来源：Direct evolution and expression of Tfcut-B3 in Bacillus subtilis for efficient depolymerization of commercial PBAT-based plastics films（Journal of Hazardous Materials）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
聚己二酸-对苯二甲酸丁二醇酯（PBAT）是应用最广的可生物降解塑料之一，但其自然降解速率缓慢，废弃物累积问题日益突出。本研究通过定向进化获得Tfcut-DM突变体Tfcut-B3，该酶热稳定性增强、活性显著提高，48小时内可将商用PBAT薄膜完全解聚为对苯二甲酸（TPA），对10种商用PBAT产品中8种实现完全降解。研究进一步在枯草芽孢杆菌中实现Tfcut-B3的染色体整合与胞外分泌表达，摇瓶发酵表达量达274 mg/L，发酵上清液在20 mL体系中72小时可完全降解64.9 mg PBAT薄膜。
研究背景
PBAT是由1,4-丁二醇（BDO）、己二酸（AA）和对苯二甲酸（TPA）缩聚而成的脂肪族-芳香族共聚酯。凭借优异的力学性能和低水蒸气透过率等独特阻隔特性，PBAT广泛用于食品包装、农业地膜和餐饮服务行业。然而，其固有生物降解速率缓慢，加之产量与消费量快速增长，PBAT废弃物大量积累，构成严峻环境挑战。酶法解聚是PBAT废弃物回收利用的潜在高效环保方案，但已报道的解聚酶对多样化的真实商用PBAT薄膜的解聚能力尚不明确，阻碍了其应用价值的准确评估。
研究方法
2.1 化学试剂与菌株
对硝基苯酚乙酸酯（pNPA）、对硝基苯酚棕榈酸酯（pNPP）和TPA购自阿拉丁生化科技股份有限公司（上海，中国）。博来霉素（Zeo）和壮观霉素（Spc）购自生工生物工程（上海）股份有限公司。PBAT白色地膜（厚度：0.008 mm）购自上海鸿瑞生物科技有限公司，其脂肪族（己二酸丁二醇酯）与芳香族（对苯二甲酸丁二醇酯）单元摩尔比约为53:47，对应理论TPA含量为38 wt%。PBAT颗粒（Mw = 50,000，南京德隆工程塑料有限公司）由南京工业大学周杰副教授惠赠。
PBAT琼脂平板制备方法：称取PBAT颗粒（0.25 g），溶于10 mL 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇中，于60 °C金属浴中孵育至颗粒完全溶解。将溶解液加入100 mL灭菌ddH₂O中，置60 °C水浴振荡至六氟-2-丙醇蒸发、溶液呈乳白色，得PBAT储备液。取PBAT储备液（1 mL）加入100 mL LB固体培养基中混匀，制备PBAT琼脂平板。本研究所用菌株与质粒列于补充材料表S1。所有菌株在LB或2 × Super-Rich（SR）培养基中培养。芽孢杆菌于37 °C、200 rpm条件下培养。
【数据】PBAT地膜厚度：0.008 mm；脂肪族:芳香族摩尔比：53:47；理论TPA含量：38 wt%；PBAT颗粒Mw：50,000；PBAT用量：0.25 g；六氟-2-丙醇体积：10 mL；溶解温度：60 °C；ddH₂O体积：100 mL；PBAT储备液用量：1 mL；LB培养基体积：100 mL；培养温度：37 °C；转速：200 rpm
2.2 质粒型SCK6-Tfcut-DM易错突变文库构建
