来源：Maltose gradient-induced biosensor-based high-throughput screening for directed evolution of maltogenic amylase from Bacillus stearothermophilus（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
麦芽糖淀粉酶是面包烘焙与高浓度麦芽糖浆生产中的关键工业酶，但催化活性不足制约了其应用。本研究基于枯草芽孢杆菌麦芽糖操纵子的调控机制，设计了一种麦芽糖梯度诱导（MaGI）生物传感器，实现了酶活性与荧光信号的正相关偶联。通过对3000个突变体的高通量筛选，获得两个催化活性分别提升35.56%和24.51%的优良突变体。该传感器为麦芽糖及相关淀粉水解酶的高通量筛选提供了全新工具。
研究背景
麦芽糖淀粉酶（EC 3.2.1.133）属于GH13家族，在延缓面包老化、制备超高浓度麦芽糖浆及改善面粉性能等方面应用广泛。然而，生产率不均和产量偏低的问题仍然存在，提升麦芽糖淀粉酶的表达水平和催化活性对工业应用至关重要。定向进化是改善酶性能的重要手段，但该方法依赖高效精准的筛选方法——目前麦芽糖淀粉酶领域恰恰缺乏这样的工具。传统检测方法如DNS法通过测定还原糖总量来评估酶活性，既不准确又耗时。构建一个能够将酶活性转化为可量化信号的高通量筛选系统，成为突破这一瓶颈的关键。
研究方法
2.1 菌株与试剂
大肠杆菌JM109作为质粒构建的宿主菌。实验室改造的枯草芽孢杆菌168 ΔamyE用于基因表达。酵母提取物和胰蛋白胨购自阿拉丁（中国上海）。SeeBlue™ Plus2预染标准蛋白（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA）用作蛋白分子量标记。此外，NuPAGE™ 10% Bis-Tris预制胶、NuPAGE™ LDS上样缓冲液（4×）和NuPAGE™ MES SDS电泳缓冲液均购自Invitrogen Life Technologies，X-Stain SDS-Page快速染色液购自AtaGenix（中国武汉）。其余试剂均购自国药集团（中国北京）。
【数据】菌株：E. coli JM109、B. subtilis 168 ΔamyE；试剂来源：Aladdin、Invitrogen、AtaGenix、Sinopharm
2.2 质粒构建
穿梭质粒pPHT01用于表达生物传感器（pPHT01-P_glvc-eGFP）；穿梭质粒pP43NMK用于表达AmyM（pP43NMK-P_amyE-yvcE-amyM）。构建质粒的图谱见补充图S1。引物由上海生工合成；高保真DNA扩增使用Vazyme（南京）的2× Phanta Max Master Mix（含染料）。纯化后的PCR产物用Sangon的Dpn I限制酶消化。ClonExpress II一步克隆试剂盒购自上海生工，用于片段与载体的连接。本研究所用菌株和质粒列于补充表S1，寡核苷酸引物详见补充表S2。
【数据】质粒：pPHT01、pP43NMK；工具酶：Dpn I；试剂盒：ClonExpress II One-Step Cloning Kit
2.3 培养基与培养条件
转化子在LB培养基上培养，LB培养基含5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨和10 g/L NaCl。固体LB培养基添加1.5–2.0%琼脂。用于筛选的培养基命名为TD培养基，由TB发酵培养基（24 g/L酵母提取物、12 g/L胰蛋白胨、12.54 g/L K₂HPO₄、2.31 g/L KH₂PO₄和5 g/L甘油）和终浓度为10 g/L的可溶性淀粉组成。培养基中添加抗生素的终浓度分别为：氯霉素10 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、氨苄青霉素100 μg/mL。将质粒pP43NMK-P_amyE-yvcE-amyM转化至BS168 ΔamyE。从平板挑取单菌落，接种于3 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB中过夜培养。随后以1%接种量转接至含50 mL TB的摇瓶中，于37°C、220 rpm条件下培养36 h。
