来源：Computer-aided evolution and experimental validation of a novel L-asparaginase from Bacillus sp. SD3 toward enhanced thermal stability（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
L-天冬酰胺酶是治疗急性淋巴细胞白血病和食品加工中降低丙烯酰胺的关键生物催化剂，但其热稳定性不足严重限制了工业应用。本研究从伊朗达赫提盐丘分离到一株新型 Bacillus sp. SD3，其天冬酰胺酶具有两个独特氨基酸替换（W89、A102），热力学稳定性较最近同源酶提高 2.11 kcal mol⁻¹。研究团队采用计算机辅助定向进化策略，通过丙氨酸扫描、靶向诱变和 200 ns 分子动力学模拟，锁定 G129F 和 D291W 两个关键稳定化突变。双突变体最适温度提升 10°C（至 55°C），60°C 孵育 180 min 后仍保留 61% 活性（野生型仅 15%），为工业应用提供了有前景的热稳定酶制剂。
研究背景
L-天冬酰胺酶（EC 3.5.1.1）催化 L-天冬酰胺水解为天冬氨酸和氨，在治疗与工业领域均有重要应用。治疗上，该酶通过消耗白血病细胞生存所必需的天冬酰胺，成为急性淋巴细胞白血病（ALL）的基石疗法。工业上，它通过降低游离 L-天冬酰胺浓度，阻止其与糖类经美拉德反应生成潜在致癌物丙烯酰胺，从而减少高温食品加工中的丙烯酰胺形成。全球 L-天冬酰胺酶市场价值超数十亿美元，但热稳定性不足严重制约其广泛应用——工业过程需要高温，医学应用则受益于酶在体内的长效保留。热稳定 L-天冬酰胺酶需求迫切：医学上，增强的稳定性可延长酶半衰期，减少给药频率和免疫原性；食品加工中，热稳定变体可在 50°C 以上高效发挥作用，而中温酶在此温度下已失活。市售 L-天冬酰胺酶多为中温型，主要来源于大肠杆菌和 Dickeya 属。
研究方法
2.1 实验材料
所有计算均在锡斯坦-俾路支斯坦大学云服务提供的高性能计算平台上完成。适用于分子生物学应用的化学品、试剂和细菌培养基购自多家国内外商业供应商。研究用酶购自 Vivantis、NEB、Bioneer 和 Takara 等国际知名供应商。诱变实验使用 Agilent Technologies 的 QuikChange II 定点诱变试剂盒（目录号 200524）。NEBExpress Ni-spin 柱购自 New England BioLabs（目录号 S1427S）。
【数据】试剂盒：QuikChange II（Agilent，Cat#200524）；Ni-spin 柱：NEBExpress（NEB，Cat#S1427S）
2.2 菌株分离
产 L-天冬酰胺酶菌株分离自伊朗西南部布什尔市附近达赫提盐丘的水样，取样过程保持无菌操作。水样先经稀释，接种于 10 mL Luria-Bertani 培养基中，在普通轨道摇床 37°C 培养，直至 OD600nm 达到约 0.6。培养基使用无菌盐丘水配制，以模拟更真实的生长环境。随后，培养物涂布于营养琼脂平板，37°C 孵育 24 h 获得单菌落。挑取单个菌落，在添加酚红作为 pH 指示剂的 M9 固体培养基上进行传代培养，筛选形成粉色区域的菌落。L-天冬酰胺酶阳性菌落进一步通过革兰氏染色和 KOH 试验等形态学方法分析。候选菌株基因组 DNA 使用 NucleoSpin Microbial DNA Mini Kit（Macherey-Nagel，德国）按说明书提取。最后，扩增并利用 Sanger 测序技术测定分离菌株的 16S rRNA 基因，正向引物序列为 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，反向引物序列为 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。所得序列已提交至 GenBank 数据库（登录号 PV602042）。