Tfcut-DM序列（PDB: 7XTR）由擎科生物科技有限公司（南京，中国）合成。使用StarMut随机突变试剂盒及引物E-F/E-R（表S2）扩增Tfcut-DM编码区并引入随机突变。随后通过重叠延伸PCR将线性质粒pHCM12M与Tfcut-DM易错PCR产物（片段两侧各含30 bp重叠区）连接，构建质粒多聚体。将多聚体产物转化至超级感受态枯草芽孢杆菌SCK6细胞，于37 °C、200 rpm复苏1.5 h。复苏后，转化细胞经稀释涂布于含100 mg·L⁻¹ Spc的PBAT琼脂平板，37 °C培养12 h后转至60 °C培养箱继续培养。同时构建质粒型重组菌株SCK6-Tfcut-DM（野生型）作为对照。
产生较大水解圈的突变菌株与重组菌株SCK6-Tfcut-DM用无菌牙签接种至含100 mg·L⁻¹ Spc的PBAT琼脂平板，60 °C培养5–6 h进一步比较水解圈大小。突变菌株SCK6-Tfcut-B3因表现出显著更大的水解圈（直径= 5.2 mm；与菌落直径比= 4.3），远大于重组菌株SCK6-Tfcut-DM（水解圈直径= 2.9 mm；比值= 2.9），被选为候选菌株进行PCR扩增和测序（引物Pap-YZ-F/Pap-YZ-R）。SCK6-Tfcut-B3和SCK6-Tfcut-DM的菌落直径分别为1.2 mm和1.0 mm。SCK6-Tfcut-DM(Q132Y)亦按上述方法构建。
【数据】Spc浓度：100 mg·L⁻¹；37 °C培养时间：12 h；60 °C培养时间：5–6 h；SCK6-Tfcut-B3水解圈直径：5.2 mm；水解圈/菌落比：4.3；SCK6-Tfcut-DM水解圈直径：2.9 mm；比值：2.9；菌落直径：1.2 mm（B3）/1.0 mm（DM）；复苏条件：37 °C、200 rpm、1.5 h；重叠区长度：30 bp
2.3 蛋白表达与纯化
质粒型重组菌株SCK6-Tfcut-DM接种于4 mL含20 mg·L⁻¹ Zeo的LB液体培养基，37 °C、180 rpm培养12 h。随后按1%（v/v）接种量转接至含20 mg·L⁻¹ Zeo的2 × SR培养基，37 °C、180 rpm振荡发酵48 h。发酵后培养液于4 °C、12,000 rpm离心20 min，收集上清液用于镍-次氮基三乙酸树脂纯化。目的蛋白用含300 mM咪唑的50 mM Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液洗脱。纯化的Tfcut-DM以50 mM Tris-HCl（pH 8.0）为透析缓冲液，4 °C透析24 h去除咪唑，蛋白通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测。Tfcut-B3和Tfcut-DM(Q132Y)的蛋白表达与纯化方法同上。
【数据】Zeo浓度：20 mg·L⁻¹；接种量：1%（v/v）；发酵条件：37 °C、180 rpm、48 h；离心条件：4 °C、12,000 rpm、20 min；咪唑浓度：300 mM；Tris-HCl浓度：50 mM（pH 8.0）；透析条件：4 °C、24 h；LB培养：37 °C、180 rpm、12 h
2.4 活性测定
Tfcut-DM标准酶反应体系：4.0 mL缓冲液（pH 9.0，50.0 mM甘氨酸-NaOH）、40.0 μg Tfcut-DM、6 mg PBAT白色地膜（厚度：0.008 mm）。反应于60 °C、180 rpm振荡孵育48 h。设置不含Tfcut-DM的对照组，进行三次生物学重复。取500 μL样品，煮沸10 min，12,000 × g离心10 min。上清液经0.22 μm亲水膜过滤，用高效液相色谱（HPLC）测定TPA及其衍生物浓度。Tfcut-B3和Tfcut-DM(Q132Y)的活性测定方法同上。完全解聚的定量定义为：基于薄膜理论TPA质量分数38%，PBAT白色地膜转化为TPA的转化率> 95%。