【数据】培养基：LB（5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl）、TD（TB + 10 g/L可溶性淀粉）；抗生素：氯霉素10 μg/mL、卡那霉素50 μg/mL、氨苄青霉素100 μg/mL；温度：37°C；转速：220 rpm；时间：36 h；接种量：1%
2.4 突变文库的构建与筛选
突变文库使用Diversify® PCR随机突变试剂盒（Takara，中国大连）按说明书构建。突变序列随后组装至质粒pP43NMK-P_amyE-yvcE-amyM中，替换野生型amyM基因，获得突变文库。将突变文库转化至含有质粒pPHT01-P_glvc(T382C)-eGFP的BS168 ΔamyE中。用牙签从LB平板挑取单菌落，转移至含600 μL LB培养基的48深孔板中，于37°C过夜培养。随后以1%接种量将培养物接种至600 μL TD培养基中，分装至新的48深孔板，于37°C培养16–20 h。使用酶标仪（BioTek, California, USA）进行细胞荧光测定，发射波长520 nm，激发波长488 nm。检测eGFP荧光和OD600，以初始菌株作为对照。将eGFP/OD600高的菌株进行测序，通过在LB培养基（含50 μg/mL卡那霉素）中传代消除pPHT01-P_glvc(T382C)-eGFP质粒。最后通过摇瓶发酵（第2.3节）和AmyM酶活测定（第2.6节）进行验证。
【数据】突变试剂盒：Diversify® PCR Random Mutagenesis Kit；48深孔板：600 μL LB/孔；培养温度：37°C；诱导时间：16–20 h；荧光检测：激发488 nm/发射520 nm；接种量：1%
2.5 蛋白纯化
为便于AmyM纯化，在AmyM末端添加6×His标签。发酵上清液经0.45 μm混合纤维素膜过滤后，使用HisTrap™ HP柱（GE Healthcare, New York, USA）进行亲和层析纯化。随后收集用洗脱缓冲液（500 mM咪唑、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄和137 mM NaCl）洗脱的溶液，通过超滤去除咪唑。最终使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析纯化蛋白。
【数据】纯化标签：6×His；层析柱：HisTrap™ HP；洗脱缓冲液：500 mM咪唑、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄、137 mM NaCl；滤膜：0.45 μm
2.6 酶活测定
反应在最优条件（pH = 5.5，60°C）下进行。具体而言，反应体系包含500 μL溶于50 mM柠檬酸盐缓冲液（pH = 5.5）的1%（m/v）可溶性淀粉溶液和100 μL稀释的粗酶液。在60°C孵育10 min后，向反应混合物中加入600 μL DNS溶液终止反应。随后将混合物置于沸水浴中7 min。反应完成后，在冰水中冷却，并在540 nm处测定混合物的吸光度。酶活单位定义为在上述条件下，每分钟生成1 μmol麦芽糖所需的麦芽糖淀粉酶的量。
【数据】反应体系：500 μL 1%可溶性淀粉（50 mM柠檬酸盐缓冲液，pH 5.5）+ 100 μL粗酶液；温度：60°C；时间：10 min；终止剂：600 μL DNS；沸水浴：7 min；检测波长：540 nm
2.7 糖类HPLC分析
使用Sugar-Pak I色谱柱（Waters, Milford, MA）定量检测麦芽糖、葡萄糖及其他产物的浓度。流动相为含50 mg/mL乙二胺四乙酸（EDTA）钙盐的纯水，流速0.4 mL/min。所有样品经适当倍数稀释并通过0.22 μm滤膜过滤后进行HPLC分析。
