来源：Deciphering the degradation pathway and acclimation-driven adaptive evolution characteristics of a novel sulfamethoxazole-degrading strain Bacillus cereus SDB-X（Chemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
磺胺甲噁唑（SMX）作为广泛分布的新兴污染物，对生态系统和公众健康构成风险。本研究从医院废水中分离出一株SMX降解菌——蜡状芽孢杆菌SDB-X，原始菌株（SDB-X00）在5天内可降解89%的50 mg/L SMX，经60天SMX胁迫驯化后，降解效率提升至96%。研究通过基因组学、转录组学与LC-MS/MS代谢物分析，揭示了以N-乙酰化为主的降解途径，并发现驯化过程中MenC蛋白底物结合自由能变化（从−8.3至−8.6 kcal/mol）与降解效率提升相关。该菌株在复杂废水基质中保持稳定降解活性，为抗生素污染生物修复提供了新资源。
研究背景
磺胺类抗生素（SAs）是全球产量最大、使用最广的抗菌药物之一，其广谱抗菌特性使其在医疗、畜牧业和水产养殖中广泛应用。磺胺甲噁唑（SMX）是其中最常见的品种之一，可杀灭水生病原体并有效抑制水生动物疾病。然而，人类和动物无法完全代谢SMX——约50%以活性化合物或中间代谢物形式排入环境，并可长期稳定存在。大量研究表明，SMX对生态环境产生不利影响：长期环境暴露增强病原微生物的抗生素耐药性，促进抗生素抗性基因传播，并对人类健康构成潜在威胁。因此，开发有效可靠的SMX残留去除方法迫在眉睫。
常见的SMX消除方法包括物理、化学和生物降解技术。物理化学方法主要涵盖阴离子交换、鸟粪石沉淀和电渗析工艺，虽降解速度快、操作简便，但存在能耗高、成本大、效果不稳定及可能产生二次污染等缺陷。相比之下，微生物降解因其高效、环保的特点，被视为更具前景的修复策略。
研究方法
2.1 SMX降解菌的富集与分离
SMX降解菌株的富集与分离于2024年8月进行。以医院废水为接种物，取1 mL接种物转入装有100 mL无机盐培养基（MSM）的250 mL锥形瓶中，培养基中添加初始浓度50 mg/L的SMX。该培养瓶在恒温振荡培养箱中于36°C、100 rpm条件下富集培养。每5天，将5%（v/v）的培养液转接至新鲜的含SMX的MSM培养基中。将富集后的活性菌液进行梯度稀释，并采用平板划线法纯化培养。
实验中使用的SMX（纯度99%）购自阿拉丁生化科技有限公司（上海）。液体培养基（MSM和LB）按指定配方（表S2）配制，调至pH 7.0，固体培养基添加2%（w/v）琼脂；所有培养基使用前经121°C灭菌30分钟。分离菌株的纯度通过两种方式验证：（1）菌落形态一致性；（2）使用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）扩增16S rRNA基因，PCR条件为：94°C初始变性5分钟；35个循环的94°C变性30秒、55°C退火30秒、72°C延伸30秒；最后72°C终延伸5分钟。纯化的PCR产物进行双向测序，序列使用BLASTn与NCBI RefSeq core_nt数据库比对。
【数据】接种量：1 mL；培养基体积：100 mL MSM；SMX初始浓度：50 mg/L；温度：36°C；转速：100 rpm；转接比例：5%（v/v）；转接周期：5天；SMX纯度：99%；培养基pH：7.0；琼脂添加量：2%（w/v）；灭菌条件：121°C、30 min；PCR引物：27F/1492R；PCR变性：94°C、5 min；循环数：35；退火：55°C、30 s；延伸：72°C、30 s；终延伸：72°C、5 min
2.2 扫描电子显微镜样品制备与成像分析
细菌样品在LB培养基中于36°C、5% CO₂条件下培养（100 rpm，48 h），随后离心（3000 ×g，5 min）。沉淀用含1% OsO₄的0.1 M PBS缓冲液固定（4°C，1 h），PBS洗涤，经梯度乙醇系列（30–100%）脱水。临界点干燥（Quorum K850）后，样品溅射镀膜10 nm Au/Pd（Hitachi MC1000），使用SEM（Hitachi SU8100，5–15 kV，5000–50000×）成像。
【数据】培养基：LB；温度：36°C；CO₂浓度：5%；转速：100 rpm；培养时间：48 h；离心：3000 ×g、5 min；固定液：1% OsO₄/0.1 M PBS；固定条件：4°C、1 h；脱水：乙醇梯度30–100%；镀膜：10 nm Au/Pd；SEM参数：5–15 kV、5000–50000×
