来源：Experimental evolution of Bacillus inaquosorum reveals multi-omics adaptation for polystyrene nanoplastic bioremediation（Total Environment Microbiology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
塑料污染已成为全球性生态危机，但微生物降解纳米塑料的遗传机制仍鲜为人知。本研究对一株分离自死亡谷国家公园仙人掌根际的 Bacillus inaquosorum 菌株进行约210代的实验进化，使其在无添加剂聚苯乙烯纳米塑料环境中获得显著适应能力——进化菌株在纳米塑料为唯一碳源的条件下的细胞密度比祖先菌株最高提升22倍。通过全基因组重测序与转录组分析，研究揭示了金属转运、氧化应激调控和中枢代谢等多层面的协同进化机制，为塑料生物修复提供了候选途径。
研究背景
塑料污染是当今最紧迫的环境危机之一。联合国环境规划署预计，全球塑料产量到2050年将翻三倍，从每年4亿吨增至11亿吨。微塑料（<5 mm）和纳米塑料（<1 µm）尤其棘手——它们渗透食物链、沿营养级生物富集，并携带有害污染物，威胁水生生物乃至人类健康。农业通过地膜覆盖、灌溉、堆肥和污泥施用等途径将微塑料和纳米塑料引入土壤。尽管在识别作用于化学改性塑料的酶方面已取得进展，但纳米塑料降解的生物学机制仍基本未知。实验进化是探索微生物适应新环境能力的强有力工具，其优势在于能够揭示理性设计难以预见的遗传和生理机制。
研究方法
2.1 实验设计概述
本研究采用整合策略，结合实验进化、全基因组测序和转录组分析，研究细菌对聚苯乙烯纳米塑料的适应。Bacillus inaquosorum 在浓度递增的无添加剂聚苯乙烯纳米塑料条件下经历21次传代。随后进行基因组重测序以鉴定适应性突变，并通过RNA-seq比较祖先菌株与进化菌株的转录响应。这一多组学框架允许在控制潜在混杂变量的同时，在基因组和基因表达水平验证进化变化。
2.2 聚苯乙烯（PS）纳米塑料的制备
使用无标记、纯、无添加剂的聚苯乙烯（PS）纳米塑料（标称粒径25 nm；0.3% w/v 无菌水悬浮液含0.01% Tween-20；Lab 261，美国加利福尼亚州）。Tween-20浓度（0.01%）的选择基于先前研究——该浓度在相似条件下对细菌生长或生物膜形成无抑制作用。这确保观察到的响应反映塑料-微生物相互作用而非表面活性剂代谢。为维持无菌状态，将纳米塑料悬浮液通过0.2 µm膜过滤。无菌储备液用于在含0.8%葡萄糖的Bushnell-Haas（BH）培养基中制备浓度为100至200 mg/L的PS纳米塑料。同时制备仅含0.8%葡萄糖（无塑料）的对照BH培养基。该纳米塑料制备方案统一应用于所有实验阶段：进化、适应性测定和转录组分析，以确保方法一致性。所有培养均在37°C和近中性pH下进行，反映Bacillus物种的既定最适生长范围。
【数据】PS粒径：25 nm；Tween-20：0.01%；PS浓度范围：100-200 mg/L；葡萄糖：0.8%；温度：37°C；pH：近中性
2.3 研究菌株与细菌培养制备
对 Bacillus inaquosorum 菌株 EC30O5B-F5 进行实验室进化。该菌株为中温细菌，经美国国家公园管理局许可，分离自美国死亡谷国家公园（36°25.573′N，117°11.602′W）沿移民峡谷路海拔1208.5米处的 basilaris 仙人掌（beavertail cactus）根际。最近的分类学修订将该生物（原称为 B. subtilis subsp. inaquosorum）重新分类。从Lysogeny Broth琼脂平板（LB，Fisher Scientific目录号BP1425）挑选单菌落建立三个谱系。每个谱系（F5L1、F5L2和F5L3）接种到无菌LB中，在旋转摇床培养箱中37°C、200 rpm好氧培养7天，使培养物在后续实验使用前达到稳定期。对于三个谱系中的每一个，取30 µL 7天LB培养物接种到含30 mL Bushnell-Haas（BH）培养基的250 mL锥形瓶中，并补充500 µL 0.8%葡萄糖溶液，最终葡萄糖浓度约为0.13 g/L，培养48 h。除添加的葡萄糖和PS外，BH衍生培养基不含碳源。
