来源：Activity and stability improvement: structure-function insights into CotA from Bacillus subtilis（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
CotA是细菌多铜氧化酶家族成员，具有优异的热稳定性、耐碱性和底物广谱性，在工业生物催化、环境修复和染料降解领域具有应用价值。本研究对来源于枯草芽孢杆菌的CotA进行定点突变，构建了系列单点及双点突变体，其中T377I/T418G双突变体活性较野生型提升6.12倍，80°C热稳定性提高50%。结合分子动力学模拟，研究揭示了底物结合口袋扩大与无规卷曲比例增加分别是活性提升和热稳定性增强的结构基础。
研究背景
漆酶是一类广泛分布于自然界的含铜氧化酶，能够氧化多种酚类化合物及其他有机底物。与其他产生过氧化氢或自由基的氧化酶不同，漆酶以分子氧为末端电子受体，副产物仅为水，这一环境友好的催化特性使其在废水处理、染料脱色和纸浆漂白等工业与生物技术领域具有重要价值。氧化还原介体的存在进一步扩展了漆酶对高氧化还原电位底物的催化范围。在众多漆酶中，芽孢杆菌来源的漆酶因其结构稳健性和催化效率而备受关注。CotA由cotA基因编码，是孢子外壳的组成成分，有助于孢子抵抗氧化应激和紫外线辐射。结构上，CotA属于多铜氧化酶家族，含有四个铜原子，分为三种类型：1型（T1）、2型（T2）和两个3型（T3）铜。T1铜位点由半胱氨酸、两个组氨酸和一个甲硫氨酸配位，负责底物到T2/T3三核铜簇的初始电子传递。前期研究虽已通过定向进化、半理性设计和理性设计提升了CotA的活性与稳定性，但其背后的结构特征仍不清楚。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
来源于枯草芽孢杆菌亚种str. 168（Gene ID: 936023）的cotA基因（野生型基因）经合成后克隆至pET-28a载体。大肠杆菌DH5α和BL21分别用于基因克隆和蛋白表达。所有菌株均在Luria–Bertani（LB）培养基中于37°C培养。
【数据】菌株：大肠杆菌DH5α、BL21；培养基：LB；温度：37°C
2.2 定点突变
所有氨基酸替换均采用Fisher和Pei描述的QuikChange方法进行。以野生型cotA基因为模板，使用针对各突变位点设计的特异性引物（表S1）进行PCR扩增。根据突变位点将cotA基因分为两个片段进行PCR扩增，并在两端保留同源序列，用于无缝克隆至质粒。PCR产物与线性化质粒通过无缝克隆组装，产物转化至大肠杆菌DH5α。阳性转化子经筛选后进行目标基因的大规模克隆。为确保突变保真度，实验使用Q5 DNA聚合酶和NEB的Gibson Assembly Kit。PCR及无缝克隆条件均按制造商说明书执行。所有构建的突变体均经Sanger测序确认。含有目标突变体的质粒随后转化至大肠杆菌BL21（DE3）进行蛋白表达。
【数据】聚合酶：Q5 DNA聚合酶；试剂盒：Gibson Assembly Kit（NEB）；测序：Sanger测序；转化宿主：DH5α、BL21(DE3)
2.3 蛋白表达
携带pET28a(+)构建体（编码CotA及其突变体）的大肠杆菌BL21 (DE3)在含30 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37°C、200 rpm振荡培养过夜。将过夜预培养物以2%接种量接种至含卡那霉素（30 μg/mL）的新鲜50 mL培养基中，于37°C、200 rpm振荡培养至OD600达到0.4–0.5。随后加入IPTG和CuSO₄至终浓度均为1 mM，在15°C静置孵育30 min后，于16°C、200 rpm振荡培养24 h，之后停止振荡。细胞经离心收集，沉淀重悬于20 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）。细胞在冰上超声破碎，细胞碎片经离心（20 min，8000 g，4°C）去除。
【数据】卡那霉素浓度：30 μg/mL；接种量：2%；培养基体积：50 mL；OD600：0.4–0.5；IPTG终浓度：1 mM；CuSO₄终浓度：1 mM；诱导温度：15°C静置30 min后16°C振荡24 h；缓冲液：20 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）；离心：20 min，8000 g，4°C
2.4 酶活性及动力学分析
CotA的活性使用分光光度计/酶标仪测定，以1 mM ABTS为底物。氧化反应在柠檬酸/磷酸盐缓冲液中进行，酶活性通过420 nm处吸光度增加值计算（ε = 36,000 M⁻¹ cm⁻¹）。一个酶活性单位定义为每分钟氧化1 μmol底物所需的酶量。动力学参数在42°C、pH 4.0条件下测定，ABTS浓度范围为0.0625至30 mM。使用米氏方程拟合数据并计算动力学参数K_m和V_max。所有实验均进行三次重复。