2.3 SMX降解菌的连续驯化培养
对前述分离纯化的SMX降解菌株，按照既定细菌培养方案进行连续驯化培养：将100 mL灭菌MSM分装至250 mL锥形瓶中，添加SMX至终浓度50 mg/L。每个培养周期通过将前一周期1 mL菌液接种至新鲜培养基完成，随后在恒温振荡培养箱中于36°C、100 rpm条件下培养5天。该连续传代驯化的初始菌株命名为第0天菌株（SDB-X00），连续驯化第30天和第60天收获的菌株分别标记为SDB-X30和SDB-X60。选取这三个关键时间点对应的菌株作为实验样本，以探究SDB-X在连续驯化培养过程中的动态变化。
【数据】培养基体积：100 mL MSM/250 mL锥形瓶；SMX终浓度：50 mg/L；接种量：1 mL菌液；温度：36°C；转速：100 rpm；培养周期：5天；驯化时间点：0天（SDB-X00）、30天（SDB-X30）、60天（SDB-X60）
2.4 代谢物与生物量定量
为评估连续驯化培养不同阶段菌株的SMX降解能力，选取SDB-X00、SDB-X30和SDB-X60为研究对象，采用高效液相色谱（HPLC）测定其对SMX的降解效率。三种菌株各取1 mL菌悬液接种至含50 mL改良MSM培养基的锥形瓶中，随后补加SMX至终浓度50 mg/L。培养瓶在恒温振荡培养箱中于36°C、100 rpm条件下培养5天，完成一个SMX降解培养周期。实验设置三个平行重复以确保结果有效性，整个培养期间每24小时采样检测一次。
样品用乙酸乙酯萃取，甲醇复溶，经0.22 μm有机相滤膜过滤后进行HPLC分析。HPLC检测条件：SMX含量定量在Agilent 1260系列HPLC系统（Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）上进行，配备Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm）。色谱分离采用等度洗脱，流动相为75%乙腈（含0.1%甲酸，v/v）和25%超纯水（v/v）。洗脱时间30分钟，流速1.0 mL/min，柱温36°C，进样量10 μL，检测波长268 nm。各样品中SMX残留浓度由HPLC检测的SMX峰面积和建立的SMX标准曲线回归方程计算得出。
采用准一级动力学模型表征不同驯化阶段菌株的SMX降解动力学。详细的样品前处理流程和动力学计算方程见Text S1。为表征SMX降解过程中的有机碳去除情况，使用Multi N/C 2100 S TOC分析仪以不可吹扫有机碳（NPOC）法对各样品总有机碳（TOC）进行定量。所有实验数据以平均值±标准差（mean ± SD，n = 3）表示。
【数据】接种量：1 mL菌悬液；培养基体积：50 mL改良MSM；SMX终浓度：50 mg/L；温度：36°C；转速：100 rpm；培养时间：5天；平行重复：3个；采样间隔：24 h；萃取剂：乙酸乙酯；滤膜：0.22 μm有机相；色谱柱：Eclipse Plus C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；流动相：75%乙腈（含0.1%甲酸）+ 25%超纯水；洗脱时间：30 min；流速：1.0 mL/min；柱温：36°C；进样量：10 μL；检测波长：268 nm；TOC分析：NPOC法；数据表示：mean ± SD，n = 3
2.5 SMX生物降解中间产物的鉴定
SDB-X接种至LB肉汤中，于36°C、100 rpm振荡需氧培养72小时。设置三个生物学重复和三个空白对照（仅LB培养基）。对数期中期的细菌细胞通过离心收集（4000 ×g，10 min，4°C），随后使用冰浴甲醇/水（80:20，v/v）进行代谢物提取。混合物涡旋30秒，冰上超声处理10分钟，高速离心（12,000 ×g，15 min，4°C）。收集上清液进行LC-MS分析。
色谱分离在Thermo Dionex Ultimate 3000 UHPLC系统上进行，配备ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm；Waters, Milford, USA）。流动相由两相组成：（A）0.1%甲酸的水-乙腈混合物（95:5，v/v）和（B）0.1%甲酸的乙腈-异丙醇-水混合物（47.5:47.5:5，v/v/v）。梯度洗脱程序如下：0–0.5 min，线性洗脱从40% B至50% B；0.5–3.5 min，线性洗脱从50% B至55% B；3.5–6.0 min，线性洗脱从55% B至70% B；6.0–7.0 min，线性洗脱从70% B至100% B，100% B等度洗脱持续至8.0 min。色谱柱温度设定为40°C，进样量固定为3 μL。