【数据】菌株：Bacillus inaquosorum EC30O5B-F5；培养基：LB + BH；温度：37°C；转速：200 rpm；时间：7天（LB）/ 48 h（BH）；接种量：30 µL；葡萄糖终浓度：约0.13 g/L
2.4 实验进化方案
将每个谱系（F5L1、F5L2、F5L3）分为两条线：一条暴露于PS+葡萄糖条件（F5L1PS、F5L2PS、F5L3PS），一条仅在葡萄糖条件下维持（F5L1G、F5L2G、F5L3G）。所有处理以BH培养基为基础，补充0.8%葡萄糖（对照）或0.8%葡萄糖加PS纳米塑料（处理）。塑料暴露起始浓度为100 mg/L PS，并随传代逐渐增加浓度。每48 h，将30 µL稳定期培养物转移到新鲜无菌培养基中。每五次传代在对应生长条件（葡萄糖-only或PS+葡萄糖）的BH琼脂上平板培养，监测菌落形态。实验以三次72小时传代在100 mg/L PS下开始。从第4次传代起，PS浓度升至150 mg/L，并维持至第5-6次传代。第7次传代时，浓度增至最终200 mg/L，并在剩余14次传代（第8-21次）中维持该浓度，每次持续48 h。整个实验期间培养物在37°C、200 rpm振荡培养。每次传代结束时测量OD600以估算细菌生长，并将等分试样在50%甘油中于−80°C存档。全程维持严格无菌技术以防污染。选择实验进化而非基因工程，是为了在不涉及GMO相关监管限制的情况下产生稳健、可田间部署的菌株。该方法不仅利用自然适应机制在可变条件下实现稳定性能，还能发现塑料适应中关键但出乎意料的遗传和生理组分——这些见解可能无法通过理性设计获得。
【数据】PS起始浓度：100 mg/L；PS升浓度节点：T4升至150 mg/L、T7升至200 mg/L；传代间隔：48 h（前三次为72 h）；总传代数：21次；温度：37°C；转速：200 rpm；保存条件：−80°C、50%甘油
2.5 塑料适应及其适应性代价的量化
通过比较进化菌株（F5L1PS、F5L2PS、F5L3PS，均来自第21次传代）与祖先菌株的生长表现来评估塑料适应。所有菌株在含0.8%葡萄糖的BH培养基中培养，37°C、200 rpm孵育48 h至稳定期。从这些培养物中，以250倍稀释接种到新鲜BH培养基中，分别含：(i) 200 mg/L PS纳米塑料作为唯一碳源（评估塑料特异性适应），或(ii) 仅0.8%葡萄糖（测试无塑料条件下的适应性代价）。所有培养物在150 mL锥形瓶中37°C、200 rpm振荡培养48 h。在0和48 h测量光密度（OD600）。通过包含仅含纳米塑料的培养基对照来扣除背景吸光度。为验证光密度估计，还在补充0.8%葡萄糖的BH琼脂平板上进行菌落形成单位（CFU）计数。平板在37°C孵育48 h后计数。所有测定使用独立生物学重复进行三次。该方法能够量化塑料适应的收益以及葡萄糖-only条件下任何相关的适应性权衡。
【数据】PS浓度：200 mg/L；葡萄糖：0.8%；稀释倍数：250倍；培养时间：48 h；温度：37°C；转速：200 rpm；OD600测量时间点：0 h和48 h；CFU平板孵育：37°C、48 h
2.6 基因组测序与突变分析
