来源：Efficient production of cordycepin in engineered Saccharomyces cerevisiae（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
虫草素（cordycepin, COR）是一种具有抗肿瘤和免疫调节活性的生物活性核苷，传统生产依赖蛹虫草发酵，周期长且产量低。本研究将虫草素生物合成途径导入酿酒酵母CEN.PK530-1C，通过合成无膜细胞器（MLOs）实现关键酶的空间共定位，结合途径水平代谢优化和效应分子筛选，最终在6 L生物反应器中获得6972.8 mg/L的虫草素产量，为迄今酿酒酵母中的最高报道值。
研究背景
虫草素（3′-脱氧腺苷）是一种天然存在于蛹虫草、构巢曲霉等多种丝状真菌中的生物活性核苷，具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、免疫调节和抗氧化等多样药理活性，在药物、功能食品和化妆品领域具有广阔应用前景。目前虫草素生产主要依赖蛹虫草子实体提取或液体发酵，以及化学合成路线。然而，真菌培养周期长、产量低，化学合成效率不高且环境负担重。微生物异源合成因此成为可持续且具有工业可行性的替代方案。蛹虫草中鉴定的虫草素专用生物合成基因簇（cns1-cns4）为异源微生物生产奠定了基础，其中cns1和cns2编码的蛋白Cns1和Cns2在脂滴内组装成稳定复合物，对虫草素生物合成不可或缺。
研究方法
2.1 质粒与菌株
本研究所用质粒、菌株和引物均列于补充材料中。引物由GENEWIZ生物技术公司（中国苏州）合成。大肠杆菌Trans1T1用于质粒构建和繁殖。酿酒酵母BY4742（MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0）和CEN.PK530-1C（MATα tpi1 (41–707)::loxP-kanMX4-loxP）作为虫草素生产的宿主菌株。CEN.PK530-1C是携带染色体TPI1基因删除的原养型衍生菌株，而BY4742是具有明确遗传标记的营养缺陷型实验室菌株。
采用pG418和CPOTud两种表达系统进行虫草素生物合成基因的异源表达。pG418质粒携带kanMX抗性盒，通过持续G418抗生素选择维持；CPOTud质粒携带粟酒裂殖酵母POT1基因，可互补CEN.PK530-1C的染色体TPI1缺失，从而在葡萄糖培养基上生长并实现无抗生素的稳定质粒维持。为便于多步菌株构建过程中的筛选，并在统一质粒体系下对不同宿主菌株进行系统比较，CPOTud质粒上原有的氨苄青霉素抗性标记被替换为博来霉素抗性盒。
来自蛹虫草的酮脱氧腺苷还原酶基因（cns1, CCM_04436）和腺苷酸磷酸水解酶基因（cns2, CCM_04437）经密码子优化后合成。cns1（由TPI1启动子和ADH1终止子控制）和cns2（由TEF1启动子和GAL2终止子控制）的表达盒经特异性引物PCR扩增后组装，构建质粒pG418-Cns1-Cns2和CPOTud-Cns1-Cns2。随后，将pG418-Cns1-Cns2导入BY4742获得菌株SBG，将CPOTud-Cns1-Cns2分别导入BY4742和CEN.PK530-1C获得菌株SBC和SCC。
为评估酶复合物形成，通过PCR将cns1和cns2与柔性接头（(GGGGS)3、(GGGGS)4、VDGGSGR）或刚性接头（(EAAAK)4、(VDEAAAKSGR)）融合，构建重组质粒CPOTud-F1、CPOTud-F2、CPOTud-F3、CPOTud-R1和CPOTud-R2。转化CEN.PK530-1C后获得相应菌株SCCF1、SCCF2、SCCF3、SCCR1和SCCR2。