【数据】反应体系：4.0 mL缓冲液（pH 9.0，50.0 mM甘氨酸-NaOH）；酶量：40.0 μg；底物：6 mg PBAT薄膜（0.008 mm）；反应条件：60 °C、180 rpm、48 h；取样量：500 μL；煮沸时间：10 min；离心：12,000 × g、10 min；滤膜孔径：0.22 μm；完全解聚定义：TPA转化率> 95%
2.5 pH与热稳定性测定
为确定Tfcut-DM和Tfcut-B3的最适反应温度，采用紫外分光光度法在405 nm检测底物pNPA水解释放的对硝基苯酚（pNP）。反应混合液含10 µL 10 mM pNPA、10 µL Tfcut-DM或Tfcut-B3、980 µL 50 mM Tris-HCl（pH 8.0），在不同温度（20、30、40、50、60、70、80、90 °C）下孵育3 min，确定最适反应温度。最适温度下的酶活性设为100%，计算其他温度下的相对活性。Tfcut-DM和Tfcut-B3的热稳定性通过将酶制剂在40、50、60、70、80 °C下孵育12 h评估，随后用上述酶测定条件测量残余活性。未加热酶作为对照（100%），计算加热酶的残余活性。每组设三次重复。
为减少碱性pH下自发水解的干扰，采用pNPP作为底物测定Tfcut-DM和Tfcut-B3的最适pH和pH稳定性。为确定最适pH，在50和60 °C下使用不同pH缓冲液，包括50 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 4.0–6.0）、50 mM Tris-HCl（pH 6.0–8.0）和50 mM甘氨酸-NaOH缓冲液（pH 8.0–10.0）。孵育3 min后测定酶活性以确定最适pH。为评估不同pH下的稳定性，将酶在4 °C不同缓冲液中孵育24 h，用上述酶测定条件测量残余活性。每组设三次重复。
【数据】pNPA浓度：10 mM；pNPA体积：10 µL；酶体积：10 µL；Tris-HCl：50 mM（pH 8.0），980 µL；孵育时间：3 min；温度梯度：20–90 °C；热稳定性孵育：40–80 °C、12 h；pH范围：4.0–10.0；pH稳定性孵育：4 °C、24 h；检测波长：405 nm
2.6 分子对接与分子动力学模拟
参照Tfcut-DM（Protein Data Bank: 7XTR）与PBAT模型底物BABTaB（B、A、Ta分别代表1,4-丁二醇、己二酸和对苯二甲酸单元）的对接方法，使用AutoDock Vina（版本1.2.0）进行Tfcut-B3与BABTaB的分子对接。酶-底物相互作用用PyMOL软件分析。分子动力学（MD）模拟使用GROMACS 2020.6，采用CHARMM36m全原子力场。蛋白溶于填充TIP3P水的十二面体模拟盒中，蛋白表面到所有盒子边界保持最小1.0 nm间距。通过添加Na⁺和Cl⁻离子实现体系电中性和生理离子强度。能量最小化采用最速下降算法，收敛标准为最大力达到设定阈值。
【数据】对接软件：AutoDock Vina 1.2.0；MD软件：GROMACS 2020.6；力场：CHARMM36m；水模型：TIP3P；最小边界间距：1.0 nm；离子：Na⁺/Cl⁻；能量最小化：最速下降算法
研究结果
3.1 突变体Tfcut-B3的定向进化与功能表征
为通过定向进化提高Tfcut-DM对PBAT的催化活性，开发了一种快速鉴定Tfcut-DM突变体的高通量筛选方法（图S1A）。该方法利用PBAT作为不溶性大分子聚合物无法进入微生物细胞，而枯草芽孢杆菌可通过信号肽将解聚酶分泌至胞外的特性。产生能降解PBAT的活性突变酶的菌落会形成清晰水解圈，从而实现改进变体的快速可视化鉴定。经过三轮文库构建与筛选，从约10,000个转化子的文库中鉴定出Tfcut-B3（Tfcut-DMS224F）。该突变体表现出显著更大的清晰水解圈（水解圈/菌落比：4.3），而Tfcut-DM为2.9（图S1B和1C）。随后以Tfcut-B3为模板进行了四轮突变，未发现催化活性或热稳定性更优的变体，因此Tfcut-B3被选为后续所有PBAT解聚研究的首选候选酶。
