来源：Surfactant-tolerance evolution of Bacillus clausii protease for enhancing activity and stability by reshaping the substrate access tunnel（Colloids and Surfaces B: Biointerfaces）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
碱性蛋白酶在洗涤剂行业中占据核心地位，但阴离子表面活性剂（如AES和LAS）常导致其失活。本研究通过底物进入通道工程策略，对来源于 Bacillus clausii 的蛋白酶 bcPRO 进行理性改造。通过分析不同环境下的底物结合口袋构象，锁定Asn212为关键突变位点，获得在AES和LAS中活性和稳定性均显著提升的N212S突变体。分子动力学模拟揭示了突变增强蛋白刚性、致密性及底物亲和力的结构基础，为洗涤剂用蛋白酶的工业应用提供了有前景的候选酶。
研究背景
环保意识的增强推动工业过程从化学法向酶法转变。蛋白酶约占全球酶市场的60%，其中碱性蛋白酶因在碱性环境中优异的蛋白水解活性，被广泛应用于洗涤剂制造、皮革脱毛、肉类加工等领域。超过三分之二的碱性蛋白酶用于洗涤剂工业，可有效水解奶渍、汗渍和血渍等蛋白质污渍。然而，碱性蛋白酶中多肽的螺旋构象对温度、pH及洗涤剂中表面活性剂等环境变化极为敏感，这严重制约了其应用效果。1963年NOVO公司从地衣芽孢杆菌中分离得到首个应用于洗涤剂的碱性蛋白酶Alcalase，该酶对十二烷基硫酸钠（SDS）具有较高耐受性。尽管从极端环境中筛选的蛋白酶在洗涤剂行业潜力巨大，但其分离成本高且微生物培养困难，限制了实际应用。因此，通过蛋白质工程改造提升现有蛋白酶的表面活性剂耐受性，是更具可行性的策略。
研究方法
2.1 候选氨基酸残基的筛选
利用SWISS-MODEL以 B. lentus 蛋白酶（PDB ID: 1SVN）为模板构建WT bcPRO的三维结构。AAPF、AES和LAS的结构从PubChem网站获取，并使用MOPAC程序进行优化。采用底物进入通道稳定化策略识别增强蛋白质活性和稳定性的潜在热点。使用AutoDock Vina 1.2.2软件进行bcPRO与AAPF之间的分子对接，其中bcPRO定义为受体，AAPF定义为配体。使用Packmol将50个AES/LAS分子填充到边长为50 Å的立方体中，不同分子的每对原子之间至少间隔2.0 Å，分子在立方体内均匀分布。分子对接形成的复合物结构经分子动力学（MD）模拟获得底物口袋构象。使用Maestro 2018软件中的sitemap模块分析底物结合口袋。与水性环境中的结果相比，在LAS和AES环境中不再位于底物结合口袋中的氨基酸残基被鉴定为候选突变残基。构成底物结合口袋但与活性位点距离超过3 Å的残基被优先选作潜在靶点，以减少实验筛选工作量。
【数据】模板：1SVN；立方体边长：50 Å；分子间距：≥2.0 Å；活性位点距离阈值：3 Å
2.2 突变体文库构建与突变体筛选
首先选择BamHI和SmaI作为限制性酶切位点，构建重组质粒pPBL5-bcPRO。该质粒作为后续定点饱和突变的模板。通过重叠PCR引入定点突变并制备突变体文库，使用NNK/MNN简并引物（见表S1）。PCR扩增体系和程序按表S2和表S3的规格执行。携带突变的纯化PCR产物与载体pPBL5经BamHI和SmaI双酶切后连接，转化至枯草芽孢杆菌WB600中，涂布于含卡那霉素的LB琼脂平板获得突变体。每个突变位点选择约100个菌落以确保覆盖度。转化子接种于1 mL含卡那霉素的LB液体培养基中，在摇床中培养48 h。4000 g离心10 min后，收集上清液作为粗酶液。根据突变体在2% AES和2% LAS存在下的活性进行评估。此外，在含2% AES和2% LAS的缓冲液中孵育4 h后，选择残留活性高于WT bcPRO的突变体。在表面活性剂中稳定性和活性优异的突变体经GENEWIZ测序（中国天津）验证。进行定点饱和诱变时，重组质粒pPBL5-bcPRO同样作为模板。使用表S4所列引物，将阳性突变体的突变位点替换为其他19种氨基酸。
