来源：Directed evolution of a serine protease LsPLAase in Bacillus subtilis for high-yield secretory production and efficient depolymerization of polylactic acid（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
聚乳酸（PLA）虽标榜可生物降解，但其在自然环境中的降解速率远不能满足废弃塑料循环需求。本研究以嗜热放线菌来源的PLA解聚酶LsPLAase为对象，利用枯草芽孢杆菌分泌表达系统，结合发酵优化、定向进化、组合突变及5-L生物反应器放大，获得优势突变体LsPLAaseIWFI（A13I/S136W/S138F/W141I），蛋白产量达3.21 g/L，酶活6.7 U/mL，对多种PLA材料的解聚效率较野生型提升70%，并超越商业蛋白酶ProteinK。
研究背景
传统塑料造成的环境污染已构成严峻生态危机，可生物降解聚合物为塑料废物积累提供了有前景的替代方案。聚乳酸（PLA）是以可再生生物质来源乳酸合成的纯生物基热塑性聚酯，凭借其生物降解性和机械性能，在包装、医疗、汽车、电子、纺织、农业及3D打印等领域应用日益广泛。然而，PLA在环境条件下的生物降解速率很低，需要特定温湿度的工业堆肥条件。酶促解聚通过提高单体回收或增值利用，成为缓解环境负担的可持续策略。受聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）酶法回收突破的启发，PLA酶法回收研究取得显著进展，工程化解聚酶如酯酶RPA1511-R5和ProteinTFLTIER展现出增强性能，24小时内转化率超过85%。然而，解聚酶产能不足和产量低下仍是制约PLA生物可回收性的瓶颈。
研究方法
2.1 培养基与试剂
所有分析级化学试剂购自中国阿拉丁化学有限公司。Luria-Bertani（LB）培养基组成为：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl。2 × Super Rich（SR）培养基组成为：30 g/L蛋白胨、50 g/L酵母提取物、6 g/L磷酸氢二钾（K2HPO4）。ProteinK（EC 3.4.21.64，来源于Tritirachium album）购自Takara（中国北京）。乳酸标准品购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。Ingeo™ 3260HP和4032D PLLA颗粒购自NatureWorks LLC（美国明尼苏达州明尼通卡）；MI4、MI30及PLLA产品购自金发科技股份有限公司（中国广州）。
PLLA乳液（1%，w/v）的制备：将0.8 g 3260HP PLLA溶于20 mL氯仿，用80 mL蒸馏水通过超声均质乳化，在50°C下完全蒸发有机溶剂后加入琼脂培养基。PLLA粉末的制备：将适量PLLA颗粒、薄膜或其他产品类型置于液氮低温室中，以80 Hz频率启动低温冷冻程序1分钟，处理后的材料过60目筛（孔径250 μm），收集筛下部分用于后续测定。
【数据】LB培养基：10 g/L胰蛋白胨+5 g/L酵母提取物+10 g/L NaCl；SR培养基：30 g/L蛋白胨+50 g/L酵母提取物+6 g/L K2HPO4；PLLA乳液浓度：1%（w/v）；氯仿用量：20 mL；蒸馏水：80 mL；蒸发温度：50°C；冷冻频率：80 Hz；时间：1 min；筛网：60目（250 μm）
2.2 LsPLAase在大肠杆菌中的生产与纯化