【数据】培养条件：LB 培养基，37°C 摇床，OD600nm≈0.6；平板培养：营养琼脂，37°C，24h；筛选：M9+酚红；测序：16S rRNA Sanger；GenBank：PV602042
2.3 L-天冬酰胺酶基因克隆、表达与纯化
酶鉴定和克隆的所有步骤均按照研究团队前期发表的方法进行。简言之，设计一对寡核苷酸引物用于扩增枯草芽孢杆菌属物种中 L-天冬酰胺酶基因对应的开放阅读框。正向引物序列为 5′-ATGAAAAACAACGAATGCTC-3′，反向引物序列为 5′-CCG CTCGAG CGGTTCGCCTTCTTTTCTTCAATA-3′。通过 Sanger 测序验证酶核苷酸序列的准确性。随后进行第二轮 PCR，使用新的正向引物 5′-CGC GGATCC GCGAAAAAAGGTCTGCCAAACATTAG-3′，与前述反向引物配对使用。该 PCR 精确扩增氨基酸残基 42–370 区域，即酶的活性功能部分。Fw2 和 Rev 引物中加粗加下划线碱基分别为 BamHI 和 XhoI 限制性内切酶的酶切位点，用于将扩增序列（1167 bp）直接克隆至 pET28a 表达载体。新构建体先转化至超级感受态 E. coli TOP10，随后转入 E. coli BL21 DE3 pLysS 菌株进行高水平的重组蛋白生产。L-天冬酰胺酶完整 CDS 已提交 GenBank，登录号 PV602042。该酶在整个研究中被视为天然 L-天冬酰胺酶。
L-天冬酰胺酶表达时，将 150 μL 重组 E. coli BL21 DE3 过夜培养物接种至含 50 μg/mL 卡那霉素的 150 mL LB 肉汤中。当培养基 OD600nm 达到 0.5 时，加入 0.1 mM IPTG 诱导重组酶表达。表达 4 h 后通过离心收集细胞终止表达。随后，将细胞沉淀重悬于不含 EDTA 的低渗裂解缓冲液（10 mM Tris-HCl，0.5 mM PMSF，pH 7.5）中，利用超声剪切力破碎细胞。离心去除细胞碎片后，使用 Ni-NTA 离心柱按说明书纯化 His 标签重组酶。表达和纯化水平通过 10% SDS-PAGE 电泳分析。
【数据】引物：Fw1 5′-ATGAAAAACAACGAATGCTC-3′；Rev 5′-CCGCTCGAGCGGTTCGCCTTCTTTTCTTCAATA-3′；Fw2 5′-CGCGGATCCGCGAAAAAAGGTCTGCCAAACATTAG-3′；扩增片段：1167 bp，编码 aa42–370；载体：pET28a；宿主菌：E. coli TOP10 → BL21 DE3 pLysS；表达：150 mL LB + 50 μg/mL 卡那霉素，0.1 mM IPTG，OD600nm=0.5 诱导，4h；裂解缓冲液：10 mM Tris-HCl + 0.5 mM PMSF，pH 7.5；纯化：Ni-NTA 柱；检测：10% SDS-PAGE
2.4 天然 L-天冬酰胺酶表征
L-天冬酰胺酶活性采用 Nessler 试剂法测定，检测 L-天冬酰胺水解产生的氨。一个酶活力单位（U）定义为在标准条件下（天然酶：pH 8.0、45°C；突变酶：55°C）每分钟释放 1 μmol 氨所需的酶量。在 20–80°C 温度和 pH 4–10 范围内评估酶活性以确定最适条件。热稳定性通过在 40–80°C 孵育酶样品至多 240 min 后、在标准条件下测量残留活性来评价。pH 稳定性通过将酶在 pH 4–10 的缓冲液中孵育后测定活性来测试。在最适温度和 pH 下计算半衰期。金属离子效应（MgCl₂、CaCl₂、ZnCl₂、FeCl₃，浓度 1–5 mM）通过将酶与这些盐预孵育后进行活性测定来考察。动力学参数（Km 和 Vmax）以 L-天冬酰胺（0.1–10 mM）为底物测定，使用 Nessler 试剂在 500 nm 处分光光度法定量氨释放量。详细步骤见补充材料 S3 节。
【数据】活性测定：Nessler 试剂法，500nm；酶活单位：1 U = 1 μmol 氨/min（标准条件 pH 8.0，45°C/55°C）；温度范围：20–80°C；pH 范围：4–10；热稳定性：40–80°C，≤240 min；金属离子：1–5 mM；底物浓度：0.1–10 mM