为进一步验证Tfcut-B3、Tfcut-DM和Tfcut-DM(Q132Y)的PBAT降解能力，将各酶分别与6 mg PBAT白色薄膜（厚度：0.008 mm）孵育48 h。目视观察，Tfcut-B3完全解聚了薄膜，溶液澄清；而Tfcut-DM和Tfcut-DM(Q132Y)体系中仍有PBAT颗粒残留（图1A）。HPLC分析显示，TPA是Tfcut-B3的唯一最终产物，而Tfcut-DM和Tfcut-DM(Q132Y)体系中仍有少量未完全降解的中间产物丁二醇苯甲酸酯（BTa）残留（图1B）。
Tfcut-B3产生的TPA量（2.2 mg）是Tfcut-DM（1.1 mg）的2倍，是Tfcut-DM(Q132Y)（1.7 mg）的1.3倍（图1C）。这些产量对应Tfcut-B3约96%的TPA转化率，接近理论最大产量（2.28 mg），而Tfcut-DM和Tfcut-DM(Q132Y)的转化率分别仅为约48%和75%。进一步分析了解聚过程的质量平衡。鉴于TPA占PBAT薄膜的38 wt%，6 mg底物的理论最大产量为2.28 mg。对于Tfcut-B3，高转化率（96%）和HPLC中无BTa峰（图1B）表明芳香族链段几乎完全转化为TPA单体。剩余质量（约为初始6 mg的62%）可合理归因于脂肪族单体（己二酸丁二醇酯单元释放的AA和BDO）的同步释放，这些单体水溶性好，未被针对芳香族化合物优化的HPLC方法定量。Tfcut-DM和Tfcut-DM(Q132Y)较低的TPA产量（分别为48%和75%）表明芳香族链段水解不完全；未计及的芳香族质量以未消化固体颗粒（目视观察）和BTa（HPLC检测）形式存在（图1A和1B）。Tfcut-B3的比活性（19.8 U/mg）显著增强，是Tfcut-DM（6.38 U/mg）的3.1倍，是Tfcut-DM(Q132Y)（14.14 U/mg）的1.4倍（图1D）。
分子对接模拟了Tfcut-DM和Tfcut-B3与底物PBAT（BABTaB）的相互作用，以深入理解Tfcut-B3催化活性增强的机制。BABTaB结合在Tfcut-DM和Tfcut-B3的疏水口袋内，与His169、Lys199和Trp195形成氢键（图S2A）。尽管Phe224和Trp195不直接位于底物结合口袋内，但基于同源LCC-A2中Tyr218/Trp190 π-π相互作用的研究，结合分子对接结果，Phe224突变引入的苯环与Trp195形成π-π相互作用（图S2B）；这种作用通过芳香环接触限制侧链运动，将Trp195稳定在B型构象。在Tfcut-DM中，B型Trp195被认为提供更开放、更平坦的入口，有利于PBAT等大体积底物的进入。此外，MD模拟为该稳定性提供了额外结构证据。Tfcut-B3的均方根偏差（RMSD）低于Tfcut-DM，表明整体结构稳定性增强（图S2C），且219–227环（位于口袋入口处，包含突变位点）的均方根波动（RMSF）显著降低（图S2D）。这种灵活性降低归因于Phe224突变，该突变稳定了入口区域的结构。这种稳定化被认为限制了相邻残基Trp195的构象，使其处于更有利的取向，可能在底物结合过程中促进与底物（BABTaB）芳香环的π-π相互作用。该结构稳定化为实验观察到的催化活性增强提供了合理解释。