【数据】色谱柱：Sugar-Pak I；流动相：含50 mg/mL EDTA钙盐的纯水；流速：0.4 mL/min；滤膜：0.22 μm
2.8 酶学性质测定
蛋白浓度使用BCA蛋白定量试剂盒（上海生工）测定。为评估动力学参数，将纯化的AmyM稀释至0.11 mg/mL，与不同浓度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、4、6、8和10 g/L）的可溶性淀粉混合。通过测定酶反应的初速度（第2.6节）并将数据拟合至Michaelis–Menten方程来估算动力学参数。在40、50、60、70、80和90°C下测定AmyM突变体的比酶活，以评估最适反应温度。将纯化的AmyM及其突变体在60°C或80°C下孵育以测定热稳定性。冰上冷却后，按第2.6节所述方法测定各样品的酶活。使用一级失活模型拟合分析各突变体的t₁/₂。t₁/₂通过公式(1)和(2)计算：(1) [E_t] = [E_0] exp(−k_d t)，其中[E_t]和[E_0]分别代表孵育后的酶活和初始酶活；k_d为降解速率常数；t为保温时间。酶的t₁/₂是[E_t]为[E_0]一半时的时间，可按公式(2)计算：t₁/₂ = ln2/k_d。使用Chirascan-pus光谱仪（Applied Photophysics，中国上海）测定Tm，系统温度从25°C逐渐升至99°C。
【数据】蛋白浓度：0.11 mg/mL；底物浓度梯度：0.1–10 g/L；温度梯度：40–90°C；热稳定性测定温度：60°C、80°C；Tm测定范围：25–99°C
2.9 结构建模与分析
AmyM与底物类似物的复合物晶体结构已解析（PDB: 1QHO），本研究所有结构建模和MD模拟均基于该结构。六糖底物（六个葡萄糖通过α-1,4糖苷键连接）的结构使用在线工具CHARMM-GUI的Glycan Reader & Modeler模块构建。AmyM与底物的复合物结构通过将1QHO中的底物类似物替换为六糖构建，其中保留了参与底物结合的共结晶水分子。AmyM与底物之间的相互作用（包括氢键、盐桥和水桥）使用在线工具PLIP分析。结构通过PyMOL 2.3.0和ChimeraX 1.7.1可视化。
【数据】晶体结构：PDB 1QHO；六糖底物：α-1,4糖苷键连接的六个葡萄糖；分析工具：PLIP、PyMOL 2.3.0、ChimeraX 1.7.1
2.10 分子动力学模拟
（原文方法部分2.10节在节选中止，具体参数原文未详述。）
【数据】原文未详述
研究结果
3.1 P_glvc启动子诱导型麦芽糖生物传感器的设计
来自嗜热脂肪芽孢杆菌的密码子优化麦芽糖淀粉酶基因amyM（PDB: 1QHO_A）被克隆至pP43NMK载体，构建质粒pP43NMK-P_amyE-yvcE-amyM。该质粒随后转化至BS168 ΔamyE进行表达。AmyM条带的分子量约为76 kDa，与预测结果一致（补充图S2A）。该酶在250 mL摇瓶中培养48 h的酶活约为234.2 U/mL（补充图S2B）。为分析AmyM催化可溶性淀粉的产物，将发酵上清液与可溶性淀粉在60°C孵育10 min，产物经HPLC分析。麦芽糖淀粉酶与可溶性淀粉反应产生麦芽糖（补充图S2C），适用于高麦芽糖浆生产。这验证了AmyM是生产高纯度麦芽糖的有效淀粉酶，对食品和制药工业应用至关重要。
枯草芽孢杆菌中的麦芽糖代谢主要由麦芽糖操纵子调控，该操纵子由三个功能基因组成：glvA、glvR和glvC（图1A）。主要调控机制涉及麦芽糖通过GlvC从培养基转运至细胞内，在胞内转化为6-磷酸麦芽糖。6-磷酸麦芽糖随后与GlvR结合并激活GlvR。活化的GlvR随后结合至麦芽糖启动子，促进P_glv启动子表达和转录。P_glv启动子受麦芽糖诱导但受葡萄糖抑制，从而调节表达强度。Ming等人发现，将启动子cre序列中的CG碱基突变为AT可缓解葡萄糖抑制。本研究将携带cre突变的启动子命名为P_glvc，并选择其进行后续研究。
