来源：De novo biosynthesis of steviol-13-O-glucoside in Saccharomyces cerevisiae（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
甜菊糖苷是极具潜力的天然甜味剂，其关键二萜前体甜菊醇-13-O-葡萄糖苷（13-SMG）的微生物合成长期受制于前体供应不足、糖基转移酶活性低、内源糖苷水解酶降解及P450酶功能表达受限等多重瓶颈。本研究通过系统代谢工程策略——强化MVA途径、半理性改造UGT85C2、敲除竞争性水解酶、优化内质网微环境——在酿酒酵母中实现了13-SMG的从头生物合成，5-L生物反应器中产量达到1.3 g/L，为高值天然甜味剂的绿色工业化生产奠定了基础。
研究背景
联合国粮农组织报告显示，全球食糖需求预计到2028年将稳步增至2.03亿吨，较十年间增加3200万吨。长期高糖饮食与糖尿病、心血管疾病及口腔健康问题密切相关，消费者对低热量、更安全的糖替代品的需求持续上升。天然甜味剂作为蔗糖的环保、健康、低热量替代品受到广泛关注。甜菊糖苷（SGs）是二萜类苷元甜菊醇的糖基化衍生物，根据甜菊醇骨架上C13-羟基和C19-羧基连接的糖基数量和位置不同而区分，其中13-SMG在C13位连接一个葡萄糖分子。利用酿酒酵母作为细胞工厂合成甜菊糖苷已成为合成生物学研究热点——其拥有完整的真核蛋白表达系统和强大的异源途径整合能力。然而，13-SMG的从头生物合成仍面临关键酶催化效率有限、电子传递效率不足、前体供应不充分、产物易被内源酶降解等多重挑战。
研究方法
2.1 试剂与基因
鲨烯、对映-贝壳杉烯酸（ent-KA）、甜菊醇和13-SMG标准品购自宝鸡赫斯特生物技术有限公司（中国宝鸡）。高保真DNA聚合酶Phanta Max Master Mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司（中国南京）。鲑鱼精DNA（10 mg/mL）购自北京索莱宝科技有限公司（中国北京）。所有其他化学试剂购自上海生工生物工程股份有限公司（中国上海）。本研究中所有合成基因及其他筛选基因的序列列于表S1。异源基因GfKS、SrKO、SrCPR1、AtKO、AtCYP714A2、AtCPR2和UGT85C2（GenBank: AY345978.1）由无锡青科生物科技有限公司根据酿酒酵母密码子偏好性进行密码子优化。所有基因片段通过聚合酶链反应（PCR）扩增，并使用DNA提取迷你试剂盒（南京诺唯赞）进行凝胶或柱纯化。工程酿酒酵母菌株CEN.PK2-1D（Matα; ura3-52, trp1-289, leu2-3,112, his3Δ1; MAL2-8c; SUC2; gal80:: KanMAX）作为起始菌株，大肠杆菌JM109用于质粒构建和保存。
【数据】标准品来源：宝鸡赫斯特；聚合酶：Phanta Max Master Mix；鲑鱼精DNA浓度：10 mg/mL；菌株：CEN.PK2-1D（酿酒酵母）、JM109（大肠杆菌）；UGT85C2 GenBank编号：AY345978.1
2.2 菌株与质粒
采用CRISPR/Cas9基因编辑系统进行基因敲除和整合。质粒pCRCT用于构建Cas9和单链引导RNA的表达盒。本研究中所有单链引导RNA均通过在线网站设计。质粒构建和测序后，扩增该片段形成供体DNA。供体DNA和p414-guide RNA通过醋酸锂法转化进行基因组编辑。本研究所用工程酵母通过PEG/ssDNA/LiAc法转化。阳性转化子在合成限定培养基平板上筛选，随后通过PCR分析和DNA测序确认。
【数据】基因编辑系统：CRISPR/Cas9；质粒：pCRCT、p414-guide RNA；转化方法：醋酸锂法、PEG/ssDNA/LiAc法
2.3 培养基与发酵条件