【数据】突变体：Tfcut-B3（Tfcut-DMS224F）；文库规模：约10,000转化子；水解圈/菌落比：4.3（B3）/2.9（DM）；底物：6 mg PBAT薄膜（0.008 mm）；孵育时间：48 h；TPA产量：2.2 mg（B3）/1.1 mg（DM）/1.7 mg（Q132Y）；TPA转化率：96%（B3）/48%（DM）/75%（Q132Y）；理论最大TPA产量：2.28 mg；比活性：19.8 U/mg（B3）/6.38 U/mg（DM）/14.14 U/mg（Q132Y）；活性倍数：3.1×（vs DM）/1.4×（vs Q132Y）
3.2 Tfcut-DM与Tfcut-B3的酶学性质
由于温度显著影响PBAT酶法解聚，评估了Tfcut-DM和Tfcut-B3在不同温度下的酶活性和热稳定性。两种酶在20至90 °C之间均表现活性，Tfcut-DM和Tfcut-B3的最适温度分别为50和60 °C；高于70 °C时，两种酶活性均显著下降（图S3AB）。Tfcut-DM和Tfcut-B3在40和50 °C下均表现出良好的热稳定性，72 h后仍保留约60%活性。然而，当温度升至70 °C以上时，两种酶的稳定性均显著下降，70 °C孵育12 h后几乎完全失活。60 °C下观察到稳定性的显著差异。Tfcut-DM的活性随孵育时间逐渐下降，72 h后残余活性< 10%；相比之下，Tfcut-B3在72 h后仍保持约60%活性，表明其在中高温下热稳定性增强（图S3CD）。这些酶在高温下稳定性相对较差是一个显著局限，尤其考虑到PBAT中的酯键对高温高度敏感。作为半结晶聚合物，温度升高增强其分子流动性，若具备热稳定酶则应促进解聚。工程化角质酶变体LCC-M1即是例证，与Tfcut-DM和Tfcut-B3不同，其在81 °C时表现峰值活性，6 h后仍保留超过95%初始活性。
Tfcut-DM和Tfcut-B3在pH 6.0–8.0（50 mM Tris-HCl缓冲液）范围内均表现出高催化活性，两种酶的最适pH均为8.0。当pH低于6.0或高于8.0时，两种酶均受到显著抑制（图S4AB）。在4 °C孵育24 h后，两种酶在pH 6.0至8.0（50 mM Tris-HCl缓冲液）范围内酶活性均保持> 90%。相比之下，在pH低于6.0或高于8.0时，两种酶均出现不同程度的活性损失（图S4CD）。
【数据】Tfcut-DM最适温度：50 °C；Tfcut-B3最适温度：60 °C；温度范围：20–90 °C；40/50 °C下72 h残余活性：约60%；70 °C孵育12 h：几乎完全失活；60 °C下72 h残余活性：< 10%（DM）/约60%（B3）；最适pH：8.0（两种酶）；pH 6.0–8.0范围24 h残余活性：> 90%；pH稳定性孵育：4 °C、24 h
3.3 Tfcut-DM与Tfcut-B3对商用PBAT薄膜降解能力比较
选用10种不同组成的PBAT基塑料薄膜（表S3）评估Tfcut-DM和突变体Tfcut-B3对不同PBAT基塑料产品的降解能力。Tfcut-B3在12 h内完全降解了10种产品中的9种，仅PB-6（盒马鲜生塑料袋）需要48 h（图2A和2B）。相比之下，Tfcut-DM在12 h内仅能完全降解两种产品（PB-4和PM-3）；五种产品（PB-1、PB-2、PB-5、PM-1、PM-2）需要48 h才能完全降解，三种产品（PB-3、PB-6和PM-4）在72 h后仍保持完整，未观察到明显解聚。随后采用HPLC检测PBAT解聚产生的TPA（图S5）。
【数据】测试产品数：10种；Tfcut-B3在12 h内完全降解：9/10；PB-6完全降解时间：48 h；Tfcut-DM在12 h内完全降解：2/10（PB-4、PM-3）；Tfcut-DM需48 h降解：5/10（PB-1、PB-2、PB-5、PM-1、PM-2）；Tfcut-DM在72 h未降解：3/10（PB-3、PB-6、PM-4）