质谱检测在Thermo Scientific UHPLC-Q Exactive HF-X Orbitrap质谱仪上进行，配备电喷雾电离（ESI）源，分别在正离子和负离子模式下运行。电离条件设置为：喷雾电压±3.5 kV，毛细管温度325°C，鞘气流速50 arb，辅助气流速13 arb。全扫描质谱在m/z 70–1050范围内以60,000分辨率（@ m/z 200）采集。原始MS数据使用Progenesis QI（版本3.0，Waters Corporation, USA）进行峰拾取、保留时间对齐和特征矩阵生成（包含m/z、RT和强度）。代谢物注释针对KEGG（京都基因与基因组百科全书）数据库进行，阈值设定为MS/MS匹配分数>80%且质量误差<5 ppm。多变量统计分析（PLS-DA）在SIMCA 14.1中实施，通路富集分析通过MetaboAnalyst（版本6.0）进行。
【数据】培养基：LB肉汤；温度：36°C；转速：100 rpm；培养时间：72 h；生物学重复：3个；空白对照：3个；离心收集：4000 ×g、10 min、4°C；提取溶剂：冰浴甲醇/水（80:20，v/v）；涡旋：30 s；超声：冰上10 min；高速离心：12,000 ×g、15 min、4°C；色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm × 2.1 mm，1.8 μm）；流动相A：0.1%甲酸水-乙腈（95:5，v/v）；流动相B：0.1%甲酸乙腈-异丙醇-水（47.5:47.5:5，v/v/v）；梯度：0–8.0 min程序洗脱；柱温：40°C；进样量：3 μL；喷雾电压：±3.5 kV；毛细管温度：325°C；鞘气流速：50 arb；辅助气流速：13 arb；扫描范围：m/z 70–1050；分辨率：60,000 @ m/z 200；MS/MS匹配阈值：>80%；质量误差阈值：<5 ppm
研究结果
3.1 SDB-X的分离与鉴定
通过选择性培养，从医院废水中分离出一株SMX降解菌，命名为菌株SDB-X。在LB琼脂平板上，其菌落呈淡黄色、圆形、凸起、光滑、边缘整齐（图1A）。菌株SDB-X为革兰氏阳性、杆状细菌，长度0.6–1.8 μm，宽度0.4–0.7 μm（图1B）。菌株SDB-X00的基因组测序和物种鉴定揭示其基因组结构复杂，包含一个环状染色体和一个质粒（图1C）。随后对连续培养菌株SDB-X30和SDB-X60进行全基因组测序，鉴定出相似的基因组组成，每株菌含有一个染色体和一个质粒（图S1A、S1B）。
基于16S rRNA基因序列的系统发育分析显示，SDB-X00与多株蜡状芽孢杆菌参考菌株（包括JCM 2152、NBRC 15305、IAM 12605和CCM 2010，图1D）形成稳定的单系群，最大序列相似性为99.87%。对三株菌的基因组进行ANI和DDH分析（图S1C），结果表明菌株间基因组相似性高：SDB-X00与模式菌株B. cereus ATCC 14579表现出高序列相似性，ANI值超过98%，DDH值超过88%——均超过推荐物种界定阈值（ANI为95.0%，DDH为70%）。因此，这些菌株被鉴定为蜡状芽孢杆菌（B. cereus）。三个培养时间点菌株的生长曲线趋势高度一致，无显著差异（图1E）。
考虑到部分蜡状芽孢杆菌菌株能够产生毒素并具有潜在致病风险，研究人员使用VFDB数据库进行毒力因子分析，以全面评估三株实验菌株的生物安全性。结果显示，所有菌株均携带参与铁载体生物合成的基因，以及多种与代谢和应激反应相关的基因。此外，在三株菌中均检测到hblA基因，该基因编码溶血素BL（Hbl）肠毒素复合物的a亚基（图1C、图S1A和图S1B）。值得注意的是，在任何菌株中均未鉴定到其他主要肠毒素基因（hblB/C/D、nheA/B/C、cytK）或呕吐毒素合成酶基因ces。
【数据】菌株来源：医院废水；菌落形态：淡黄色、圆形、凸起、光滑、边缘整齐；革兰氏染色：阳性；形态：杆状；长度：0.6–1.8 μm；宽度：0.4–0.7 μm；基因组组成：一个环状染色体+一个质粒；16S rRNA最大相似性：99.87%；ANI值：>98%；DDH值：>88%；物种界定阈值：ANI 95.0%、DDH 70%；毒力基因：hblA阳性；hblB/C/D、nheA/B/C、cytK、ces：未检出