【数据】底物：ABTS，1 mM；检测波长：420 nm；摩尔消光系数：36,000 M⁻¹ cm⁻¹；温度：42°C；pH：4.0；ABTS浓度范围：0.0625–30 mM；重复次数：3次
2.5 SDS-PAGE分析
漆酶的分子量采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定。参照Laemmli的方法，SDS-PAGE使用12%分离胶和4%浓缩胶。蛋白染色使用考马斯亮蓝。
【数据】分离胶浓度：12%；浓缩胶浓度：4%；染色：考马斯亮蓝
2.6 最适pH与pH稳定性
为研究pH对漆酶活性的影响，在42°C下以ABTS为底物，在pH 3.0至8.0的柠檬酸/磷酸盐缓冲液中进行实验。pH稳定性测定中，漆酶在柠檬酸/磷酸盐缓冲液（pH 3.0和pH 6.0）及Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）中于4°C孵育。在不同时间间隔（1–6天）取样，以ABTS为底物在最优条件下（42°C、pH 4.0）按标准活性测定法测量残余活性。所有实验均进行三次重复。
【数据】pH范围：3.0–8.0；稳定性缓冲液：柠檬酸/磷酸盐（pH 3.0、6.0）、Tris-HCl（pH 9.0）；孵育温度：4°C；时间：1–6天；测定条件：42°C、pH 4.0
2.7 最适温度与温度稳定性
CotA的最适温度通过在柠檬酸/磷酸盐缓冲液（pH 4.0）中、以ABTS为底物、在不同温度（30–90°C）下测定活性来确定。热稳定性评估中，酶在80°C下孵育指定时间（60–300 min），随后测定残余活性。所有实验均进行三次重复。指数衰减常数（λ）通过将实测活性拟合至方程A_t = A₀e^(−λt)确定，其中A₀和A_t分别表示初始和取样时间点的酶活性，λ为衰减常数，t为取样时间。酶半衰期（t₁/₂）按t₁/₂ = ln2/λ计算。
【数据】温度范围：30–90°C；缓冲液：柠檬酸/磷酸盐（pH 4.0）；热稳定性温度：80°C；孵育时间：60–300 min；半衰期公式：t₁/₂ = ln2/λ
2.8 分子对接
CotA的三维晶体结构从蛋白质数据银行获取（PDB ID: 1GSK）。分子对接使用Yasara Structure（版本24.10.5）中的宏命令‘dock_run.mcr’执行，以获得不同突变体与ABTS的构象和结合能。对接盒定义为以T1铜原子为中心的立方体区域，边长为8 Å。正结合能表示有利的结合相互作用，负结合能表示不利或无结合。
【数据】PDB ID：1GSK；软件：Yasara Structure 24.10.5；对接盒：以T1铜为中心的立方体，边长8 Å
2.9 分子动力学（MD）模拟
所有MD模拟均在Yasara Structure（版本24.10.5）中使用Amber 14力场、采用周期性边界条件进行。模拟使用Yasara Structure提供的宏命令‘md_run.mcr’执行。首先，去除CotA PDB文件中的配体和多余水分子。然后将结构置于[90 × 90 × 90] Å的模拟盒中，填充水分子，并添加Na⁺离子中和。进行能量最小化以消除系统中的不合理接触。前5000步采用最陡下降法，最后5000步采用共轭梯度优化。能量最小化后，每个系统从0 K逐步升温至310 K。平衡在等温（303 K）和等压（1 bar）条件下使用Langevin动力学进行，碰撞频率为1.0 ps⁻¹，持续500 ps。随后在310 K和1 bar下进行500 ns的生产模拟，每0.1 ns记录一次快照。高温模拟在353.15 K下进行。
【数据】力场：Amber 14；软件：Yasara Structure 24.10.5；模拟盒：[90 × 90 × 90] Å；中和离子：Na⁺；最小化：最陡下降5000步+共轭梯度5000步；平衡：303 K、1 bar、碰撞频率1.0 ps⁻¹、500 ps；生产模拟：310 K、1 bar、500 ns、快照间隔0.1 ns；高温模拟：353.15 K
2.10 溶剂通道的预测与计算
CotA的溶剂通道使用CAVER Web 1.0预测，参照Jan Stourac等人的方法。通道入口和出口的大小通过YASARA宏命令‘group_distance’测量特定关键残基之间的距离来确定。
【数据】软件：CAVER Web 1.0；距离计算：YASARA宏命令‘group_distance’
2.11 统计分析
酶活性数据以平均值±标准差（SD）表示。统计学显著性通过单因素方差分析（ANOVA）获得的P值确定。模拟轨迹使用YASARA内置功能分析。整体和局部柔韧性分别通过均方根偏差（RMSD）和均方根波动（RMSF）评估。每个残基的相对运动使用动态交叉相关矩阵（DCCM）评估。氨基酸残基间距离使用YASARA结构模块的内置功能计算。所有图形使用Python中的“Matplotlib”模块绘制。
