvHMut突变位点：R3H/N29H/H37A/R45E/Q60L/G151D
3.4 IlvH定点突变对L-缬氨酸生产的影响
为确定IlvH中6个突变各自对L-缬氨酸生产的影响，将携带不同IlvH突变的重组质粒转化至B. subtilis ACCC11025，在摇瓶发酵中测定L-缬氨酸产量。结果表明，在携带野生型IlvB（即IlvBWT）的背景下，单个IlvH突变对L-缬氨酸产量的影响各异。其中，IlvHG151D和IlvHN29H单突变体表现出较高的L-缬氨酸产量，而其他单突变体（如IlvHR3H、IlvHH37A、IlvHR45E和IlvHQ60L）对L-缬氨酸产量的促进作用相对较弱。进一步将IlvHG151D与IlvHN29H组合（即IlvHG151D/N29H）后，L-缬氨酸产量进一步提升。在携带进化IlvB（即IlvBMut）的背景下，IlvHG151D/N29H同样表现出最佳的L-缬氨酸生产性能。
【数据】最佳双突变体：IlvHG151D/N29H（具体产量数值原文未详述）
3.5 L-缬氨酸与野生型IlvH及其变体之间的相互作用分析
为解析IlvH变体对L-缬氨酸去敏化的分子机制，利用分子对接分析了L-缬氨酸与野生型IlvH（即IlvHWT）及突变体IlvHG151D/N29H之间的相互作用。对接结果显示，L-缬氨酸与IlvHWT之间存在较强的相互作用，而与IlvHG151D/N29H之间的相互作用强度显著减弱（图6）。这种相互作用的减弱降低了L-缬氨酸对AHAS全酶的反馈抑制效果，从而提高了酶的催化活性。
【数据】相互作用分析：L-缬氨酸与IlvHWT结合强，与IlvHG151D/N29H结合弱（具体结合能数值原文未详述）
3.6 菌株ACCC11025/pMA5-ilvB Mut ilvH G151D/N29H的摇瓶发酵性能
将表达质粒pMA5-ilvB Mut ilvH G151D/N29H转化至B. subtilis ACCC11025，所得菌株ACCC11025/pMA5-ilvB Mut ilvH G151D/N29H在摇瓶发酵中表现出优异的L-缬氨酸生产性能。该菌株的L-缬氨酸滴度达到21.7 ± 1.8 g/L，较过表达野生型AHAS（即IlvBWTIlvHWT）的菌株ACCC11025/pMA5-ilvBH提高了90.4%。同时，该菌株的副产物L-亮氨酸和L-异亮氨酸积累水平较低，表明碳流更有效地导向L-缬氨酸合成。
【数据】ACCC11025/pMA5-ilvB Mut ilvH G151D/N29H产量：21.7 ± 1.8 g/L；较ACCC11025/pMA5-ilvBH提高：90.4%
讨论与解读
本研究构建了响应L-缬氨酸的诱导型mCherry全细胞生物传感器pVal，该传感器包含两个模块：含有bkdR的感应模块用于检测L-缬氨酸，含有Pptb启动子和mCherry的报告模块用于输出比色信号。利用该传感器高通量筛选获得L-缬氨酸高产菌株B. subtilis Val-41.1，其携带的AHAS突变体IlvBL22E/A129V/A207S/A226G/V371P/S408T/K555EIlvHR3H/N29H/H37A/R45E/Q60L/G151D（即IlvBMutIlvHMut）在摇瓶发酵中产量达20.3 ± 1.9 g/L。基于IlvH定向进化结果，变体IlvHG151D/N29H对L-缬氨酸表现出比IlvHWT更高的去敏化程度，原因在于抑制剂（L-缬氨酸）与IlvH之间的相互作用强度降低。此外，过表达IlvBMutIlvHG151D/N29H有利于提高饲用益生菌B. subtilis ACCC11025的L-缬氨酸最终滴度。所得菌株ACCC11025/pMA5-ilvB Mut ilvH G151D/N29H的L-缬氨酸产量达21.7 ± 1.8 g/L，较过表达野生型AHAS的菌株ACCC11025/pMA5-ilvBH提高了90.4%。
编译者解读：本研究展示了合成生物学中"传感器-突变库-筛选"闭环策略的典型应用。以mCherry荧光为输出信号的生物传感器pVal实现了L-缬氨酸高产菌株的可视化高通量筛选，大幅降低了筛选成本。通过易错PCR与定点突变的组合策略，研究者精准定位了IlvH中G151D和N29H两个关键去敏化位点，为理解AHAS反馈抑制的分子机制提供了结构生物学证据。值得注意的是，筛选过程中发现红色菌落并不总对应高L-缬氨酸产量（如Val-16实际主要产L-异亮氨酸），提示BkdR传感器的配体特异性局限。未来若能将传感器配体结合域定向改造为对L-缬氨酸绝对特异，将进一步提升筛选精度。此外，将工程菌株应用于饲用益生菌B. subtilis ACCC11025，体现了从基础酶工程到产业应用的良好转化路径。
参考来源
Wan S. Evolution of acetohydroxyacid synthase from Bacillus subtilis for L-valine production using error-prone PCR. Molecular Catalysis, 2026.
DOI: 10.1016/j.mcat.2026.115707
DOI: 10.1016/j.mcat.2026.115707