大肠杆菌在Luria肉汤培养基（蛋白胨10 g/L；酵母提取物5 g/L；氯化钠10 g/L）中培养，必要时添加氨苄青霉素（100 g/L）。酿酒酵母用YPD培养基（酵母提取物10 g/L；蛋白胨20 g/L；无水葡萄糖20 g/L）培养和活化。固体YPD和Luria肉汤培养基添加2%琼脂。工程酿酒酵母菌株在合成缺陷培养基上生长，该培养基含酵母氮碱基（YNB，1.74 g/L，不含氨基酸）、葡萄糖（20 g/L）和（NH4）2SO4（5 g/L），需要时添加琼脂（20 g/L）。根据菌株营养需求添加尿嘧啶（50 mg/L）和其他适宜氨基酸（组氨酸、色氨酸和亮氨酸；50 mg/L）。摇瓶发酵时，重组酿酒酵母细胞涂布于YNB固体平板，在30°C培养箱中活化。挑取单菌落接种于液体YNB培养基（5 mL），30°C、220 rpm振荡活化20 h作为种子液。最后将细胞接种于液体YPD培养基（25 mL），培养96 h至初始OD600为0.3。5-L生物反应器培养时，将工程菌株单菌落接种于含YPD培养基（25 mL）的250-mL摇瓶中，30°C、24 h、220 rpm培养。以2%接种量转移至含YPD培养基（200 mL）的500-mL种子摇瓶中，30°C、220 rpm过夜培养。以8%种子培养物接种至含YPD培养基（2.5 L）的5-L生物反应器（D型；上海迪必尔生物工程有限公司，中国上海）。整个补料过程中温度维持在30°C，pH通过氨溶液控制在5.5。补料溶液含葡萄糖（600 g/L）、KH2PO4（18 g/L）、MgSO4·7H2O（10.24 g/L）、K2SO4（7 g/L）、Na2SO3（0.56 g/L）、微量元素A（20 mg/L）和微量元素B（24 mg/L：生物素0.05 g/L；泛酸钙1.0 g/L；肌醇1.0 g/L）。
【数据】YPD培养基：酵母提取物10 g/L、蛋白胨20 g/L、无水葡萄糖20 g/L；YNB培养基：1.74 g/L YNB、20 g/L葡萄糖、5 g/L (NH4)2SO4；氨基酸添加：50 mg/L；摇瓶发酵：30°C、220 rpm、96 h、初始OD600 0.3；5-L反应器：30°C、pH 5.5、2.5 L YPD、2%接种、8%接种；补料：葡萄糖600 g/L、KH2PO4 18 g/L、MgSO4·7H2O 10.24 g/L、K2SO4 7 g/L、Na2SO3 0.56 g/L、微量元素A 20 mg/L、微量元素B 24 mg/L
2.4 结构预测、分子对接与定点突变
使用跨膜隐马尔可夫模型生物信息学工具（ver. 2.0）预测SrKO和AtKO的跨膜结构域（TMDs）。使用AlphaFold 3多组分人工智能系统模拟UGT85C2的三维蛋白结构，UDP-葡萄糖（UDPG）的初始构象从PubChem数据库获取。底物与酶对接使用RosettaDock算法完成。分子对接的Rosetta脚本使用HighResDocker和InterfaceAnalyzerMover工具开发。涉及底物通道建模的蛋白质和分子可视化使用分子可视化系统PyMOL 2.3.0和CAVER 3.0.3完成。分子动力学模拟按此前描述的方法进行。蛋白-配体复合物的初始坐标从分子对接获得；分别提取蛋白（ATOM记录）和配体（HETATM记录）坐标进行独立处理，其中蛋白使用GROMACS 2021.3以AMBER99SB-ILDN力场和SPC/E水模型参数化，配体的原子部分电荷（净电荷=0）通过AmberTools的antechamber模块以AM1-BCC方法计算，随后使用acpype生成GROMACS兼容的GAFF力场拓扑文件；复合物置于立方周期盒中（最小溶质-盒边界距离=1.2 nm），用显式SPC/E水溶剂化，以Na+和Cl−离子中和，通过最速下降算法能量最小化直至最大力收敛至<1000 kJ mol−1·nm−1；平衡分两步各100 ps（nsteps = 50,000，dt = 2 fs），蛋白重原子施加谐波约束（NVT在300 K下使用V-rescale恒温器，τt = 0.1 ps，蛋白/非蛋白分别耦合；NPT在300 K和1 bar下使用Berendsen恒压器，τp = 2.0 ps，等温压缩率 = 4.5 × 10−5 bar−1）；长程静电使用PME方法处理（插值阶数=4，傅里叶间距=0.16 nm），静电和范德华相互作用的短程截断为1.4 nm，所有含H共价键通过LINCS算法约束，生产性MD模拟在300 K和1 bar下运行100 ns，轨迹每10 ps保存一次。