3.2 菌株SDB-X对SMX的降解特性
经过多轮富集和初步筛选（见材料与方法），分离获得一组能在以SMX为唯一碳源的MSM中稳健生长的菌株。为全面评估其SMX去除能力，对经过不同时间连续培养的三株SDB-X菌株（SDB-X00、SDB-X30、SDB-X60）在含50 mg/L SMX的无机盐培养基中、36°C、100 rpm条件下进行为期五天的SMX降解试验。
结果表明，所有菌株均表现出SMX降解能力，但降解效率存在显著差异。其中，SDB-X60的降解率最高，五天达到96.0% ± 1.2%；其次是SDB-X30（91.1% ± 0.7%）和SDB-X00（89.7% ± 1.0%）。在最初两天，各菌株的降解率相近；但从第3天到第5天，SDB-X60的降解速率显著加快，超过其他两株菌21%–32%，且性能差距随时间进一步扩大（图2A）。
降解动力学结果同样显示，SDB-X60的SMX降解速率最快（k = 0.721 d⁻¹，t₁/₂ = 0.96 d），其次是SDB-X30（k = 0.524 d⁻¹，t₁/₂ = 1.32 d）和SDB-X00（k = 0.457 d⁻¹，t₁/₂ = 1.52 d）（图S3）。与先前报道的SMX降解菌株相比，SDB-X60表现出更优的降解性能：其对50 mg/L SMX的5天降解率（96.0% ± 1.2%）远高于A. sp. JL9（40 mg/L SMX在128 h内降解81.09%）和P. chrysosporium（10 mg/L SMX在10天内降解74%）。
为验证SDB-X60的降解稳定性，进一步在复杂水基质培养体系中进行了降解试验（图S4）。与在基础培养基中的表现一致，SDB-X60在复杂医院废水中五天内实现了97.8% ± 0.2%的高SMX降解率（最终SMX浓度为1.1 mg/L），而对照组SMX浓度保持稳定。这些结果表明，即使在复杂的真实水生环境中，SDB-X60仍保持稳定高效的SMX生物降解能力。
TOC变化趋势表明矿化率较高（图S5）。培养5天后，SDB-X60组的TOC浓度最低（6.86 ± 0.28 mg/L），去除率达98.9%。相比之下，对照组的TOC值在整个实验期间保持稳定。
采用LC-MS/MS分析鉴定菌株SDB-X降解SMX的关键代谢物。初步分析表明，N4-乙酰磺胺甲噁唑（SMX-乙酸盐，m/z = 294.05585）和磺胺甲噁唑羟胺（SMX-HA，m/z = 270.05463）是主要的初始代谢物。时间进程分析显示，SMX浓度在培养期间显著下降。SMX-乙酸盐在0–1天迅速增加，1–4天保持相对稳定，随后（4–6天）下降。相比之下，SMX-HA始终以低浓度被检测到，仅出现短暂升高后下降（图2B）。这些结果表明，SDB-X降解SMX的主要初始途径涉及N-乙酰化形成SMX-乙酸盐，而羟胺化产生SMX-HA是次要的副途径。SMX-乙酸盐在该过程中作为主要中间产物倾向于积累。
进一步的LC-MS/MS分析鉴定了其他下游代谢中间产物（表S4）：4'-磺胺基乙酰苯胺（m/z = 215.04911）、磺胺（m/z = 156.01177）、苯磺酰胺（m/z = 171.02256）和N-甲基苯胺（m/z = 108.08124）。4'-磺胺基乙酰苯胺是第一个快速积累的代谢物，作为SMX-乙酸盐的主要降解产物。磺胺和苯磺酰胺在中后期达到峰值后急剧下降，表明它们是易于转化的中间产物。N-甲基苯胺在后期逐渐积累，被推测为终端产物之一（图2C–2F）。
基于上述发现，提出了菌株SDB-X降解SMX的两条推定代谢途径（图2G）。在途径I（乙酰化-脱磺酸-去甲基化途径）中，SMX首先发生N4-乙酰化形成SMX-乙酸盐，进一步依次转化为4'-磺胺基乙酰苯胺、磺胺和苯磺酰胺；苯磺酰胺通过N-去甲基化转化为N-甲基苯胺，生成的N-甲基苯胺可能进一步转化为苯胺。这些鉴定到的中间产物及其动态变化为这一推定途径提供了部分支持性证据。在途径II（羟胺化途径）中，部分SMX转化产生瞬时SMX-HA，可能代表一条次要降解途径。
值得注意的是，从苯磺酰胺到N-甲基苯胺的推定转化在化学上仍属推测，其潜在机制需要进一步的实验验证。尽管本研究未检测到开环产物，但该工作提出了菌株SDB-X（蜡状芽孢杆菌属成员）介导的推定SMX降解途径，扩展了当前对微生物SMX分解代谢的认识。
使用ECOSAR模型表征SMX及其七种代谢物的环境毒性（表S5）：不同产物的log K_ow和水溶性差异显著，反映了其环境行为的差异；SMX表现出最高的急性毒性（48 h LC₅₀ = 1.872 mg/L）和慢性毒性（ChV = 0.0...