来源于嗜热放线菌Laceyella sacchari的丝氨酸蛋白酶LsPLAase（登录号：ADL09141）经密码子优化用于大肠杆菌表达，在其N端引入pelB信号肽，并克隆至pET-29a(+)载体的Xho I和Nde I限制性酶切位点之间（GenScript，中国南京）。重组质粒转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞。挑选单克隆接种于5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37°C、220 rpm振荡过夜培养。然后将1%（v/v）过夜培养物转接至摇瓶LB培养基中，37°C、220 rpm振荡培养至600 nm光密度（OD600）约0.5。加入异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度0.02 mM诱导蛋白表达，16°C、160 rpm振荡培养24小时。离心收集细胞沉淀，重悬于50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 9.0），超声破碎15分钟，离心收集上清液。目标蛋白使用镍亲和层析纯化。用30 mM咪唑洗去未结合污染物后，依次用100 mM和200 mM咪唑阶梯洗脱目标蛋白。洗脱组分随后置换至无咪唑的50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）中，并添加150 mM NaCl。蛋白纯度通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）确认，蛋白浓度以牛血清白蛋白（BSA）为标准品通过Bradford法测定。
【数据】卡那霉素：50 μg/mL；接种量：1%（v/v）；IPTG终浓度：0.02 mM；诱导温度：16°C；诱导时间：24 h；转速：160 rpm；超声时间：15 min；缓冲液：50 mM Tris-HCl（pH 9.0）；咪唑洗脱：30 mM→100 mM→200 mM；NaCl：150 mM
2.3 LsPLAase在枯草芽孢杆菌中的分泌生产
对于枯草芽孢杆菌中的异源蛋白生产，以LsPLAase-pET-29a(+)为模板扩增LsPLAase基因，在其N端无缝融合AprE信号肽。随后分别引入PacI启动子、T0终止子以及来自枯草芽孢杆菌SCK6基因组的5′端和3′端同源臂。将构建体转化至感受态枯草芽孢杆菌SCK6细胞。37°C过夜培养后，挑取单克隆并通过菌落PCR和测序验证。阳性克隆接种于5 mL含5 μg/mL氯霉素的LB培养基中，37°C、220 rpm振荡培养至OD600约2.0，然后以1.5%（v/v）种子接种量转接至含200 mL SR培养基的摇瓶中，37°C、220 rpm轨道振荡培养48小时。离心分别收集培养上清液和细胞沉淀。蛋白表达和纯度通过SDS-PAGE确认，蛋白浓度用Bradford法定量。
【数据】氯霉素：5 μg/mL；接种量：1.5%（v/v）；培养基：200 mL SR；温度：37°C；转速：220 rpm；时间：48 h
2.4 枯草芽孢杆菌中LsPLAase培养条件优化
LsPLAase在枯草芽孢杆菌中生产的培养基优化在摇瓶培养水平使用2 × SR培养基进行。碳源优化：分别向SR培养基中添加40 g/L甘油、乳糖、葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉作为碳源，在固定氮源30 g/L蛋白胨条件下筛选对LsPLAase生产的影响。随后在10–60 g/L浓度范围内进一步优化最佳碳源。氮源优化在最佳碳源基础上类似进行，筛选40 g/L单一氮源，包括酵母提取物、蛋白胨、牛肉膏、玉米浆和豆粕，以及酵母提取物与蛋白胨等比例复合物。随后在20–80 g/L范围内优化优势氮源浓度。确定最佳培养基组成后，分别考察培养温度（30–39°C）、初始培养pH（6.0–8.0）、接种量（0.5–3%，v/v）和培养时间（12–72 h）的影响。每次测定设三次重复，测定参数包括OD600、蛋白浓度和对对硝基苯基辛酸酯（pNPO）的水解活性。最后，基于单因素结果，使用Design-Expert 13.0软件（Stat-Ease Inc.，美国）实施三因素三水平Box-Behnken设计（BBD），优化碳源浓度（A）、氮源浓度（B）和初始培养pH（C）之间的最有效交互作用。每个实验点设三次重复，酶活拟合为二次多项式模型。模型通过方差分析（ANOVA）验证，生成3D响应面图以可视化交互作用并预测最优点。基于3D响应等高线图的结果，以100 mL体积进行摇瓶发酵验证。