为增强Cns1和Cns2在虫草素生物合成中的有效共定位和功能偶联，采用基于液-液相分离（LLPS）的合成MLOs策略。通过将人工固有无序蛋白（A-IDPs）和正交卷曲螺旋招募标签（P3/P4）与Cns1和Cns2融合，设计并构建了一系列质粒（CPOTud-M1至M12），系统研究不同融合构建对虫草素生产的影响。具体而言，在CPOTud-M1、CPOTud-M2和CPOTud-M3组中，A-IDPs融合至Cns1或Cns2的N端，诱导MLOs形成并在动态区室中富集催化酶。所得质粒导入酿酒酵母CEN.PK530-1C后分别获得重组菌株SCCM1、SCCM2和SCCM3。在CPOTud-M4、CPOTud-M5和CPOTud-M6组中，基于M1、M2和M3，将正交卷曲螺旋肽P3和P4融合至Cns1和Cns2的N端，导入后生成菌株SCCM4、SCCM5和SCCM6。在CPOTud-M7、CPOTud-M8和CPOTud-M9组中，基于M1、M2和M3，将P3和P4融合至Cns1和Cns2的C端，转化获得菌株SCCM7、SCCM8和SCCM9。在CPOTud-M10、CPOTud-M11和CPOTud-M12组中，基于质粒CPOTud-M2、CPOTud-M3和CPOTud-M8，将红色荧光蛋白mKate2融合至Cns1的C端，用于荧光可视化并验证MLOs的形成及其相对于天然脂滴的空间分布。这些mKate2标记质粒导入CEN.PK530-1C后生成相应菌株SCCM10、SCCM11和SCCM12。
途径优化方面，采用CRISPR-Cas9质粒pCAS-Hyg-N20（潮霉素B抗性）在酿酒酵母CEN.PK530-1C中进行靶向基因编辑。首先删除编码腺苷脱氨酶的YJL070C基因以阻断虫草素降解，获得重组菌株SCC1。随后将pgk1（磷酸甘油酸激酶）和pyk2（丙酮酸激酶）基因分别整合至1622b位点以增强ATP供应，生成菌株SCC2和SCC3。将pos5（NADH激酶）和zwf1（葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）基因分别整合至106a位点以改善NADPH再生，获得菌株SCC4和SCC5。最后将pos5导入SCC2，生成菌株SCC6。为评估合成MLOs策略与途径水平代谢优化的联合效应，将质粒CPOTud-M8导入途径水平代谢优化菌株，生成菌株SCC7。相应的sgRNA和同源臂使用补充材料所列引物经PCR生成。所有质粒通过醋酸锂法导入酵母，转化子在含G418（400 mg/L）、潮霉素B（400 mg/L）或博来霉素（100 mg/L）的YPD琼脂上筛选。
2.2 培养基与培养条件
大肠杆菌在LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中添加适当抗生素（100 mg/L氨苄青霉素或50 mg/L博来霉素），于37°C、200 rpm振荡培养。酿酒酵母CEN.PK530-1C菌株在YPE培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、10 g/L乙醇）中生长，而携带CPOTud质粒的转化子在YPD培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）中培养。对于携带CPOTud质粒的转化子，菌株构建阶段施加抗生素选择，生产阶段不添加抗生素。BY4742菌株及其重组衍生菌株在相同条件下于YPD中培养，培养期间添加相应抗生素维持质粒。摇瓶培养在250 mL挡板摇瓶中进行，装液量50 mL，30°C、220 rpm。虫草素生产时，所有菌株在YPDA培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、50 g/L葡萄糖、1 g/L腺嘌呤）中培养至144 h。
代谢效应分子的单因素筛选用于评估其对虫草素生物合成的影响。测试化合物包括金属离子（Cu2+、Fe2+、Zn2+和Mg2+）0.1–10 mM，维生素（VB1和VC）0.005–0.2 g/L。氨基酸（谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和天冬氨酸）在不同浓度范围测试，其中谷氨酸、半胱氨酸和天冬氨酸为0.5–5 g/L，甘氨酸为1–20 g/L。此外，柠檬酸（0.5–10 g/L）和茶多酚（0.1–8 g/L）作为其他代谢效应分子进行评估。基于筛选结果，Cu2+（0.1 mM）、天冬氨酸（2 g/L）和半胱氨酸（2 g/L）被确定为三个最有影响力的效应因子。这些因子进一步通过L9（33）正交试验优化其组合效应。
2.3 蛋白质序列与结构分析
采用AlphaFold3（一种最先进的蛋白质结构预测工具）研究Cns1和Cns2的结构特征。该平台因其在蛋白质折叠和相互作用预测方面的高精度而被广泛认可。本研究在云端计算平台上运行AlphaFold3。