2.5 AlphaFold2 辅助同源建模
半理性蛋白设计方法高度依赖目标蛋白结构的质量——当没有实验解析结构可用、研究必须依赖同源建模技术构建的计算模型时，这一点尤为关键。传统同源建模方法在蛋白质折叠预测方面存在固有局限性。因此，研究团队利用 AlphaFold2 预测 Bacillus sp. SD3 L-天冬酰胺酶的结构。选择该工具是因为其已证明的高精度——在 CASP14 竞赛中中位 GDT_TS 分数达 92.4%。由于 AlphaFold 服务器目前仅能预测 UniProt 数据库中已有的蛋白质序列，此处主要用于构建高精度模板。通过 BLAST 搜索，确定了与本研究序列最相似的 L-天冬酰胺酶条目，对应 B. subtilis 168 L-天冬酰胺酶 2（UniProt 登录号 O34482），两者仅有两个变异位点。通过 Discovery Studio 2022 中的计算机模拟定点诱变引入两个替换，将模板结构转化为本研究的 L-天冬酰胺酶模型。模型进一步使用 FoldX5 进行精修以纠正剩余的结构问题，模板和 L-天冬酰胺酶模型的质量通过 Ramachandran 图检查、SAVES 服务器评估和 FoldX5 稳定性研究进行评价。
【数据】建模工具：AlphaFold2（CASP14 中位 GDT_TS 92.4%）；模板：B. subtilis 168 L-天冬酰胺酶 2（UniProt O34482）；差异：2 个氨基酸；精修：FoldX5；质控：Ramachandran 图、SAVES、FoldX5
2.6 天然 L-天冬酰胺酶的计算机辅助定向进化
首先检查酶序列的关键催化残基，确保不会引入损害最终酶功能的有害修饰。随后采用丙氨酸扫描方法评估每个残基对酶稳定性的贡献。为此，使用四款不同的软件包生成酶所有残基的单点突变为丙氨酸的突变体：BIOVIA Discovery Studio 2022（Dassault Systèmes，美国）、MolSoft ICM-Pro、FoldX5 和 MOE 2022（Chemical Computing Group，加拿大）。每个工具基于不同的算法和力场提供预测。例如，Discovery Studio 在……（原文此处截断，后续计算细节原文未完整呈现）。
【数据】软件：Discovery Studio 2022、MolSoft ICM-Pro、FoldX5、MOE 2022；方法：丙氨酸扫描、单点突变；温度：原文未详述
研究结果
3.1 Bacillus sp. SD3 的分离与鉴定
形态学研究（包括革兰氏染色和 KOH 试验）确认分离菌株为杆状革兰氏阳性菌，最可能属于芽孢杆菌属。利用 16S rRNA 基因 Sanger 测序对分离株进行分子分型，结果与形态学发现完全一致。BLASTn 分析表明该分离株为 Bacillus sp. 的一个新菌株。最终，测序扩增子以 Bacillus sp. SD3 16S rRNA 基因的名义存入 GenBank 数据库，登录号为 PV392854。
【数据】形态：杆状革兰氏阳性；鉴定：16S rRNA Sanger 测序 + BLASTn；GenBank：PV392854
3.2 天然 L-天冬酰胺酶序列分析与表达
Bacillus sp. SD3 基因组扩增片段包含一个 1113 bp 的开放阅读框（ORF），潜在编码由 370 个氨基酸组成的 II 型 L-天冬酰胺酶，分子量约 40 kDa。如前所述，L-天冬酰胺酶的 N 端区域包含一个信号肽连接至无序区段（残基 1–43），该区段在成熟 L-天冬酰胺酶（mAsp）中不存在，可能干扰蛋白质的催化结构域。InterProScan 分析也证实了这一点，结果显示成熟天冬酰胺酶跨越残基 44–370。因此，通过使用新正向引物的第二轮 PCR 去除了前 43 个残基。最终，克隆的成熟酶包含 327 个残基，分子量约 34.71 kDa，pI 为 4.97，这些数值在 L-天冬酰胺酶常见范围内（Brenda 酶数据库）。