【数据】统计方法：单因素方差分析（ANOVA）；分析指标：RMSD、RMSF、DCCM；绘图：Python Matplotlib
研究结果
3.1 突变位点选择与CotA突变体的酶活性
结合口袋附近的残基调节底物识别、取向和结合亲和力，从而控制酶的特异性、催化效率和复合物稳定性。口袋边缘的突变体可以增强对ABTS的活性。本研究鉴定了T1铜中心12.5 Å范围内的所有氨基酸残基，并根据距离选择T415（8.82 Å）和T418（7.14 Å）。此外，根据前期文献选择口袋边缘的T377、G323和Q442。构建了五个单点突变体（T415D、T418K、T418G、T377I、Q442A、G323）和两个双点突变体（T377I/T418G、G323S/T418G）。所选突变位点的位置如图1所示。
SDS-PAGE分析（图S1）显示，从枯草芽孢杆菌亚种克隆的CotA分子量约为65 kDa，突变对蛋白表达水平影响很小。所有突变体均表现出增加的比酶活性（图2）。T377I/T418G突变体的提升幅度最大（6.12倍），其次是Q442A、T377I、G323S/T418G和T418G突变体（2.6–3.4倍）。T415D和T418K突变体的提升较为温和（1.1–1.3倍）。
动力学参数（表1）显示不同突变体之间最大反应速率（V_max）和米氏常数（K_m）存在差异。所有CotA突变体对ABTS的K_m值均降低，表明底物亲和力增强。其中，Q442A、T377I/T418G和G323S/T418G突变体具有统计学显著改善（P < 0.01），而T415D和T418K突变体表现出不显著但一致的K_m降低，提示可能存在中等程度的效应。然而，突变对酶的V_max影响不同。某些突变体（T418K、T418G、T415D）的V_max值高于野生型CotA，而其他突变体（Q442A、T377I/T418G、G323S/T418G）的V_max较野生型酶降低。
【数据】CotA分子量：约65 kDa；T377I/T418G活性提升：6.12倍；Q442A、T377I、G323S/T418G、T418G活性提升：2.6–3.4倍；T415D、T418K活性提升：1.1–1.3倍；K_m显著降低：P < 0.01
3.2 CotA突变体表现出碱性稳定性
为评估突变体对CotA pH适应性的影响，本研究测定了CotA及其突变体在不同pH值下的酶比活性和稳定性。结果表明，G323S/T418G和T418G突变体的最适pH为5.0，而Q442A、T377I、T377I/T418G、T415D和T418K突变体的最适pH为4.0（图3A、B）。
pH稳定性结果表明，CotA在酸性（pH 3.0）和微酸性（pH 6.0）条件下表现出较差的pH稳定性（图3C、D、E、F）。在pH 3.0和pH 6.0、4°C孵育1天后，野生型和所有突变体的酶比活性均下降80–90%。没有一个突变体显著改善CotA在酸性条件下的稳定性。尽管T377I/T418G突变体在pH 3.0下保留50%的活性（图3C），但这是由于T377I/T418G突变体极低的绝对酶活性造成的表观结果（图3D）。因此，这些突变体对CotA的酸敏感性没有显著改善。然而，该酶在碱性（pH 9.0）条件下表现出优异的稳定性（图3G、F）。在4°C孵育6天后，野生型和所有突变体均保留近100%的酶活性，点突变未导致碱性条件下的稳定性降低。这一结果与前期研究一致，表明CotA是一种耐碱酶。
【数据】最适pH：G323S/T418G和T418G为pH 5.0；其余突变体为pH 4.0；酸性孵育后活性下降：80–90%；pH 9.0孵育6天后残余活性：近100%
3.3 CotA突变体表现出改善的高温稳定性
接下来分析温度对野生型CotA及其突变体活性和热稳定性的影响（图4A）。野生型和突变体均在90°C达到最大活性，这些突变体的引入对其最适温度没有影响。
然而，T377I/T418G突变体增强了CotA在80°C下的稳定性。在80°C孵育4 h后，野生型漆酶的残余酶活性为30%，而T377I/T418G突变体保留50%的活性。其他突变体的稳定性没有显著变化（图4C、D）。同时，还研究了野生型CotA及其突变体的半衰期（t₁/₂）（表1）。野生型CotA的t₁/₂为100.7 min，而T377I/T418G的t₁/₂为118.8 min，约为野生型的1.18倍。有趣的是，还观察到粗酶溶液在80°C冰浴孵育1 h后，酶活性增加20%–50%，但在2 h后开始下降。这可能是由于高温下的“激活”过程——某些原本无活性或相对不稳定的区域发生构象变化，改善了底物结合或催化效率。
【数据】最适温度：90°C；80°C孵育4 h残余活性：野生型30%，T377I/T418G 50%；t₁/₂：野生型100.7 min，T377I/T418G 118.8 min；冰浴80°C 1 h活性增加：20%–50%