【数据】TMD预测工具：TMHMM 2.0；结构预测：AlphaFold 3；对接算法：RosettaDock；可视化：PyMOL 2.3.0、CAVER 3.0.3；MD模拟：GROMACS 2021.3、AMBER99SB-ILDN力场、SPC/E水模型、AM1-BCC电荷、GAFF力场、盒边界1.2 nm、能量最小化<1000 kJ mol−1·nm−1、平衡2×100 ps、NVT 300 K、NPT 300 K/1 bar、PME、截断1.4 nm、LINCS、100 ns、保存间隔10 ps
2.5 样品处理
胞内提取：将发酵液（0.5 mL）转移至匀浆管中，12,000 rpm离心5 min。弃上清后，向沉淀菌体中加入甲醇（1 mL）和等体积氧化锆珠（直径0.5 mm），使用快速样品制备系统进行五轮匀浆。12,000 rpm离心2 min后，将上清转移至Eppendorf管（0.5 mL），经尼龙膜（孔径0.22 μm）过滤。收集滤液用于高效液相色谱（HPLC）和离子阱-飞行时间液相色谱-质谱联用（IT-TOF-LC-MS）分析。胞外提取：将发酵液（1 mL）转移至破碎管中，12,000 rpm离心5 min。将上清转移至Eppendorf管（1.5 mL），与甲醇（0.5 mL）混合，振荡5 min。所得上清经尼龙膜（孔径0.22 μm）过滤，用于HPLC和IT-TOF-LC-MS分析。
【数据】胞内提取：发酵液0.5 mL、12,000 rpm离心5 min、甲醇1 mL、锆珠直径0.5 mm、五轮匀浆、12,000 rpm离心2 min、滤膜0.22 μm；胞外提取：发酵液1 mL、12,000 rpm离心5 min、甲醇0.5 mL、振荡5 min、滤膜0.22 μm
2.6 分析方法
残留葡萄糖使用（原文未详述具体定量方法）。
【数据】残留葡萄糖定量方法：原文未详述
研究结果
3.1 在酿酒酵母中构建ent-KA和甜菊醇生物合成途径
酿酒酵母的内源代谢网络缺乏SG修饰酶系统。将来自甜叶菊的关键酶SrCPS（钴焦磷酸合酶）、SrKS（贝壳杉烯合酶）和SrKO（贝壳杉烯氧化酶）引入酿酒酵母细胞，构建菌株SS01（图2A），但未检测到甜菊醇积累（图2B）。为实现ent-KA的异源合成，将SrCPS和SrKS的常规组合替换为GfKS，构建菌株SS02。摇瓶发酵结果表明，工程菌株SS02产生38.7 mg/L的ent-KA（图2B，图S1）。
为优化ent-KA合成，以菌株SS02（GfKS + 全长SrKO + 无外源CPR）为对照，将两种来源（来自甜叶菊的SrKO和来自拟南芥的AtKO）的两种贝壳杉烯氧化酶修饰（全长或截短TMD）与两种电子供体（SrCPR1和AtCPR2）组合，构建了八个菌株（SS03-1至SS03-8）（图2C，图S7）。摇瓶培养显示，菌株SS03-6的ent-KA产量达到84.5 mg/L，而原始菌株不产生ent-KA（图2C）。因此，双功能酶GfKS、截短TMD的贝壳杉烯氧化酶trSrKO和电子供体AtCPR2的共表达构成ent-KA合成的最佳组合。来源于AtCYP714A2的13-羟化酶KA13H在催化ent-KA途径合成SGs方面表现出最佳性能。直接引入密码子优化的AtCYP714A2后，菌株SS04-1仅能催化ent-KA转化为甜菊醇，产量为8.4 mg/L。P450酶AtCYP714A2的活性需要CPR提供电子。筛选AtCPR2和SrCPR1，通过柔性接头（GGGGS）n（n = 1–3）融合以进一步提高甜菊醇产量。结果表明，柔性接头（GGGGS）3的存在和长度显著影响甜菊醇产量。与未融合的菌株SS04-2和SS04-3相比，菌株SS04-6通过柔性接头（GGGGS）3融合获得最高甜菊醇产量52.4 mg/L（图2D）。因此，AtCYP714A2与SrCPR1通过柔性接头（GGGGS）3的融合表达是催化ent-KA转化为甜菊醇的最佳组合。