【数据】菌株：B. subtilis WB600；培养基：LB（含卡那霉素）；培养时间：48h；离心：4000 g，10min；表面活性剂浓度：2%；孵育时间：4h；菌落数：约100个/位点
2.3 蛋白表达与纯化
重组WT bcPRO及其突变体在枯草芽孢杆菌WB600中过表达。纯化参照前期报道的方法略作修改，详细步骤见补充材料。纯化酶浓度用BCA蛋白定量试剂盒（Vazyme，南京）检测。酶的纯度和分子量通过SDS-PAGE分析。
【数据】表达宿主：B. subtilis WB600；定量方法：BCA法；分析手段：SDS-PAGE
2.4 酶活测定
WT bcPRO及其突变体的活性通过监测410 nm处对硝基苯胺（pNA）的吸光度进行评估。实验步骤如下：反应混合液共200 μL，包含80 μL硼砂-NaOH缓冲液（25 mM，pH 10.5）、20 μL AAPF（4 mM）和100 μL WT bcPRO或突变体酶液。反应混合液在40°C保持20 min。酶活根据产生的pNA量确定，通过测定410 nm处吸光度计算。一个酶活单位定义为在指定条件下每分钟产生1 μM pNA所需的酶量。所有实验重复两次以确保准确性和可重复性。
【数据】底物：AAPF（4 mM）；缓冲液：25 mM硼砂-NaOH（pH 10.5）；温度：40°C；时间：20min；检测波长：410nm；反应体积：200μL
2.5 WT及其突变体的生化表征
在标准条件下，于20°C至80°C范围内检测WT bcPRO及其突变体的最适温度。最适pH在25 mM硼砂缓冲液中、40°C条件下、pH 7–12范围内评估。热稳定性和pH稳定性评估中，WT bcPRO及其突变体预先在以下条件下孵育：热稳定性——pH 10.5条件下、20°C至50°C孵育2 h；pH稳定性——室温下、不同pH（8–11）孵育2 h。预孵育后，在标准测定条件下评估残留酶活。为评估表面活性剂对蛋白酶的影响，分别在H2O、2% LAS和2% AES（2EO）条件下测定酶活。评估WT bcPRO及其突变体在表面活性剂中的稳定性时，将酶与含2% LAS或AES的25 mM硼砂-NaOH缓冲液（pH 10.5）在20°C孵育指定时间。孵育4 h后用标准酶活测定法检测残留活性。动力学参数使用浓度范围为2至32 mM的AAPF测定。反应在40°C、20 min条件下进行，反应体系为25 mM硼砂-NaOH缓冲液（pH 10.5），反应混合液中含2% LAS或AES。使用Origin 2021（Stat-Ease Company, MN, USA）进行非线性回归分析，计算动力学常数Km（米氏常数）和Vmax（最大反应速率）。
【数据】温度范围：20–80°C；pH范围：7–12；热稳定性：20–50°C，2h，pH 10.5；pH稳定性：pH 8–11，室温，2h；表面活性剂浓度：2%；AAPF浓度：2–32mM；动力学拟合软件：Origin 2021
2.6 分子动力学（MD）模拟
模拟使用GROMACS 5.0.7版本和Charmm36m力场，在313 K温度下采用周期性边界条件运行100 ns。每次模拟设置三个重复以确保结果的可靠性和可重复性。从模拟的平衡状态计算均方根波动（RMSF）、均方根偏差（RMSD）、溶剂可及表面积（SASA）和回转半径（Rg）。这些指标为动力学、稳定性以及模拟期间蛋白质结构变化提供了信息。使用PyMOL软件对WT bcPRO和N212S突变体的结构、蛋白酶与AAPF（模型底物）之间的相互作用以及分子内相互作用进行可视化和详细检查。为描述蛋白质中残基的运动关系，使用Bio3D包计算动力学交叉相关矩阵（DCCM），聚焦于模拟轨迹的最后10 ns。WT bcPRO和N212S突变体的残基相互作用网络通过RING web服务器（https://ring.biocomputingup.it/）获得.xml格式文件。RINs最初基于单一结构生成，随后扩展至包含构象系综。残基间相互作用强度根据其在系综中的出现频率加权。底物通道分析基于模拟最后10 ns的轨迹数据，使用带caver 3.0插件的PyMOL进行。在轨迹的每一帧中识别并表征底物通道，随后进行聚类和评估。氨基酸残基Asp32、His62和Ser215被指定为底物通道的起始点，最小半径阈值设为0.8 Å。所需能量最低的通道被…