3.4 突变对动态结构的影响
为研究突变体对CotA动态结构的影响，对野生型CotA及其七个突变体进行了500 ns的MD模拟，并分析了轨迹（图5A）。
在整个模拟过程中，所有漆酶均保持相对稳定的R_g，表明其结构保持稳定，突变未引起显著的折叠、去折叠或构象变化。然而，与野生型CotA相比，大多数突变体的R_g有所增加，其中T377I突变体表现出降低。R_g增加范围为0至0.5，表明这些突变体主要使CotA结构变得更松散或更伸展，而T377I突变体则变得更紧凑。
接下来分析模拟期间的RMSD，以探索突变体引起的动态构象变化。结果（图5B）显示，T377I突变体的RMSD与野生型CotA相似，而其他突变体的RMSD在一定范围内增加。G323S/T418G、T418K、T418G和T377I/T418G突变体的RMSD较野生型CotA增加0–1 Å。除T377I/T418G突变体在260至300 ns之间出现较大波动外，其他突变体的RMSD波动相对较小。Q442A和T415D的RMSD波动最大。Q442A突变体的RMSD从250 ns开始增加，在330 ns达到最大值5.3 Å，随后下降并稳定。类似地，T415D突变体的RMSD在300 ns时增加，但幅度较小，随后趋于稳定。
最后，为研究受这些突变影响的具体氨基酸残基，分析了RMSF。野生型CotA表现出相对较小的波动，最大RMSF为4.1 Å，出现在氨基酸353和362处，提示这些位置可能代表柔性区域（图5C）。其他突变体的氨基酸残基波动与野生型CotA相似，某些位置波动较小，其他位置稳定性增加；但Q442A突变体表现出显著波动，特别是在200–220残基之间发生较大移动。最大RMSF出现在残基214处，值为9.3 Å。
【数据】模拟时间：500 ns；R_g增加范围：0–0.5；RMSD增加：0–1 Å；Q442A最大RMSD：5.3 Å（330 ns）；野生型最大RMSF：4.1 Å（残基353、362）；Q442A最大RMSF：9.3 Å（残基214）
3.5 结合口袋的扩大有利于底物结合
通常，结合口袋的大小与酶活性密切相关，因为它直接影响底物的进入。T377I/T418G突变体酶活性的增加可能归因于突变引起的结合口袋大小的变化。为验证这一假设，计算了T377I/T418G突变体结合口袋中三组氨基酸残基之间的距离（图6A）。
结果表明，Arg 416-Pro 384和Thr 418-Gly 321之间的距离在野生型CotA和T377I/T418G突变体中相似（图6B）。然而，T377I/T418G突变体中Arg 416-Gly 323之间的距离比野生型CotA更大。底物结合口袋形状的调节……
【数据】距离比较：Arg416-Pro384、Thr418-Gly321在野生型与突变体中相似；Arg416-Gly323在T377I/T418G中增大
讨论与解读
本研究通过定点突变和分子动力学模拟，揭示了CotA漆酶活性与稳定性提升的结构基础。结合口袋附近的突变，特别是T377I/T418G双突变体，在保持整体结构完整性的同时提高了催化活性和热稳定性。位于结合口袋边缘的T377I突变改善了CotA的稳定性，而位于结合口袋中心的T418G突变增强了其酶活性。活性和稳定性的提升源于T377I和T418G突变的协同效应。这些结果为CotA的进一步工程改造提供了策略。当前研究的突变位点选择主要聚焦于底物结合口袋附近的残基，尚未充分探索远端位点对酶活性的潜在影响。远端位点可能通过影响整体结构动力学或酶-底物相互作用间接调节催化性能，从而发现更多具有更大工业应用潜力的突变。
编译者解读：本研究采用"理性设计+MD模拟验证"的经典策略，精准定位结合口袋边缘残基进行突变，以6.12倍的活性提升和50%热稳定性改善给出了清晰的结构—功能关联证据。值得注意的是，研究将活性增益归因于结合口袋扩大、将热稳定性增益归因于无规卷曲比例增加，这种将宏观酶学性质与微观结构参数直接挂钩的分析路径，为漆酶的工业应用导向改造提供了可复用的设计逻辑。然而，突变体V_max与K_m变化方向不一致的现象提示催化机制可能比预期复杂，远端残基的协同效应仍值得深入挖掘。
参考来源
He W. Activity and stability improvement: structure-function insights into CotA from Bacillus subtilis. International Journal of Biological Macromolecules, 2025. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.145156
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.145156