3.4 Tfcut-B3在枯草芽孢杆菌中的分泌表达与功能验证
为实现Tfcut-B3在枯草芽孢杆菌中的高效胞外分泌表达，将Tfcut-B3表达盒整合至枯草芽孢杆菌PD8染色体中（图3A）。SDS-PAGE分析显示，菌株PD8-B3的发酵上清液在预期分子量处出现明显蛋白条带，而对照菌株PD8未观察到该条带（图3B），表明Tfcut-B3成功实现分泌表达。
为优化Tfcut-B3的表达水平，测试了不同启动子（图4A）。SDS-PAGE分析显示，不同启动子介导的Tfcut-B3表达水平存在差异（图4B）。通过启动子和宿主优化，在枯草芽孢杆菌PD2中利用启动子P69–212实现了274 mg/L的Tfcut-B3表达量。
【数据】表达宿主：枯草芽孢杆菌PD8/PD2；表达量：274 mg/L；启动子：P69–212；整合方式：染色体整合
3.5 Tfcut-B3发酵上清液的最大解聚能力
为评估Tfcut-B3发酵上清液的最大解聚能力，将Tfcut-B3发酵上清液（5.9 mg）与PBAT白色薄膜（0.008 mm）在20 mL反应体系（pH 8.0，含0.3 M NaCl）中于60 °C、180 rpm条件下孵育。实验结果显示，Tfcut-B3发酵上清液在72 h内完全降解了高达64.9 mg的PBAT白色薄膜。
【数据】发酵上清液酶量：5.9 mg；反应体系：20 mL（pH 8.0，含0.3 M NaCl）；温度：60 °C；转速：180 rpm；时间：72 h；PBAT薄膜降解量：64.9 mg
讨论与解读
本研究鉴定出突变酶Tfcut-B3，其热稳定性和PBAT降解活性均得到增强。Tfcut-B3的性能优于此前变体（Tfcut-DM和Tfcut-DM(Q132Y)），48 h内完全解聚了8/10商用PBAT产品。相比之下，PB-6和PM-4较差的解聚性能归因于其厚度和额外添加剂（如PLA和淀粉）的存在。Tfcut-B3通过染色体整合在枯草芽孢杆菌中实现过表达。通过启动子和宿主优化，利用启动子P69–212在枯草芽孢杆菌PD2中实现274 mg/L的Tfcut-B3表达量。该菌株的发酵上清液可直接使用，在20 mL体系内72 h完全降解高达64.9 mg的PBAT白色薄膜。对Tfcut-B3在多种商用PBAT产品上的系统评估证明了其高效率、可规模化生产和优越的实际应用潜力；然而，当前表达水平仍是大规模工业应用的主要限制。未来工作应聚焦于通过高细胞密度发酵和分泌机制优化提高产量。此外，从降解液中高效回收和纯化高价值单体产品（如TPA和AA）对实现塑料循环经济闭环至关重要。
编译者解读：本研究展示了定向进化与分泌表达策略在塑料降解酶工程中的协同价值——Tfcut-B3通过单点突变（S224F）同时获得热稳定性与活性提升，而枯草芽孢杆菌分泌系统则绕开了繁琐的蛋白纯化步骤，使发酵上清液可直接用于解聚反应。这种"从酶工程到过程工程"的完整链条为PBAT生物回收提供了可放大的技术原型。值得注意的是，酶对真实商用产品的降解效果差异提示，塑料配方中的添加剂与膜厚度是实际应用不可忽视的变量。未来若能在高密度发酵与产物回收环节取得突破，该技术有望真正嵌入塑料循环经济体系。
参考来源
Zhang M. Direct evolution and expression of Tfcut-B3 in Bacillus subtilis for efficient depolymerization of commercial PBAT-based plastics films. Journal of Hazardous Materials, 2026. DOI: 10.1016/j.jhazmat.2026.141698
DOI: 10.1016/j.jhazmat.2026.141698