【数据】SS01：未检测到甜菊醇；SS02：ent-KA 38.7 mg/L；SS03-6：ent-KA 84.5 mg/L；SS04-1：甜菊醇 8.4 mg/L；SS04-6：甜菊醇 52.4 mg/L（(GGGGS)3融合）；对照菌株：不产生ent-KA
3.2 通过酿酒酵母系统代谢工程优化甜菊醇产量
将甜菊醇合成的最优表达组合（AtCYP714A2-(GGGGS)3-SrCPR1）整合至多拷贝位点Ty1，构建了15个菌株（SS05-1至SS05-15）。其中，菌株SS05-12实现了最高的甜菊醇从头合成产量79.6 mg/L（图3A）。
为克服甜菊醇生物合成中MVA途径的代谢瓶颈，对底盘菌株SS05-12进行系统代谢工程改造。MVA途径中限速酶tHMG1、IDI1、ERG10、ERG12、ERG13、ERG20F96C和BTS1的共过表达有效增强了甜菊醇前体GGPP的产量（图3B）。摇瓶发酵结果显示，工程菌株SS11的甜菊醇产量达到128.8 mg/L，较对照菌株SS05-12提高了61%（图3C）。为增强工程菌株的乙酰-CoA供应和乙醇消耗，敲除调控乙酰-CoA进入丙二酰-CoA循环的MLS1基因，同时插入ADH2和ALD6基因。所得工程菌株SS13的甜菊醇产量达到139.1 mg/L（图3D）。此外，为缓解鲨烯生物合成途径的内源竞争，将ERG9的天然启动子替换为弱启动子HXT1p或动态调节的麦角固醇响应启动子ERG1p。结果表明，以ERG1启动子替换ERG9启动子构建的菌株SS16表现最佳，甜菊醇产量达到154.1 mg/L（图3D）。同时，副产物鲨烯的积累从58.3 mg/L降至12.4 mg/L（图S2）。酿酒酵母MVA途径的强化、乙醇消耗的增强以及ERG9天然启动子的替换以抑制竞争性鲨烯合成，共同进一步增加了甜菊醇从头生物合成的前体供应。
【数据】SS05-12：甜菊醇 79.6 mg/L；SS11：甜菊醇 128.8 mg/L（较SS05-12提高61%）；SS13：甜菊醇 139.1 mg/L；SS16：甜菊醇 154.1 mg/L；鲨烯：从58.3降至12.4 mg/L
3.3 通过UGT85C2半理性设计增强13-SMG生物合成
将来自甜叶菊的天然糖基转移酶UGT85C2整合至初始酿酒酵母菌株C800中异源生产13-SMG。在发酵过程中添加100 mg/L甜菊醇，获得13-SMG产量62.3 mg/L（图4A，图S3）。
为提高13-SMG产量，对天然糖基转移酶UGT85C2进行半理性设计。使用AlphaFold3预测UGT85C2的三维结构（图S4），并使用RosettaDock算法对接底物UDPG和甜菊醇以验证可靠性。对接分析揭示了UDPG与活性位点残基之间的强相互作用——包括两个磷酸桥以及与S22/H377的氢键（图4B，图S5）——表明UDPG周围区域的可修饰空间有限。因此，丙氨酸扫描聚焦于甜菊醇周围区域，仅选择对接酶-底物复合物中距甜菊醇底物5 Å以内的氨基酸残基进行丙氨酸扫描（图4C）。与野生型（WT）菌株相比，W400A和T304A突变导致酶活性显著增加。然而，对于与甜菊醇羧基形成氢键的S303残基，突变为丙氨酸后酶活性显著降低，表明S303残基是稳定甜菊醇在活性口袋中结合的位点（图4C和D）。在其余活性变化的变体中，F91A表现出最显著的酶活性降低。随后在活性显著变化的位点（F91A、W400A和T304A）进行饱和突变，获得活性变体L91V、L91F、T304A、W400A和W400V（图S8）。将迭代突变组合至变体L91V，其活性显著高于WT，最终获得突变体UGT85C2T304A/W400V/L91F（图4E）。将WT UGT85C2和突变体UGT85C2T304A/W400V/L91F分别整合至甜菊醇生产菌株SS16中，构建菌株SS17-1和SS17-2。发酵结果表明，菌株SS17-2催化甜菊醇合成13-SMG的能力显著优于菌株SS17-1。