【数据】培养基：LB/YPD/YPE/YPDA；温度：37°C（大肠杆菌）/30°C（酵母）；转速：200 rpm（大肠杆菌）/220 rpm（酵母）；抗生素浓度：G418 400 mg/L、潮霉素B 400 mg/L、博来霉素 100 mg/L、氨苄青霉素 100 mg/L；YPDA成分：10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、50 g/L葡萄糖、1 g/L腺嘌呤；金属离子筛选范围：0.1–10 mM；维生素筛选范围：0.005–0.2 g/L；谷氨酸/半胱氨酸/天冬氨酸筛选范围：0.5–5 g/L；甘氨酸筛选范围：1–20 g/L；柠檬酸：0.5–10 g/L；茶多酚：0.1–8 g/L；培养时间：144 h
研究结果
3.1 酿酒酵母中虫草素的高效生产
将虫草素生物合成途径导入酿酒酵母菌株CEN.PK530-1C和BY4742进行虫草素生产。其中，CEN.PK530-1C是CEN.PK菌株背景的原养型衍生菌，携带染色体TPI1基因（编码磷酸丙糖异构酶）缺失，因此不能以葡萄糖为唯一碳源生长。CPOTud质粒利用粟酒裂殖酵母POT1基因作为标记互补宿主的TPI1突变，使携带CPOTud质粒的CEN.PK530-1C在葡萄糖为唯一碳源的培养基中实现稳定表达并保持高质粒稳定性。
为比较不同宿主-质粒组合对虫草素生产的影响，构建了三种重组菌株：SBG（BY4742携带pG418-Cns1-Cns2）、SBC（BY4742携带CPOTud-Cns1-Cns2）和SCC（CEN.PK530-1C携带CPOTud-Cns1-Cns2）。培养144 h后，两种BY4742衍生菌株无论使用何种质粒系统均表现出有限的虫草素产量。SBG产生162.4 mg/L，OD600为17.8；SBC产生130.7 mg/L，OD600为16.7（图1a）。相比之下，SCC实现了870.7 mg/L的虫草素产量，且生物量积累高，OD600达到55.3。通过HPLC和LC-MS分析确认了工程菌株合成的虫草素身份（见补充材料）。SBC和SCC尽管使用相同的CPOTud质粒系统但性能差异显著，表明宿主底盘生理在决定虫草素产量方面起主导作用。这一结果也与先前研究报道的虫草素产量与生物量积累正相关的结论一致。CEN.PK530-1C更高的生物量积累支撑了其更高的虫草素产量，因此该菌株被选为后续研究的宿主。
先前研究表明Cns1和Cns2形成强功能复合物，对虫草素生物合成至关重要。为深入了解其相互作用的结构基础，采用AlphaFold3预测Cns1与Cns2之间的结合界面。预测的复合物揭示了多种分子间接触，包括盐桥（E151-K97、R334-E108）、氢键（S160-Q96、T307-E108）和疏水相互作用（Q319-L117）（图1b和d）。这些特征表明Cns1-Cns2形成稳定且特异的结合，可能促进催化过程中的共定位和底物通道化。
为进一步增强这一相互作用，通过柔性接头（(GGGGS)3、(GGGGS)4、VDGGSGR）或刚性接头（(EAAAK)4、VDEAAAKSGR）将Cns1和Cns2共价连接，生成重组菌株SCCF1、SCCF2、SCCF3、SCCR1和SCCR2。然而，所有融合变体的虫草素产量相比SCC菌株均显著下降（图1c）。这些结果表明强制共价连接损害了虫草素生物合成，最可能的原因是破坏了催化所必需的天然构象柔性。有趣的是，类似的融合策略在解脂耶氏酵母中提高了虫草素产量，凸显了融合工程的功能结果强烈依赖于宿主特异的蛋白质折叠和胞内环境。
【数据】SBG产量：162.4 mg/L，OD600 17.8；SBC产量：130.7 mg/L，OD600 16.7；SCC产量：870.7 mg/L，OD600 55.3；培养时间：144 h；盐桥残基：E151-K97、R334-E108；氢键残基：S160-Q96、T307-E108；疏水相互作用残基：Q319-L117
3.2 工程化合成无膜细胞器增强虫草素生物合成
先前研究报道虫草素生物合成发生在脂滴中。然而，酿酒酵母作为非产油酵母，仅含有有限数量的脂滴，这可能限制虫草素的生物合成。通过LLPS形成的MLOs提供了一种替代策略，可在动态受限区室中选择性富集酶和底物，从而提高催化效率并减少中间体损失。为利用这一原理，采用A-IDPs驱动相分离并组装MLOs，设计了一系列融合构建以考察不同设计对虫草素生物合成的影响。