对所有六个进化群体——即三条塑料适应菌株（F5L1PS、F5L2PS、F5L3PS）和三条葡萄糖-only对照（F5L1G、F5L2G、F5L3G）——在第7次和第21次传代时进行基因组测序。将这些序列与EC30O5B-F5祖先基因组比较，以鉴定与塑料适应相关的突变。样品制备时，从每条线收集250 µL培养物，与100 µL DNA Shield（Zymo Research，Irvine，CA，USA）混合，−20°C保存以保留核酸。DNA提取和全基因组重测序在AmpSeq（MD，USA）使用Illumina NovaSeq 6000平台完成，生成150 bp双端读段，平均覆盖度约100×。原始读段使用基于Galaxy的流程处理：FastQC（v0.11.9）评估质量，FastP修剪和过滤读段，Shovill（基于SPAdes）进行从头组装，BUSCO和QUAST获得质量指标。使用Prokka注释组装基因组。突变分析中，使用Bowtie2将修剪后的读段比对到EC30O5B-F5参考基因组，使用Freebayes调用变异，VCFfilters过滤低置信度变异，SnpEff（v4.3t）使用自定义基因组数据库进行注释。重点关注高和中等影响的变异，包括错义、无义、移码和调控突变，排除低影响的同义变化。
【数据】测序平台：Illumina NovaSeq 6000；读段长度：150 bp双端；平均覆盖度：约100×；比对工具：Bowtie2；变异调用：Freebayes；注释工具：SnpEff v4.3t；分析时间点：T7和T21
研究结果
3.1 实验进化增强对聚苯乙烯纳米塑料的适应
将 Bacillus inaquosorum 菌株 EC30O5B-F5 的三条重复祖先谱系（F5L1、F5L2、F5L3）分为塑料暴露组（F5LxPS）和对照组（F5LxG）条件（x = 1、2或3）。每个谱系经历21次连续传代（约210代），使用浊度（ΔOD600）在关键时间点跟踪生长（图1）。适应模式在各谱系间存在差异。F5L1在塑料上表现出强烈的初始生长（T1时ΔOD = 0.37），但当PS浓度升至200 mg/L（T7）时所有谱系均出现生长下降。F5L2恢复最早，在T10时即表现出改善的浊度。到最终传代（T21），在含塑料培养基中培养的三条塑料选择菌株均优于在葡萄糖中培养的葡萄糖选择对应菌株，ΔOD值分别为0.27（F5L1）、0.31（F5L2）和0.45（F5L3）（p < 0.001），确认进化适应成功。
为量化塑料特异性适应增益，在PS-only和葡萄糖-only两种培养基中比较进化菌株与祖先菌株。在PS-only培养基中，进化菌株的CFU密度平均比各自祖先高约22倍（p < 0.01或p < 0.001；图2A）。关键的是，在葡萄糖-only培养基中未观察到适应性权衡（图2B），表明对纳米塑料的适应并未损害一般适应性。这些结果证实了塑料利用能力的稳健、可重复进化，并为适应性机制的进一步分子解析提供了依据。
【数据】T1时F5L1的ΔOD：0.37；T21时ΔOD值：F5L1为0.27、F5L2为0.31、F5L3为0.45；p < 0.001；PS-only培养基中进化菌株CFU密度比祖先高约22倍（p < 0.01或p < 0.001）
3.2 塑料适应的基因组基础
#### 3.2.1 进化谱系的突变谱分析
为鉴定塑料利用增强的遗传基础，对第7次和第21次传代时的全部六个进化群体进行测序，并与祖先 Bacillus inaquosorum EC30O5B-F5 基因组比较。过滤掉葡萄糖-only菌株中发现的突变，以分离与塑料暴露唯一相关的变化，确保鉴定的变异反映塑料特异性适应而非一般实验室和葡萄糖基础进化。
分析揭示了塑料相关突变在进化谱系中不同的时间模式。在第7次传代（图3A），仅F5L2PS携带与葡萄糖-only菌株不共享的突变，具体为一个错义突变和一个移码突变。F5L1PS和F5L3PS在此阶段缺乏独特突变，表明这些谱系的适应要么尚未开始，要么尚未产生可检测的基因组变化。F5L2PS在T7时存在移码和错义突变，表明早期高影响功能变化可能启动了塑料适应。
到第21次传代（图3B），塑料选择菌株表现出更广泛和多样化的突变谱。F5L2PS携带的突变数量最多，包括三个错义突变、三个下游突变、一个上游突变和一个密码子插入。F5L1PS积累了错义、无义或终止密码子丢失以及下游突变，而F5L3PS仅有一个错义突变和一个上游突变。这些发现表明对PS纳米塑料的适应性进化涉及蛋白质编码和调控变化。从T7的早期移码突变到T21更精细突变类别的转变，反映了在持续塑料选择下从粗粒度适应到更精细调控调整的进展。