【数据】SMX浓度：50 mg/L；温度：36°C；转速：100 rpm；培养时间：5天；SDB-X60降解率：96.0% ± 1.2%；SDB-X30降解率：91.1% ± 0.7%；SDB-X00降解率：89.7% ± 1.0%；SDB-X60速率常数：k = 0.721 d⁻¹，t₁/₂ = 0.96 d；SDB-X30：k = 0.524 d⁻¹，t₁/₂ = 1.32 d；SDB-X00：k = 0.457 d⁻¹，t₁/₂ = 1.52 d；对比菌株：A. sp. JL9（81.09%，40 mg/L，128 h）、P. chrysosporium（74%，10 mg/L，10天）；医院废水降解率：97.8% ± 0.2%（最终SMX浓度1.1 mg/L）；TOC最低值：6.86 ± 0.28 mg/L；TOC去除率：98.9%；SMX-乙酸盐 m/z：294.05585；SMX-HA m/z：270.05463；4'-磺胺基乙酰苯胺 m/z：215.04911；磺胺 m/z：156.01177；苯磺酰胺 m/z：171.02256；N-甲基苯胺 m/z：108.08124；SMX急性毒性：48 h LC₅₀ = 1.872 mg/L
讨论与解读
讨论
本研究从医院废水中分离出一株SMX降解菌株，鉴定为蜡状芽孢杆菌SDB-X。文献中关于蜡状芽孢杆菌降解SMX的报道甚少，该菌株代表了一种新型磺胺类降解菌资源。原始菌株SDB-X00在五天内对50 mg/L SMX实现89%的降解率，经60天SMX胁迫驯化后（SDB-X60），效率提升至96%，在已报道的SMX降解菌株中处于较高水平。驯化诱导的降解能力增强与外源化合物长期暴露选择出更高效降解变体的一般原理一致。类似适应性改进在微杆菌属和红球菌属等磺胺类降解菌中亦有报道。
在医院废水复杂基质中，SDB-X60实现了与限定无机培养基中相当的SMX降解率（97.8%），表明复杂有机物的存在并未显著抑制其降解活性。需要指出的是，实验中采用的高浓度SMX（50 mg/L）旨在作为选择压力快速筛选菌株耐受性，并减少复杂废水基质引起的分析检测误差，而非模拟真实环境浓度。
编译者解读
该研究亮点在于将"驯化"这一经典微生物学策略系统应用于降解菌性能提升，并通过多组学手段（基因组、转录组、代谢组）揭示了驯化驱动的分子进化痕迹——MenC蛋白底物结合自由能的改变（−8.3至−8.6 kcal/mol）为适应性进化提供了结构层面的解释。从合成生物学应用角度看，SDB-X60在真实医院废水中的稳定表现（97.8%降解率）使其具备工程化应用潜力。但需注意，该菌株携带hblA毒力基因，尽管未检出其他主要肠毒素基因，其环境释放仍面临生物安全审查。此外，从苯磺酰胺到N-甲基苯胺的转化机制尚待实验验证，开环产物的缺失也提示矿化路径可能未完全闭合。后续研究可聚焦于关键酶的功能表征与异源表达，以进一步提升降解效率并明确代谢瓶颈。
参考来源
期刊：Chemical Engineering Journal, 2026
DOI: 10.1016/j.cej.2026.180327
DOI: 10.1016/j.cej.2026.180327