【数据】碳源筛选浓度：40 g/L；碳源优化范围：10–60 g/L；氮源筛选浓度：40 g/L；氮源优化范围：20–80 g/L；温度范围：30–39°C；pH范围：6.0–8.0；接种量范围：0.5–3%（v/v）；时间范围：12–72 h；发酵验证体积：100 mL
2.5 LsPLAase对pNPO的酶活测定
LsPLAase的酶活通过以pNPO为底物的标准测定法表征。100 μL反应体系包含：80 μL 50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）、10 μL 1 mM pNPO底物和10 μL适当浓度的酶溶液。测定在40°C下进行，通过向蛋白溶液中加入各种底物启动反应，在酶标仪上于405 nm连续记录吸光度5分钟，间隔5秒。对照反应在相同条件下用缓冲液代替酶测定。一个酶活单位（U）定义为在40°C下每分钟催化生成1 μM对硝基苯酚所需酶量。所有测定设三次重复。
【数据】反应体系：100 μL；缓冲液：80 μL 50 mM Tris-HCl（pH 9.0）；底物：10 μL 1 mM pNPO；酶液：10 μL；温度：40°C；波长：405 nm；检测时间：5 min；间隔：5 s
2.6 定向进化文库构建及LsPLAase突变体筛选
使用易错突变试剂盒（Agilent Technologies，美国加州圣克拉拉）以AprE-LsPLAase融合构建体为模板引入随机突变，将扩增产物转化至枯草芽孢杆菌SCK6感受态细胞。转化后的感受态细胞稀释100倍，取适量菌悬液均匀涂布于含PLLA乳液（0.2%，w/v）的LB琼脂平板上。37°C培养48小时后，挑选菌落周围透明圈明显大于原始菌株的菌落，转接至新鲜PLLA乳液平板。
【数据】PLLA乳液浓度：0.2%（w/v）；培养温度：37°C；培养时间：48 h；稀释倍数：100倍
研究结果
3.1 LsPLAase在枯草芽孢杆菌与大肠杆菌中表达的比较
目前，从L. sacchari LP175（ADL09141）制备PLA降解酶LsPLAase依赖于天然分离菌株的固态发酵，这总是涉及内源粗淀粉降解酶的共表达，使纯化复杂化并阻碍工业化。在大肠杆菌中的异源表达主要形成包涵体（见补充材料），纯化50 mL发酵液并浓缩至1 mL后，可溶性蛋白浓度仅为0.01 g/L，酶活仅为0.18 U/mL（见补充材料）。Lomthong等人探索了LsPLAase在大肠杆菌中与麦芽糖结合蛋白（MBP）标签融合表达，从50 mL发酵体系中获得纯化蛋白产量0.038 mg。虽然该方法提高了可溶性，但通过此类标签表达的塑料降解酶通常需要在酶反应前进行蛋白水解切割以去除标签，避免干扰底物结合或活性。这一额外步骤显著增加了大规模工业应用的复杂性和成本。为解决这些限制，开发了一种将LsPLAase基因与AprE信号肽融合整合至枯草芽孢杆菌SCK6基因组的替代系统，实现了无包涵体形成的高效分泌表达（见补充材料），发酵上清液中蛋白浓度达0.24 mg/mL，酶活0.87 U/mL（见补充材料），50 mL发酵体系总蛋白产量达12 mg。这种高效分泌表达平台无需可溶性标签、复杂纯化和不当糖基化，将最小化下游处理以促进工业应用。
【数据】大肠杆菌体系：蛋白浓度0.01 g/L，酶活0.18 U/mL；MBP标签体系：纯化蛋白0.038 mg/50 mL；枯草芽孢杆菌体系：蛋白浓度0.24 mg/mL，酶活0.87 U/mL，总蛋白12 mg/50 mL