【数据】T7时F5L2PS突变：1个错义 + 1个移码；T21时F5L2PS突变：3个错义 + 3个下游 + 1个上游 + 1个密码子插入；T21时F5L3PS突变：1个错义 + 1个上游
#### 3.2.2 适应过程中蛋白质类别的进化
在T7和T21之间观察到突变基因功能组成的不同时间模式（图4）。在T7，F5L2PS在fliG（鞭毛马达开关蛋白）和clpC（Clp家族分子伴侣）中积累突变，表明早期适应靶向运动性和蛋白质质量控制机制以应对纳米塑料诱导的应激。F5L1PS和F5L3PS在T7时无塑料特异性突变，表明其早期响应涉及与葡萄糖-only条件菌株共享的适应。
到T21，突变已积累到多种蛋白质功能类别（图4）。F5L1PS表现出内切核糖核酸酶、代谢物互变酶、水解酶和RNA代谢蛋白的突变。F5L2PS显示出功能最多样的谱系，涵盖激酶、转录因子（winged helix/forkhead、helix-turn-helix、DNA结合）、转移酶和基因特异性转录调控因子。T21时多种转录因子和调控蛋白的出现表明，长期塑料适应已发展出复杂的调控网络。从T7的结构和伴侣蛋白到T21更广泛的调控和代谢功能的这种时间进展，表明从一般应激响应向特化塑料利用机制的进化。
【数据】T7时F5L2PS突变基因：fliG、clpC；T21时F5L1PS突变类别：内切核糖核酸酶、代谢物互变酶、水解酶、RNA代谢蛋白；T21时F5L2PS突变类别：激酶、转录因子、转移酶、基因特异性转录调控因子
#### 3.2.3 进化菌株中的塑料特异性基因突变
塑料选择菌株表现出与塑料降解相关的独特时间依赖性突变轨迹。在T7，仅F5L2PS积累塑料特异性突变，靶向运动性（fliG）和应激响应（clpC）基因，表明早期适应依赖结构和蛋白质稳态机制来管理纳米塑料应激。到T21，所有塑料进化菌株都获得了可能与塑料降解和利用相关的通路突变。F5L1PS在运动性（fliE）和趋化性（cheY）方面表现出变化，代谢重编程涉及氨基酸（glsA2）和中枢碳（pyk）代谢。F5L2PS中的核糖体RNA甲基化（rlmI）和F5L3PS中的膜相关转运蛋白（mntH、tycC）表明生物合成和营养获取过程的转变。调控网络经历了显著重塑，包括孢子形成激酶（kinA、spo0F）和金属响应转录因子（czrA）的突变，这些可能在塑料暴露下重新布线碳通量和应激响应。尽管各谱系的个体突变不同，但三条谱系都汇聚到共享功能靶标：金属转运、中枢代谢和运动性，凸显平行适应路径。
【数据】T7时F5L2PS塑料特异性突变靶基因：fliG、clpC；T21时F5L1PS突变基因：fliE、cheY、glsA2、pyk；F5L2PS突变基因：rlmI；F5L3PS突变基因：mntH、tycC；调控突变基因：kinA、spo0F、czrA
3.3 进化菌株的转录重编程
为将遗传变化与塑料暴露的功能响应联系起来，进行RNA-seq分析，比较塑料选择菌株池（F5L1PS、F5L2PS和F5L3PS）与祖先EC30O5B-F5菌株在PS+葡萄糖和葡萄糖-only两种条件下的转录组。由于经费限制，RNA从汇集进化培养物中提取，代表生物学重复，从而捕获适应过程中出现的共享转录响应。该策略能够表征实验进化如何重构支持纳米塑料耐受和利用的全局基因表达程序。
#### 3.3.1 已知塑酶基因的重编程
为评估进化菌株是否重编程了经典塑料降解通路，将菌株基因表达谱与精选塑酶数据库（PlasticDB和PMBD）进行比对。应用保守阈值（log₂FC ≥ 0.3，FDR ≤ 0.05），在聚苯乙烯+葡萄糖条件下鉴定出127个在进化菌株中相对于祖先上调的塑料相关基因。前15个最强诱导基因如图5所示。
进化群体上调了参与直接聚合物降解（如 aes、azoR2、bdhA）和解毒过程（如 mhqN、ydeN）的基因，表明转录向特化塑料响应功能转变。值得注意的是，参与醌解毒和氧化应激抗性的 mhqN 和 ydeN 基因在祖先中受抑制，但在进化菌株中被强烈诱导。这种重布线表明纳米塑料选择下的适应涉及解毒和应激抗性系统的转录激活。