鉴于Cns1能天然招募Cns2形成虫草素生物合成所需的功能酶复合物，将A-IDPs融合至任一酶均有望促进它们在相分离区室中的共定位。A-IDPs被融合至目标酶的N端，因为N端融合使相分离驱动结构域在翻译早期暴露，有利于分子间相互作用和凝聚体成核。通过将A-IDPs分别融合至Cns1、Cns2或两者的N端，构建了三种重组菌株SCCM1、SCCM2和SCCM3（图2a）。SCCM1和SCCM2分别产生998.4 mg/L和1068.6 mg/L虫草素，相比SCC菌株分别提高14.7%和22.7%。相比之下，SCCM3（Cns1和Cns2同时融合A-IDPs）实现了1196.3 mg/L的虫草素产量（提高37.3%）。这一结果表明，赋予Cns1和Cns2相分离能力增强了它们在相分离微环境中的局部富集，从而提高了酶共现和功能互作的有效概率，优于单独富集任一酶的效果。
为进一步提高Cns1和Cns2的共定位效率，引入正交卷曲螺旋肽（P3/P4）作为招募标签以促进特异性酶聚集。基于三种亲本构建（SCCM1、SCCM2、SCCM3），首先测试了将P3/P4标签置于酶N端的效果。构建了菌株SCCM4（A-IDP在Cns1上，P3/P4在两种酶的N端）、SCCM5（A-IDP在Cns2上，P3/P4在两种酶的N端）和SCCM6（A-IDPs在两种酶上，P3/P4在两种酶的N端）。出乎意料的是，这些N端融合导致虫草素产量急剧下降，分别为96.5 mg/L、56.2 mg/L和不可检测水平（0 mg/L）。这些结果表明将招募标签融合至Cns1和Cns2的N端显著降低了虫草素产量。
为确定这种负面效应反映的是N端排列方式而非招募模块本身，将P3和P4重新定位至Cns1和Cns2的C端，生成SCCM7、SCCM8和SCCM9。P3/P4的C端融合恢复甚至增强了虫草素合成。具体而言，SCCM7（源自SCCM1）产生914.1 mg/L虫草素，与其亲本菌株相当；SCCM8（源自SCCM2）在所有MLOs构建中呈现最高产量（1209.5 mg/L），相比SCC菌株提高38.9%。SCCM9产生894.3 mg/L，低于SCCM8，表明不对称标记更有利于虫草素生物合成。综合来看，这些结果表明将P3/P4招募标签融合至C端可恢复甚至增强虫草素合成（SCCM8）。相比之下，将P3/P4招募标签融合至N端（SCCM4、SCCM5和SCCM6）导致虫草素产量急剧下降。这种下降可能归因于多个功能模块竞争同一末端区域导致的过度空间拥挤和构象约束，损害了酶的正确折叠或催化活性。另一方面，由于Cns1和Cns2必须形成特异性功能复合物才能催化3′-AMP转化为虫草素，将招募标签融合至N端可能破坏了这一必需复合物的正确组装。因此，将相分离驱动因子（A-IDPs）和招募元件（P3/P4）分布在不同末端，在保持MLOs内有效酶共定位的同时减轻了结构干扰。
【数据】SCCM1产量：998.4 mg/L（+14.7%）；SCCM2产量：1068.6 mg/L（+22.7%）；SCCM3产量：1196.3 mg/L（+37.3%）；SCCM4产量：96.5 mg/L；SCCM5产量：56.2 mg/L；SCCM6产量：0 mg/L；SCCM7产量：914.1 mg/L；SCCM8产量：1209.5 mg/L（+38.9%）；SCCM9产量：894.3 mg/L
3.3 途径水平代谢优化与MLOs整合对虫草素生产的影响
在MLOs策略基础上，进一步实施途径水平代谢优化以增强虫草素生物合成。首先，通过CRISPR-Cas9删除YJL070C基因（编码腺苷脱氨酶），阻断虫草素降解途径，生成菌株SCC1。随后通过过表达pgk1和pyk2增强ATP供应，过表达pos5和zwf1增强NADPH再生。单基因修饰的效果如图3a所示。删除YJL070C（SCC1）、过表达pgk1（SCC2）、pyk2（SCC3）、pos5（SCC4）、zwf1（SCC5）以及pgk1+pos5组合（SCC6）均对虫草素产量产生了不同程度的影响。其中，删除YJL070C和过表达pgk1、pos5的组合策略（SCC6）表现出最优效果。
为进一步评估合成MLOs策略与途径水平代谢优化的联合效应，将质粒CPOTud-M8导入途径水平代谢优化菌株，生成菌株SCC7。SCC7在摇瓶培养中实现了1515.5 mg/L的虫草素产量（图3b），显著高于仅采用单一策略的菌株。这一结果证实了空间酶组织与途径水平代谢优化的协同整合能够有效提升虫草素生物合成效率。