BLAST 分析显示，核苷酸和蛋白质序列与来自其他芽孢杆菌属物种（特别是枯草芽孢杆菌）的 L-天冬酰胺酶分别具有约 98% 的一致性（e-value 0）和 99% 的相似性（e-value 0）。详细的序列分析揭示了两个独特的氨基酸替换——D89W（mAsp 中为 D46W）和 G102A（mAsp 中为 G59A），这两个位点在其他芽孢杆菌属物种的 L-天冬酰胺酶 II 中并不常见。初步生物信息学分析表明，天然酶比其模板——被确定为其最近同源物（第 2.6 节）并被称为野生型变体——稳定约 2.11 kcal mol⁻¹（−48.22 kcal mol⁻¹ 对比 −46.11 kcal mol⁻¹）。
此外，配体-酶相互作用分析揭示了天冬酰胺配体与天然酶和野生型天冬酰胺酶的不同结合模式（图1）。在天然酶中，配体参与更广泛的相互作用网络：与 D142 形成主链氢键受体相互作用；与 T61 形成侧链氢键供体和受体双重相互作用；与 T109 形成侧链受体相互作用；与 T141 形成主链受体相互作用；与 S108 形成侧链受体相互作用。相比之下，野生型酶的相互作用较少，配体仅与 S108、T109 和 T141 形成主链受体相互作用，以及与 T109 形成额外的侧链受体相互作用。天然酶中更多样化的相互作用（包括一个不直接参与野生型相互作用的酸性残基 D142）表明配体结合更稳定、可能更高效，这有助于增强催化活性。
重组蛋白被设计为包含 His 标签、凝血酶切割位点和 T7 标签（图2），因此分子量比 mAsp 略高。SDS-PAGE 分析确认了表达和纯化的成功（图3）。分析结果显示，诱导样品中出现约 38 kDa 的清晰条带，该条带在未诱导对照样品中不存在，与带标签酶的预期分子量一致。此外，纯化蛋白样品显示单一相似大小的条带，表明纯度足以进行后续分析。值得注意的是，表达过程中未检测到包涵体，表明优化的条件促进了可溶性蛋白的高效生产。该酶被纯化至均质状态，实现了约 12.5 倍纯化，总活性损失低于 18%（表1）。最终产品的比活性为 186.4 U/mg 蛋白，与芽孢杆菌来源 L-天冬酰胺酶的典型报道范围一致。
【数据】ORF：1113 bp，370 aa，~40 kDa；成熟酶：327 aa，34.71 kDa，pI 4.97；一致性：98%（nt）/99%（aa）；独特替换：D89W（D46W）、G102A（G59A）；稳定性提升：2.11 kcal mol⁻¹（−48.22 vs −46.11）；纯化：12.5 倍，活性损失 <18%；比活性：186.4 U/mg；SDS-PAGE 条带：~38 kDa
3.3 天然 L-天冬酰胺酶的生化与生物物理表征
#### 3.3.1 温度活性谱
天然 L-天冬酰胺酶在 45°C 显示最适活性，活性从 20°C 到 45°C 逐渐升高，超过 55°C 后迅速下降。65°C 时，酶保留不到最大活性的 20%；70°C 时完全失活（图4a）。这些发现将该酶归类为中温酶，热耐受范围相对较窄。45°C 的最适温度与地衣芽孢杆菌（37°C）和枯草芽孢杆菌（37°C）相当。相比之下，Thermococcus gammatolerans（85°C）和 Thermococcus kodakarensis（90°C）等嗜热酶表现出显著更高的热稳定性，在极端温度下仍保留活性。天然酶在 55°C 以上活性迅速下降，与其他中温细菌 L-天冬酰胺酶一致，如荧光假单胞菌的酶在超过 45°C 后也丧失活性。
【数据】最适温度：45°C；65°C 残留活性：<20%；70°C：完全失活；对比：B. licheniformis 37°C，B. subtilis 37°C，T. gammatolerans 85°C，T. kodakarensis 90°C
#### 3.3.2 pH 活性谱
该酶在 pH 8.0 时显示最适活性，在 pH 7.0–9.0 范围内保留显著活性。低于 pH 6.0 和高于 pH 9.0 时，酶活性迅速下降，表明其偏好微碱性条件（图4b）。天然酶的 pH 最适值与地衣芽孢杆菌（pH 8.0）和葡萄球菌属（pH 8.6）相当，两者均表现出相似的碱性最适值和在 pH 7.5–9.0 范围内的稳定性。相比之下，T. gammatolerans（pH 8.5）和 T. kodakarensis（pH 8.0）等嗜热酶的 pH 稳定性更宽，在更广泛的碱性范围内保留活性。酿酒酵母天冬酰胺酶 II（pH 6.8–7.0）等真核酶的 pH 最适值低于天然酶。这凸显了天然酶在需要微碱性条件的应用（如食品加工和药物制剂）中的适用性。