【数据】模拟软件：GROMACS 5.0.7；力场：Charmm36m；温度：313K；时长：100ns；重复数：3；半径阈值：0.8Å
研究结果
3.1 bcPRO在表面活性剂环境中的局限性
WT bcPRO在AES和LAS中表现出明显的失活和不稳定性。以WT在水环境中的活性记为100%，WT在2% AES存在下保持80%的活性，而2% LAS导致57%的活性损失。这与前期研究一致，表明阴离子表面活性剂对碱性蛋白酶活性的影响顺序为：LAS > LS > AES（3EO）> AES（2EO）。此外，WT bcPRO在20°C水中孵育4 h极为稳定，但在AES和LAS中孵育相同时间后，仅分别保留原始活性的57.7%和15%。分子动力学模拟结果进一步证实了bcPRO在表面活性剂中的不稳定性，表现为AES和LAS环境中的RMSD值高于H2O环境。AES和LAS等阴离子表面活性剂带有疏水链段，可通过范德华力和静电电荷吸引的联合机制穿透蛋白酶内部的疏水活性位点。这些相互作用导致形成（BR）n-蛋白酶复合物，破坏蛋白酶结构并导致酶活性失活。此外，LAS的苯环结构具有更高的电离能力，因此可能对WT bcPRO产生更强的抑制作用。这种不稳定性与WT bcPRO较低的活性和降低的稳定性相关联，限制了其工业应用潜力。因此，增强WT bcPRO在表面活性剂中的活性和稳定性对其实际应用至关重要。
构成酶底物结合口袋的氨基酸残基对其活性和稳定性至关重要。这些残基常被作为腈水合酶、D-内酯水解酶和醌依赖性脱氢酶等酶工程改造的突变靶点。因此，我们首先分析了WT bcPRO在不同环境——H2O、AES和LAS——中的底物结合口袋，如图1所示。
结果显示，参与底物结合的氨基酸在不同环境中存在差异，可能导致WT bcPRO失活。特别是在LAS环境中，催化三联体不位于底物结合口袋内，这可能是WT bcPRO在该条件下活性降低的原因。因此，改造底物结合口袋可能是增强WT bcPRO在表面活性剂中活性和稳定性的有效策略。
【数据】WT活性（2% AES）：80%；WT活性（2% LAS）：43%（即损失57%）；4h后残留活性（AES）：57.7%；4h后残留活性（LAS）：15%
3.2 底物结合口袋分析鉴定突变位点
基于底物结合口袋或底物进入通道作为调节酶活性的"天然开关"的新兴概念，我们对位于底物结合口袋且靠近活性中心的位点实施突变，研究其对WT bcPRO催化性能的影响。对WT bcPRO在H2O、AES和LAS环境中底物口袋内的氨基酸组成分析，共鉴定出5个残基：Ala150、Asn212、Gly213、Thr214和Ser215。其中，Ser215因其作为WT bcPRO催化功能必需的活性位点而被排除。此外，位于催化中心3 Å范围内的Gly213和Thr214也被排除，以保持催化中心的完整性。因此，我们聚焦于Ala150和Asn212两个候选位点，用于构建NNK突变体文库。
【数据】候选残基：Ala150、Asn212、Gly213、Thr214、Ser215；排除标准：活性位点/距催化中心<3Å
3.3 表面活性剂中活性和稳定性提高的突变体筛选
在测试的突变体中，N212S变体在表面活性剂环境中表现出显著增强的酶活性和稳定性。其在2% AES中活性比WT bcPRO高45%，在2% LAS中高60%。此外，在AES和LAS中孵育4 h后，N212S分别保持其初始活性的50%以上和45%，显著优于WT bcPRO——后者在相同条件下仅保留48%和16%的活性。这些发现强调了靶向突变策略的有效性。212位点因对酶在表面活性剂中的活性和稳定性具有显著正向影响而被确定为关键位点。