【数据】筛选阈值：log₂FC ≥ 0.3、FDR ≤ 0.05；上调塑料相关基因数：127个；代表性上调基因：aes、azoR2、bdhA、mhqN、ydeN
#### 3.3.2 全局转录重编程
在PS+葡萄糖条件下，进化菌株与祖先相比表现出广泛的转录变化（图6A）。火山图显示大量差异表达基因，红点表示显著差异表达基因（校正p < 0.05，|log₂FC| ≥ 1）。聚类分析将24个纳米塑料响应基因分为功能模块，涵盖附着、聚合物水解、单体氧化、硫动员和输出等类别。
在葡萄糖-only条件下，进化菌株与祖先的转录差异相对较小（图7A），进一步支持塑料适应未对一般代谢造成重大转录代价。
功能富集分析（图8A）显示，基于Panther注释的蛋白质类别富集中，氨酰-tRNA合成酶、裂解酶、异构酶和代谢物互变酶显著过表达（Fisher精确检验，p < 0.05）。
基因网络分析（图9A）构建了塑料降解的功能基因网络，展示24个最显著塑料响应基因按主要功能类别分组：氨基酸代谢、硫代谢、氧化过程、聚合物分解、碳水化合物代谢和转运。该网络模型整合了基因组和转录组数据，提出塑料降解的多模块协同模型。
【数据】差异表达基因筛选阈值：校正p < 0.05、|log₂FC| ≥ 1；纳米塑料响应基因数：24个；富集分析：Fisher精确检验，p < 0.05；显著富集类别：氨酰-tRNA合成酶、裂解酶、异构酶、代谢物互变酶
讨论与解读
4.1 对聚苯乙烯纳米塑料的多层面适应
本实验进化研究表明，细菌对纯聚苯乙烯纳米塑料的适应通过表型、遗传和转录水平的协调变化进行。经过约210代逐步升级的聚苯乙烯纳米塑料选择，三条塑料选择菌株通过不同但互补的机制进化出约22倍的塑料相关生长增益。基因组分析揭示金属稳态（mntH、czrA）、中枢代谢（pyk、glsA2）和调控系统（kinA、spo0F）的趋同突变，而转录组分析发现硫代谢、转运蛋白和聚合物降解酶的上调。适应以两个主要阶段展开：早期突变（第7次传代前）集中在应激和运动基因（如fliE、clpC），赋予初始耐受；随后在第21次传代时进行代谢重编程和转录微调。这一轨迹——先存活后优化——与大肠杆菌长期进化实验中的模式相似，但增加了逐步升级的塑料应激维度而非恒定环境。基因组和转录组响应的整合表明，成功的塑料适应需要结构和表达两方面的变化。关键的是，进化菌株在葡萄糖-only培养基中未表现出适应性代价，表明塑料适应具有特异性。
编译者解读
本研究采用实验进化而非理性工程改造，这一策略选择颇具深意——它允许自然选择"发现"那些理性设计难以预见的遗传组合。从合成生物学应用角度看，研究鉴定出的24个纳米塑料响应基因及其功能模块（附着-水解-氧化-硫动员-输出）构成了一个可供异源重构的完整降解通路蓝图。约22倍的生长提升证明了进化的有效性，但需注意该数值是在纯培养和200 mg/L PS条件下获得的，实际环境中的复杂基质和混合污染物可能影响其表现。将硫代谢与塑料降解联系起来是一个值得关注的发现——硫动员可能在芳香环裂解中扮演辅助角色。未来若能将关键突变（如czrA、pyk）与转录激活机制在异源宿主中重建，或可开发出高效的塑料降解工程菌株。该研究的局限在于RNA-seq使用汇集样本，无法解析谱系特异性转录策略。
参考来源
Olabemiwo, F. A. (2026). Experimental evolution of Bacillus inaquosorum reveals multi-omics adaptation for polystyrene nanoplastic bioremediation. Total Environment Microbiology. DOI: 10.1016/j.temicr.2026.100063
DOI: 10.1016/j.temicr.2026.100063