具体而言，菌株SS17-2实现13-SMG的从头合成产量131.7 mg/L，而菌株SS17-1仅合成92.5 mg/L（图4F）。为进一步阐明反应中甜菊醇与UGT85C2T304A/W400V/L91F结合的优越能力，将UDPG的C1原子锚定至甜菊醇的C13原子、S303残基的O原子锚定至甜菊醇C19羧基，对WT和突变体UGT85C2T304A/W400V/L91F进行分子动力学模拟。结果表明，在100 ns反应时间内，突变体UGT85C2T304A/W400V/L91F中UDPG与甜菊醇之间的距离较WT更近（图4F和G），且S303在UGT85C2T304A/W400V/L91F中维持稳定时间更长。这些结果表明，底物甜菊醇在突变体UGT85C2T304A/W400V/L91F活性位点中采用了比WT更有利的反应构象，直接导致UGT85C2T304A/W400V/L91F反应所需能量更低。
【数据】C800+100 mg/L甜菊醇：13-SMG 62.3 mg/L；W400A和T304A：活性显著增加；S303A：活性显著降低；F91A：活性降幅最大；SS17-2（UGT85C2T304A/W400V/L91F）：13-SMG 131.7 mg/L；SS17-1（WT）：13-SMG 92.5 mg/L；MD模拟：100 ns
3.4 优化13-SMG生物合成
（原文此节内容未完整提供，以下根据已有信息编译）
内质网（ER）为蛋白质的正确折叠提供了有利的微环境。通过扩大ER面积进行代谢优化。在酿酒酵母中过表达内源糖苷水解酶。组合敲除糖苷水解酶的结果显示（图5D，原文未详述具体菌株与数据）。
【数据】本节具体菌株与数据：原文未详述
3.5 5-L生物反应器补料分批发酵
在5-L生物反应器中进行了13-SMG菌株的补料分批发酵。接种后前24 h每6 h取样一次，24至120 h之间每12 h取样一次。菌株SS37-16和SS37-22的发酵曲线分别如图6A和图6B所示（原文未详述具体发酵参数与最终产量数值，但摘要提及最终产量为1.3 g/L）。
【数据】取样：前24 h每6 h一次，24-120 h每12 h一次；菌株：SS37-16、SS37-22；最终产量：1.3 g/L（5-L生物反应器）
讨论与解读
酿酒酵母作为甜菊糖苷生物合成的细胞工厂已成为合成生物学研究热点，其具备完整的真核蛋白表达系统和强大的异源途径整合能力。然而，13-SMG的从头生物合成仍面临多重挑战：关键酶催化效率有限，直接限制中间体向13-SMG的转化率；相关酶系统的电子传递效率不足，核心酶与辅助组件的协调性难以满足高效底物转化的需求；宿主酿酒酵母提供的关键前体不足，碳通量分布偏向竞争途径而非有效导向13-SMG合成；合成的13-SMG易被内源酶降解，功能酶表达所需的胞内微环境不理想，进一步限制了整体产量。本研究通过多维策略提升了酿酒酵母中13-SMG的从头合成产量。
编译者解读：本研究展现了典型的合成生物学系统思维——从P450酶截短与电子供体配对、MVA途径多基因共过表达、启动子动态调控，到糖基转移酶半理性改造与内质网微环境优化，层层递进地解决代谢瓶颈。尤其值得关注的是将AlphaFold3结构预测与RosettaDock分子对接引入UGT85C2改造，实现了从"试错突变"到"精准设计"的范式转换。5-L反应器1.3 g/L的产量虽具工业潜力，但距离商业化仍有距离——未来可在酶定向进化、动态调控网络及发酵工艺放大等方面持续深化，同时糖基水解酶的组合敲除策略也为其他苷类天然产物的微生物合成提供了可借鉴的抗降解思路。
参考来源
Luo, S. (2026). De novo biosynthesis of steviol-13-O-glucoside in Saccharomyces cerevisiae. Food Bioscience. DOI: 10.1016/j.fbio.2026.108608
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.108608