为探索其潜力，对WT bcPRO的Asn212进行了饱和突变。在测试的19个突变体中，12个突变体的酶活性低于30%，可能归因于突变残基之间的拮抗相互作用。然而，四个突变体（N212A、N212L、N212H和N212S）在2% AES和2% LAS中表现出比WT bcPRO更高的活性。具体而言，N212A、N212L、N212H和N212S在AES中的活性分别增加23.1%、10.3%、4.0%和43.7%，在LAS中分别增加27.5%、17.2%、8.2%和61.2%（图2a和b）。
在AES中孵育4 h后，WT bcPRO保留其初始活性的42%，而N212A、N212H和N212S分别保持其初始活性的43.1%、54.3%和56.9%（图2c）。类似地，突变体N212L和N212S在2% LAS中的半衰期分别延长至3 h和4 h，分别是WT的1.5倍和2倍（图2d）。值得注意的是，突变体N212S在AES和LAS中孵育后分别保持其初始活性的56.9%和46%，突显了其在两种表面活性剂中的优异稳定性。总体而言，212位点的突变体，特别是N212S，在表面活性剂环境中表现出活性和稳定性的协同提升。
为理解突变如何影响N212S在表面活性剂中的催化活性，测定了WT bcPRO和N212S对底物的动力学参数。WT bcPRO在AES和LAS中的催化效率（kcat/Km）分别为2.44 s⁻¹·mM⁻¹和1.11 s⁻¹·mM⁻¹（表1）。突变体N212S在AES（3.39 s⁻¹·mM⁻¹）和LAS（1.65 s⁻¹·mM⁻¹）中的kcat/Km值分别是WT bcPRO的1.49倍和1.39倍。这些增加主要归因于突变体更高的kcat值和更低的Km值。具体而言，N212S在AES（32.12 s⁻¹）和LAS（30.42 s⁻¹）中的kcat值分别比WT bcPRO高1.06倍和1.21倍，而Km值分别低1.3倍和1.23倍（表1）。
此外，对WT bcPRO和突变体N212S的生物物理特征进行了表征。两种酶均在40°C时表现出最大活性，WT bcPRO和N212S的最适pH分别为10.0和9.0。此外，它们在硼酸盐缓冲液中表现出相似的pH稳定性和热稳定性。这表明N212S突变特异性增强了WT bcPRO在表面活性剂中的稳定性和活性。
【数据】N212S活性提升（AES）：+45%；N212S活性提升（LAS）：+60%；4h残留活性（AES）：N212S >50%，WT 48%；4h残留活性（LAS）：N212S 45%，WT 16%；N212A/AES：+23.1%；N212L/AES：+10.3%；N212H/AES：+4.0%；N212S/AES：+43.7%；N212A/LAS：+27.5%；N212L/LAS：+17.2%；N212H/LAS：+8.2%；N212S/LAS：+61.2%；4h残留（AES）：WT 42%，N212A 43.1%，N212H 54.3%，N212S 56.9%；半衰期（LAS）：N212L 3h，N212S 4h，WT 2h；kcat/Km（WT/AES）：2.44 s⁻¹·mM⁻¹；kcat/Km（WT/LAS）：1.11 s⁻¹·mM⁻¹；kcat/Km（N212S/AES）：3.39 s⁻¹·mM⁻¹；kcat/Km（N212S/LAS）：1.65 s⁻¹·mM⁻¹；kcat（N212S/AES）：32.12 s⁻¹；kcat（N212S/LAS）：30.42 s⁻¹；最适温度：40°C（两者）；最适pH：WT 10.0，N212S 9.0
3.4 稳定突变体的结构研究