3.2 枯草芽孢杆菌中LsPLAase生产培养条件优化
尽管取得了上述进展，LsPLAase当前的表达水平仍不足以满足大规模PLA废物解聚的需求，需要对其发酵培养基和条件进行系统优化。在40 g/L测试碳源中，乳糖和甘油产生最高的酶产量，蛋白浓度分别为0.33 g/L和0.24 g/L，酶活分别为1.27 U/mL和1.0 U/mL（图1a）。乳糖有利于更高的分泌，但导致较低的生物量，仅为甘油的62%（图1a），限制了长时间发酵中的持续表达。葡萄糖和蔗糖表达量极低，蛋白浓度仅为0.06 g/L，酶活0.7 U/mL，尽管培养24小时后实现了OD600 9.5–12的高生物量（图1a），这可能是通过CcpA途径的碳分解代谢物阻遏（CCR）所致。淀粉表现居中，可能是由于需要淀粉酶共表达的partial水解。甘油和乳糖组合的表现低于各自单独使用，可能是由于竞争性摄取（图1a）。甘油因经济可行性和持续发酵能力被选为最优碳源，表达量在50 g/L内呈比例增加，60 g/L时下降可能是由于渗透压胁迫或底物抑制（图1c）。
在最佳碳源条件下筛选40 g/L氮源，酵母提取物加蛋白胨（复合）和豆粕表现优异，前者蛋白浓度达0.36 g/L，酶活1.37 U/mL，后者蛋白产量相当但酶活较低（1.0 U/mL）（图1b），不适用于会发生酶失活的长时间发酵。复合氮源的浓度优化（20–80 g/L）在50 g/L时达到峰值，蛋白0.42 g/L，酶活1.47 U/mL（图1d）。
温度和pH对枯草芽孢杆菌的生长及其产酶能力有显著影响。在30–40°C和pH 6.5–8.0范围内系统探索最佳发酵条件，单因素实验表明枯草芽孢杆菌SCK6生产LsPLAase的理想温度为37°C，最适pH为7.0（图2a-b）。接种量和发酵时长进一步调控生物量积累和次级代谢，从而调节酶产量。结果确定最佳接种量为1.5%，发酵时间为48小时，平衡了指数生长期生物量与酶产量（图2c-d），避免了营养耗竭或抑制性副产物积累。
采用Box-Behnken设计的响应面法（RSM）精细优化三个主要因素（甘油浓度、氮源浓度和初始pH）之间的交互作用，在51.3 g/L甘油、58.7 g/L复合氮源和pH 7.21的最佳条件下实现了更高的生产效率，预测最大酶活为1.65 U/mL（见补充材料）。验证实验获得蛋白浓度0.48 g/L，酶活1.64 U/mL。这些优化增强了LsPLAase在工业PLA生物回收中的潜力。
【数据】乳糖：蛋白0.33 g/L，酶活1.27 U/mL；甘油：蛋白0.24 g/L，酶活1.0 U/mL；乳糖生物量为甘油的62%；葡萄糖/蔗糖：蛋白0.06 g/L，酶活0.7 U/mL，OD600 9.5–12；复合氮源：蛋白0.36 g/L，酶活1.37 U/mL；豆粕：酶活1.0 U/mL；最佳复合氮源浓度50 g/L：蛋白0.42 g/L，酶活1.47 U/mL；最佳温度37°C；最佳pH 7.0；最佳接种量1.5%；最佳发酵时间48 h；RSM预测：51.3 g/L甘油+58.7 g/L氮源+pH 7.21，预测酶活1.65 U/mL；验证：蛋白0.48 g/L，酶活1.64 U/mL
3.3 LsPLAase有益突变体的定向进化与筛选
通过随机突变的定向进化是增强酶性能的强大工具。通过易错PCR在枯草芽孢杆菌SCK6中生成LsPLAase突变文库（图3a）。基于透明圈测定的PLLA乳液琼脂平板进行初始高通量筛选，从含2,400个克隆的文库中分离出150个水解晕圈明显较大的阳性克隆。这些阳性克隆经平行重复筛选，获得15个持久候选突变体（命名为M1–M15）（图3b）。