为验证P_glvc启动子在麦芽糖诱导下的表达，构建了重组质粒pPHT01-P_glvc-eGFP。通过在不同麦芽糖浓度下测定单位荧光强度（eGFP/OD600），表征了P_glvc的麦芽糖响应性。将BS168ΔamyE/pPHT01-P_glvc-eGFP培养于含0至7 g/L麦芽糖的TB培养基中，P_glvc启动子控制的eGFP表达呈现麦芽糖梯度诱导（图1B）。随着麦芽糖浓度增加，eGFP/OD600呈线性上升趋势（R² = 0.9815）（图1C）。不同麦芽糖浓度对菌株生长无显著影响（补充图S3A）。综上，P_glvc启动子控制下eGFP对外源麦芽糖添加呈现线性响应，表明其作为麦芽糖检测器的潜力。
一个好的生物传感器必须具备高灵敏度、高准确度和动态范围以满足测量需求。在前期研究中，利用四环素-based细胞生长偶联筛选方法，获得了两个具有广泛麦芽糖响应性的P_glvc启动子突变体P_glvc(G363A)和P_glvc(T280C)。在LB培养基中，它们对麦芽糖浓度的响应范围从原来的0–3 g/L扩展至0–15 g/L。此外，还鉴定到一个突变体P_glvc(T382C)，其荧光强度提高了3.5倍。鉴于TB培养基适合重组蛋白表达，本研究使用TB培养基评估三个P_glvc突变体的响应水平。突变体P_glvc(G363A)和P_glvc(T280C)表现出与P_glvc相似的响应（图1D）。与此同时，P_glvc(T382C)启动子在含0–8 g/L麦芽糖的TB培养基中表现出稳健的麦芽糖梯度诱导表达，且诱导表达强度高（图1E和F），有利于后续筛选。同时监测了P_glvc(T382C)下的OD600，不同麦芽糖浓度对细胞生长无显著影响（补充图S3B）。因此，选择启动子P_glvc(T382C)进行后续研究。
【数据】AmyM分子量：~76 kDa；摇瓶酶活：234.2 U/mL（250 mL摇瓶，48 h）；线性响应R²：0.9815（0–7 g/L麦芽糖）；P_glvc(T382C)荧光增强：3.5倍；响应范围：0–8 g/L麦芽糖（TB培养基）
3.2 MaGI生物传感器在麦芽糖淀粉酶水解反应中的应用
为验证生物传感器在后续应用中的稳定性和稳健性，考察了潜在干扰物质（包括可溶性淀粉和葡萄糖）对启动子P_glvc(T382C)的影响。首先，将携带P_glvc(T382C)-eGFP生物传感器的菌株在含不同浓度淀粉和葡萄糖的TB培养基中培养12 h，检测荧光和OD600。P_glvc(T382C)对不同葡萄糖或可溶性淀粉浓度无显著响应（图2A和B）。此外，添加葡萄糖或可溶性淀粉对细胞生长无显著影响（补充图S3C和D）。
为深入研究可溶性淀粉对生物传感器的影响，在TB培养基中加入不同浓度的麦芽糖和10 g/L可溶性淀粉。P_glvc(T382C)启动子在0–8 g/L麦芽糖范围内表现出稳健的梯度诱导表达（图2C和D）。这一一致性证实了生物传感器在含有高浓度淀粉的复杂培养基中检测麦芽糖的稳健性和特异性。这证实了可溶性淀粉底物的添加不干扰生物传感器。可溶性淀粉的添加对细胞生长影响极小（补充图S3E）。因此，P_glvc可开发为麦芽糖梯度诱导生物传感器（MaGI），高效特异地检测麦芽糖和麦芽糖淀粉酶活性。
为进一步验证MaGI生物传感器的可行性，将不同浓度的纯化麦芽糖淀粉酶（AmyM）加入TD培养基中，于37°C培养。培养20 h后，测定eGFP强度和OD600。不同浓度的AmyM与可溶性淀粉反应产生不同水平的麦芽糖，P_glvc(T382C)相应作出响应（图2E）。当麦芽糖淀粉酶活性从0.05增加至1 U/mL时，eGFP强度线性增加（R² = 0.8918），最大eGFP/OD600比值为1.07 × 10⁵（图2F）。此外，对携带pP43NMK-P_amyE-yvcE-amyM和pPHT01-P_glvc(T382C)-eGFP的初始菌株BS168 ΔamyE进行评估，检测范围内eGFP/OD600比值较低，为4.44 × 10⁴（补充图S4），证实该生物传感器系统适用于AmyM筛选。添加不同浓度的麦芽糖淀粉酶对细菌生长无显著影响（补充图S3F）。