为理解动力学参数测定中发现的N212S在表面活性剂中稳定性增强的分子机制，分析了N212S与WT bcPRO复合物模型的结构特征。模拟最后10 ns期间所有骨架原子的RMSD波动保持在0.1 nm以下，表明已达到平衡。后续分子动力学（MD）结果分析聚焦于这一稳定期。WT bcPRO在AES和LAS中、313 K条件下的平均RMSD值分别为0.45 nm和0.37 nm，均高于N212S的0.21 nm和0.19 nm（图3a和b）。
这表明N212S更刚性，在AES和LAS中RMSD值更低。此外，在两种表面活性剂环境中，N212S的回转半径（Rg）值均小于WT bcPRO，表明N212S结构更紧凑（图3c和d）。此外，溶剂可及表面积（SASA）——一个反映蛋白质与溶剂接触程度的参数——也呈现相应变化趋势。
基于100 ns模拟计算了动力学交叉相关矩阵（DCCM）。图4展示了WT bcPRO和N212S在AES和LAS环境中的残基运动相关性变化。N212S突变减弱了反相关运动，增加了氨基酸残基间氢键数量，使蛋白质结构更紧凑。
利用RING 4.0计算了蛋白质结构网络（PSNs），以氨基酸为节点、链内氢键为边。图5显示了Asn212Ser突变对WT bcPRO和N212S分子内相互作用的影响。
使用CAVER 3.0预测了底物进入通道。图6展示了WT在H2O、AES、LAS以及N212S在AES、LAS中的底物通道构象。突变延长了底物进入通道，使底物能够以更有利的构象进入活性位点。
图7展示了WT bcPRO或N212S在结合口袋中形成的相互作用。N212S突变使蛋白与底物之间形成了更多相互作用，包括额外的氢键和疏水相互作用，从而增强了催化活性。
【数据】RMSD（WT/AES）：0.45nm；RMSD（WT/LAS）：0.37nm；RMSD（N212S/AES）：0.21nm；RMSD（N212S/LAS）：0.19nm；平衡判据：RMSD < 0.1nm（最后10ns）
讨论与解读
本研究通过底物进入通道工程策略显著提升了WT bcPRO在AES和LAS中的酶活性和稳定性。该技术重塑了WT bcPRO的底物进入通道，获得的突变体在AES和LAS中活性分别提高43.7%和61.2%。N212S突变体还表现出增强的稳定性，在AES和LAS中孵育4 h后分别保留其初始活性的56.9%和46%。MD模拟揭示N212S具有更紧密的折叠和更大的刚性，表现为更低的RMSD、Rg和SASA值。N212S中氨基酸残基间氢键总数增加，反相关运动减少，进一步增强了其稳定性。此外，突变导致底物通道重塑，使N212S与底物之间产生更多相互作用和更高的结合能，有助于提高其在表面活性剂中的催化活性。本研究为蛋白酶在表面活性剂环境中的性能提升提供了理性工程改造的坚实基础和宝贵见解，为洗涤剂行业开发更优生物催化剂铺平了道路。
编译者解读：本研究展示了计算驱动蛋白质工程的典型范式——从分子对接预测突变热点，到饱和突变筛选，再到MD模拟解析机制，形成了完整的"设计-验证-解释"闭环。N212S突变体在两种工业相关表面活性剂中均表现出活性与稳定性的双重提升，且改造仅涉及单个氨基酸替换，工业应用成本低、可行性高。值得注意的是，作者将底物通道而非活性位点本身作为改造靶点，这种"间接调控"策略在保持催化活性的同时重塑了酶-底物-表面活性剂三者的互作界面，思路值得借鉴。后续研究若能进一步评估N212S在真实洗涤剂配方中的长期稳定性，将更具工业说服力。
参考来源
Ma, X. Surfactant-tolerance evolution of Bacillus clausii protease for enhancing activity and stability by reshaping the substrate access tunnel. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2025. DOI: 10.1016/j.colsurfb.2024.114289
DOI: 10.1016/j.colsurfb.2024.114289