将15个持久候选突变体推进至5 mL优化培养基试管发酵，定量分析上清液，获得蛋白浓度0.34–0.46 mg/mL和pNPO酶活0.86–1.51 U/mL。六个有益突变体（M1、M3、M9、M10、M11、M12）的pNPO酶活高于野生型，其中M11的酶产量和pNPO酶活最高，为野生型的1.26倍（图3c）。在50 mL摇瓶体系中进一步验证证实了上述结果（图3e），但仅M3和M11表现出蛋白浓度增加，分别为野生型的1.15倍和1.24倍（图3d）。pNPO酶活的增强可能源于蛋白表达水平的提升或内在催化性能的改善。对3260HP PLLA粉末的解聚测定显示，M3和M11释放的乳酸与野生型相当（28 mM），而其他突变体产生更高乳酸量，其中M1和M9实现最大增幅，分别为1.37倍和1.31倍（图3f）。因此，M3和M11性能提升主要源于表达上调，而其他突变体可能反映催化效率的增强。
【数据】突变文库：2,400个克隆；初筛阳性：150个；二次筛选：15个（M1-M15）；试管发酵：蛋白0.34–0.46 mg/mL，pNPO酶活0.86–1.51 U/mL；M11：野生型的1.26倍；M3蛋白：1.15倍；M11蛋白：1.24倍；野生型乳酸释放：28 mM；M1乳酸：1.37倍；M9乳酸：1.31倍
3.4 组合突变进一步增强进化LsPLAase
测序分析显示，M3（A13V）和M11（A13I）的突变位点位于AprE信号肽内相同位置的疏水H结构域（残基6–20）。该替换似乎增强了信号肽H结构域的疏水性，从而促进Sec途径转运过程中的α-螺旋稳定性以及与SecA/Y机器的相互作用。此外，M1（S138F）、M9（W141I）、M10（S138I）和M12（S136W）的突变位点统一位于...
【数据】突变位点：M3（A13V）、M11（A13I）位于AprE信号肽H结构域；M1（S138F）、M9（W141I）、M10（S138I）、M12（S136W）位于催化结构域附近
3.5 5-L生物反应器放大发酵
3.6 LsPLAaseIWFI对多种PLA材料的解聚性能比较
讨论与解读
尽管近年来PLA解聚酶的开发取得了显著进展，但在催化性能和可规模化制备方面仍存在一些挑战。ProteinK作为基准酶表现出不足的解聚效率；工程化ProteinTFLTIER和RPA1511-R5性能有所提升，但表达依赖大肠杆菌系统，酶产量仍不足以满足大规模解聚需求。本研究利用基于枯草芽孢杆菌的分泌系统生产LsPLAase，整合发酵优化、定向进化、组合突变和放大发酵以提升酶产量和活性。通过AprE信号肽增强分泌、通过三联体附近环区修饰提升催化效率的优势突变体，可有效解聚多种实际PLA材料。凭借通用性和可扩展性方面的优势，优势突变体LsPLAaseIWFI成为工业可持续PLA废物管理的优选候选者，通过高效单体回收降低环境风险、碳足迹和资源浪费。
编译者解读
本研究提供了一个值得关注的范式：将"分泌信号肽工程"与"催化结构域定向进化"双轨并行，而非仅聚焦酶活性本身。A13I信号肽突变提升分泌效率的思路，对其它难以可溶性表达的塑料降解酶具有直接借鉴价值。3.21 g/L的产量与大肠杆菌体系的0.01 g/L形成两个数量级的差距，这使工业应用的经济性发生了质变。不过，6.7 U/mL的酶活对大规模PLA废物处理而言仍有提升空间，且研究未详述LsPLAaseIWFI在实际PLA废物流（含添加剂、染料等复杂组分）中的长期稳定性。未来若能在酶热稳定性和底物耐受性方面继续进化，该体系有望成为PLA生物回收的工业基准平台。
参考来源
Cheng, X.-T. Directed evolution of a serine protease LsPLAase in Bacillus subtilis for high-yield secretory production and efficient depolymerization of polylactic acid. Bioresource Technology, 2026.
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134441
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134441