【数据】SCC7产量：1515.5 mg/L；代谢修饰：YJL070C删除、pgk1过表达、pyk2过表达、pos5过表达、zwf1过表达、pgk1+pos5组合过表达
3.4 代谢效应分子对虫草素生产的影响
在菌株优化的基础上，进一步筛选代谢效应分子以提升虫草素产量。单因素筛选测试了金属离子（Cu2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+）、维生素（VB1和VC）、氨基酸（谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、天冬氨酸）、柠檬酸和茶多酚对SCC菌株虫草素生产的影响。结果显示，不同金属离子对虫草素产量具有差异化影响（图4a），维生素VB1和VC也表现出不同程度的促进效果（图4b），氨基酸中谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸和天冬氨酸的影响各异（图4c）。
基于单因素筛选结果，Cu2+（0.1 mM）、天冬氨酸（2 g/L）和半胱氨酸（2 g/L）被确定为三个最有影响力的效应因子。通过L9（33）正交试验优化其组合效应。显著性分析确认了各效应因子对虫草素产量的影响程度（图5a）。在最优组合条件下，SCC7菌株在添加代谢效应分子后，虫草素产量进一步提升至1676.5 mg/L（图5b）。
【数据】最优效应因子组合：Cu2+ 0.1 mM、天冬氨酸 2 g/L、半胱氨酸 2 g/L；SCC7+效应分子产量：1676.5 mg/L；金属离子筛选范围：0.1–10 mM；维生素筛选范围：0.005–0.2 g/L；谷氨酸/半胱氨酸/天冬氨酸：0.5–5 g/L；甘氨酸：1–20 g/L；柠檬酸：0.5–10 g/L；茶多酚：0.1–8 g/L
3.5 6 L生物反应器补料分批发酵
为评估菌株SCC7的工业化应用潜力，在6 L生物反应器中进行了补料分批发酵。不添加代谢效应分子的条件下（图6a），SCC7的虫草素产量随时间持续积累。添加代谢效应分子后（图6b），虫草素产量进一步显著提升。在补料分批发酵中，SCC7在6 L生物反应器中实现了6972.8 mg/L的虫草素产量，这是迄今酿酒酵母中报道的最高虫草素产量。
【数据】发酵规模：6 L生物反应器；发酵模式：补料分批；SCC7最高产量：6972.8 mg/L
讨论与解读
本研究通过整合多种工程策略实现了酿酒酵母中虫草素的高效生产。合成MLOs策略通过A-IDPs驱动相分离和P3/P4正交卷曲螺旋招募标签的合理布局，有效增强了Cns1和Cns2在无膜区室中的共定位与功能偶联。值得注意的是，招募标签的融合位置至关重要——N端融合导致产量急剧下降，而C端融合恢复甚至增强了合成效率，提示多模块融合时的空间位阻和构象约束对酶功能具有决定性影响。途径水平代谢优化通过删除腺苷脱氨酶基因阻断降解、过表达pgk1和pos5增强ATP和NADPH供应，与MLOs策略形成协同效应。代谢效应分子筛选进一步将产量推至更高水平。最终在6 L生物反应器中达到6972.8 mg/L，为酿酒酵母中迄今最高报道值。
编译者解读：该研究展示了空间组织工程与代谢网络优化的协同威力。从合成生物学应用角度看，MLOs策略为多酶级联反应的空间调控提供了通用平台——通过相分离实现酶的局部富集，比传统的共价融合更具构象灵活性。但N端融合的失败案例也提醒我们：蛋白融合设计需充分考虑结构域间的空间冲突。未来若能将此平台扩展至其他生物活性核苷的异源合成，将具有广阔的工业化前景。6 L反应器接近7 g/L的产量已具备商业竞争力，但摇瓶到反应器的放大效应和效应分子的成本效益仍需进一步评估。
参考来源
Zhang H. Efficient production of cordycepin in engineered Saccharomyces cerevisiae. Bioresource Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134565
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.134565