来源：Combinatorial metabolic engineering and process optimization enables highly efficient production of L-lactic acid by acid-tolerant Saccharomyces cerevisiae（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
L-乳酸是食品、制药和化妆品行业的重要原料。本研究以耐pH 2.4的酿酒酵母TAM菌株为底盘，通过外源表达L-乳酸脱氢酶、弱化乙醇和甘油合成途径、调控羧酸转运蛋白、强化能量供应与氧化还原平衡，逐步将摇瓶L-乳酸产量提升至72.7 g/L。在15-L生物反应器中进一步优化种子液、溶氧和pH等发酵条件后，产量达到192.3 g/L，产率为0.78 g/g。该研究展示了代谢工程与发酵工艺优化相结合的高效L-乳酸生物合成策略。
研究背景
L-乳酸（L-LA）是一种天然有机酸，广泛用于食品、制药、化妆品、烟草和化工行业。其生产方法主要包括化学合成、酶法和微生物发酵。化学合成存在底物毒性、产生氢氰酸及成本高等局限；酶法虽光学特异性高，但条件苛刻繁琐，难以工业化。微生物发酵因原料广泛、成本低、光学纯度高且产品安全，已成为L-乳酸生产的主流方法。酿酒酵母凭借其耐酸性和清晰的遗传背景，已被广泛用于L-苹果酸、L-乳酸和粘康酸等多种有机酸的生物合成。向酿酒酵母中引入L-乳酸脱氢酶（L-LDH）可实现L-乳酸生物合成，在此基础上可进一步施加多种代谢调控策略。
研究方法
2.1 菌株与试剂
本研究所用底盘细胞为酿酒酵母TAM（通过适应性实验室进化筛选的耐酸酿酒酵母）（Sun等，2023）。表1总结了本研究中使用和通过重组构建的酿酒酵母菌株。使用含1 mg/mL 5-氟乳清酸的固体合成 dropout（SSD）培养基筛选失去选择性标记的工程酵母（Nakazawa等，2016）。限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Ex-Taq DNA聚合酶、Pyrobest™ DNA聚合酶、质粒小提试剂盒、DNA片段纯化试剂盒和SteadyPure DNA凝胶回收试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。基因组DNA和质粒DNA提取试剂盒购自G-biosciences（美国密苏里州圣路易斯）。引物合成、基因合成和Sanger测序由苏州金唯智生物科技有限公司完成。L-乳酸标准品购自北京索莱宝科技有限公司。葡萄糖、甘油、乙醇和蔗糖购自上海国药集团。大豆蛋白胨购自沃凯生物科技有限公司。胰蛋白胨和酵母粉购自OXOID英国生物制品公司。其他常规试剂为进口或国产分析纯试剂。
【数据】菌株：酿酒酵母TAM；筛选剂：5-氟乳清酸（1 mg/mL）；培养基：SSD固体培养基
2.2 重组质粒的构建
基因表达盒的构建基于初始质粒。启动子和终止子区域（TEF1和BLA；TDH3和CYC1）从酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组中扩增。在PY13TEF1质粒上构建新的LDH质粒，在大肠杆菌中表达并通过测序验证（见补充材料）。大肠杆菌培养需要LB培养基，加入葡萄糖（20 g/L）、酵母提取物（5 g/L）、蛋白胨（10 g/L）和NaCl（10 g/L）后用于质粒转化。固体培养基通过添加20 g/L琼脂粉制备。
【数据】质粒骨架：PY13TEF1；LB培养基成分：葡萄糖20 g/L、酵母提取物5 g/L、蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L；琼脂粉：20 g/L
2.3 关键基因的分子操作与表达
引物基于酿酒酵母S288C全基因组设计（见补充材料）。编码L-LDH的异源基因克隆自乳酸乳球菌和凝结芽孢杆菌，编码磷酸果糖激酶（PFK）的基因克隆自大肠杆菌。编码质膜羧酸转运蛋白（ADY2）和乳酸/丙酮酸通透酶（JEN1）的基因通过在基因位点前插入强启动子TEF1实现过表达。采用醋酸锂（LiAc）高效转化法进行基因敲除和表达（Yarimizu等，2017）。随后进行PCR，反应体积为50 μL，扩增条件如下：94°C预变性5分钟，然后进行34个循环的94°C变性30秒、55°C退火60秒、72°C延伸60秒，最后72°C加热7分钟。将PCR获得的基因片段转化至酿酒酵母的设定位置，转化菌株接种在HIS−/LEU−平板上，使用设计的引物验证培养的菌落。通过向Cre质粒添加受体进行标签消除，标签去除后获得的最终菌株仅在YPD平板上生长，不能在HIS−/LEU−平板上生长。