【数据】最适 pH：8.0；活性保留范围：pH 7.0–9.0；对比：B. licheniformis pH 8.0，Staphylococcus sp. pH 8.6，T. gammatolerans pH 8.5，T. kodakarensis pH 8.0，S. cerevisiae pH 6.8–7.0
#### 3.3.3 热稳定性
天然酶的热稳定性测定显示，在 40°C 孵育 60 min 后保留 90% 活性，但 50°C 下仅保留 60% 活性。60°C 时，酶在孵育期内几乎完全失活（图4c）。45°C 下计算的半衰期约为 8 h，表明在生理条件下具有中等稳定性，但对高温的抵抗力有限。天然酶的热稳定性相对高于地衣芽孢杆菌的酶（50°C 仅 30 min 保留 60% 活性），但显著低于 T. gammatolerans 等嗜热酶（85°C 下保留活性数小时）。另一方面，酿酒酵母天冬酰胺酶等真核酶的热稳定性更低，50°C 即完全失活。这些发现表明，尽管属于中温酶，天然酶在热耐受性方面优于真核 counterparts。然而，这些结果也凸显了工业应用中进一步增强其热稳定性的必要性。
【数据】40°C/60min：保留 90%；50°C：保留 60%；60°C：几乎完全失活；45°C 半衰期：~8 h；对比：B. licheniformis 50°C/30min 保留 60%，S. cerevisiae 50°C 完全失活
#### 3.3.4 pH 稳定性
天然酶在 pH 7.0–9.0 范围内孵育 1 h 后保留超过 80% 活性，但在 pH 低于 6.0 或高于 9.0 时活性不足 20%（图4d）。该 pH 稳定性谱与枯草芽孢杆菌和葡萄球菌属一致，但窄于……
【数据】pH 7.0–9.0/1h：保留 >80%；pH <6.0 或 >9.0：<20% 活性
讨论与解读
本研究采用计算机辅助定向进化策略提升了 Bacillus sp. SD3 新型 L-天冬酰胺酶的热稳定性。G129F&D291W 双突变体在动力学和热力学稳定性方面均有显著改善，特别适用于需要高温高效降低丙烯酰胺的食品加工场景。丙氨酸扫描、靶向诱变和分子动力学模拟的组合通过减少实验迭代和相关成本，简化了酶工程流程，同时有效识别了稳定化突变。从计算设计到实验验证的稳健过渡，确保了预测的稳定化突变能够可靠转化为工业可行的酶制剂，为开发满足食品加工和其他高温应用严格需求的生物催化剂提供了可扩展的高效途径。重要的是，增强的热性能以最小的催化效率牺牲为代价实现，保持了酶在工业环境中的适用性。本研究中建立的计算工作流程为其他工业相关酶的热稳定化提供了可借鉴的框架。
编译者解读：该研究展示了计算驱动酶工程在合成生物学中的典型范式——先以 AlphaFold2 获取高质量结构模型，再通过多软件交叉验证的丙氨酸扫描锁定关键位点，最后以分子动力学模拟筛选稳定化突变。G129F&D291W 双突变体在热稳定性提升的同时仅以 Km 从 0.21 mM 增至 0.34 mM 的轻微代价换取，体现了理性设计的精准性。值得关注的是，天然酶中两个独特替换（W89、A102）本身已赋予 2.11 kcal mol⁻¹ 的热力学稳定性增益，说明从极端环境筛选新酶源与计算进化策略的叠加效应。该方法学框架对工业酶制剂的快速改良具有普适参考价值，但后续仍需考察该突变体在真实食品加工条件下的长期稳定性与安全性。
参考来源
期刊：International Journal of Biological Macromolecules, 2025
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.146363
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.146363