【数据】检测范围：0.05–1 U/mL AmyM；线性响应R²：0.8918；最大eGFP/OD600：1.07 × 10⁵；初始菌株eGFP/OD600：4.44 × 10⁴；培养时间：20 h；温度：37°C
3.3 MaGI生物传感器引导的AmyM定向进化
为将MaGI生物传感器应用于AmyM的定向进化，首先使用epPCR构建amyM突变文库，并转化至含有质粒pPHT01-P_glvc(T382C)-eGFP的BS168 ΔamyE中。麦芽糖淀粉酶表达并分泌至胞外，将培养基中的可溶性淀粉转化为麦芽糖（图3A）。P_glvc(T382C)的表达受不同麦芽糖浓度诱导，产生不同强度的绿色荧光（图3A）。通过筛选荧光强度，鉴定出高酶活的amyM突变体。第一轮筛选中，65/3000株菌表现出强荧光；第二轮采用相同方法（图3B）。这种高通量筛选方法显著提高了鉴定具有优良酶活突变体的效率，有助于快速优化工业酶生产。第二轮筛选中，59/65株菌的荧光水平高于对照，筛选准确率达90.77%。两株荧光最强的菌株AmyM(Q440N)和AmyM(S442N/Q661L)被鉴定出来，并在摇瓶中培养进行酶活测定。Q440N和S442N/Q661L的酶活分别提高了26.24%和24.79%（图3C）。
【数据】第一轮筛选：65/3000强荧光；第二轮筛选：59/65高于对照，准确率90.77%；Q440N酶活提升：26.24%；S442N/Q661L酶活提升：24.79%
3.4 AmyM的纯化与表征
（原文结果部分3.4节在节选中止，具体内容原文未详述。）
【数据】原文未详述
3.5 分子动力学模拟
（原文结果部分3.5节在节选中止，具体内容原文未详述。）
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究基于P_glvc(T382C)启动子开发了一种具有稳健梯度诱导表达能力和高表达强度的生物传感器。MaGI生物传感器在检测麦芽糖时表现出稳健性和特异性，荧光强度与酶活性之间存在强正相关。利用该生物传感器进行快速筛选，鉴定出两个催化活性和稳定性均提高的突变体（Q440N和S442N/Q661L），并研究了与突变体活性和稳定性增加相关的分子机制。研究发现，Aamy-C结构域中的Q440N突变使CBM20结构域显著更灵活。在改造多结构域酶时，需要考虑跨结构域的远距离动态关联。该生物传感器为工业中麦芽糖及相关酶（如麦芽糖淀粉酶和β-淀粉酶）的快速检测/筛选提供了潜在的有价值工具。
编译者解读
该研究展示了合成生物学中"传感器-筛选"偶联策略在工业酶改造中的典型应用范式。将代谢调控机制（麦芽糖操纵子）转化为可定量输出的荧光信号，巧妙绕过了传统DNS法通量低、耗时长的瓶颈。3000个突变体、90.77%的筛选准确率，数据扎实地验证了该平台的实用价值。值得注意的是，MD模拟揭示的远距离突变效应提醒我们：多结构域酶的改造不应局限于活性位点附近的热点残基，跨结构域动态关联也应纳入理性设计考量。这种"传感器驱动进化+分子模拟解析"的组合策略，对其它淀粉水解酶类的工业改良具有直接借鉴意义。局限在于，生物传感器的响应范围（0–8 g/L麦芽糖）和线性区间仍有限，对于超高产菌株的区分度可能不足。
参考来源
Wang, J. (2024). Maltose gradient-induced biosensor-based high-throughput screening for directed evolution of maltogenic amylase from Bacillus stearothermophilus. International Journal of Biological Macromolecules, 2024. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2024.136586
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2024.136586