【数据】PCR体系：50 μL；预变性：94°C 5 min；循环数：34；变性：94°C 30 s；退火：55°C 60 s；延伸：72°C 60 s；终延伸：72°C 7 min；转化方法：醋酸锂法；筛选标记：HIS−/LEU−
2.4 摇瓶和补料分批发酵
首先，在5 mL培养管中进行2 mL YPD液体培养基的种子培养，在30°C、220 rpm振荡条件下培养28小时。随后，将30 mL YPD培养基（葡萄糖20 g/L；胰蛋白胨20 g/L；酵母粉10 g/L）加入250 mL摇瓶中进行L-乳酸生产测试。放大发酵在15-L生物反应器中进行。第一步制备种子液：从平板上挑选菌落，接种于含3 mL YPD培养基的试管中，在30°C培养24小时。第二步进行传代培养：吸取约1.5–2 mL一级种子培养液，加入150 mL新鲜YPD培养基中。第三步在15-L生物反应器中进行接种：将二级种子液培养18–36小时后，按10%接种量接种到15 L优化培养基（葡萄糖20 g/L；胰蛋白胨20 g/L；酵母粉10 g/L；大豆蛋白胨25 g/L；K2HPO4 1 g/L；KH2PO4 1 g/L；L-精氨酸374.4 mg/L；L-色氨酸179.3 mg/L；吐温-80 0.5 mL/L；维生素B1 500 mg/L）中进行强化发酵和调控。发酵在30°C、300–800 rpm条件下进行。根据实验要求调节溶解氧（DO）水平。以600 g/L浓度的葡萄糖补料添加至生物反应器中作为碳源补充。葡萄糖浓度维持在15–20 g/L。在存在中和剂的情况下，添加CaCO3作为缓冲剂维持pH为5.8或4.5。根据细胞生长的OD600值和发酵液的残余葡萄糖浓度监测发酵状态。
【数据】种子培养：2 mL YPD、30°C、220 rpm、28 h；摇瓶发酵：30 mL YPD（葡萄糖20 g/L、胰蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L）、250 mL摇瓶；一级种子：3 mL YPD、30°C、24 h；二级种子：1.5–2 mL接种至150 mL YPD；15-L反应器接种：10%接种量、18–36 h；优化培养基：葡萄糖20 g/L、胰蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L、大豆蛋白胨25 g/L、K2HPO4 1 g/L、KH2PO4 1 g/L、L-精氨酸374.4 mg/L、L-色氨酸179.3 mg/L、吐温-80 0.5 mL/L、维生素B1 500 mg/L；发酵条件：30°C、300–800 rpm；补料葡萄糖：600 g/L；维持葡萄糖：15–20 g/L；pH：5.8或4.5（CaCO3）
2.5 分析方法
生长测定：使用Type 721分光光度计在600 nm处测量吸光度。残糖测定方法：使用生物传感器M−100（Sieman）测定发酵液中残余糖浓度。有机酸测定方法：使用高效液相色谱法，采用有机酸柱，流动相为0.05 mol/L H2SO4，流速0.6 mL/min，进样量20 μL，柱温55°C，紫外检测器检测波长为210 nm。
【数据】OD600：Type 721分光光度计；残糖：生物传感器M−100（Sieman）；HPLC条件：有机酸柱、0.05 mol/L H2SO4、0.6 mL/min、20 μL进样、55°C柱温、210 nm检测波长
2.6 统计分析
使用GraphPad Prism 8.0.0和SPSS 26.0软件对数据进行统计分析，所有数值均进行三次独立重复测试。P值<0.05、<0.01和<0.001被认为具有统计学显著性。
【数据】统计软件：GraphPad Prism 8.0.0、SPSS 26.0；重复次数：3；显著性水平：<0.05、<0.01、<0.001
研究结果
3.1 异源表达L-LDH合成L-乳酸
为实现耐酸酿酒酵母TAM菌株中L-乳酸的生物合成，将来自乳酸乳球菌（LacLDH）和凝结芽孢杆菌（BcLDH）的L-LDH基因分别导入酵母细胞，获得TAM-L1和TAM-L2菌株（图1A）。如图1B所示，TAM-L1菌株产生6.20 g/L的L-乳酸，高于TAM-L2菌株（5.78 g/L L-乳酸）。因此，选择TAM-L1菌株作为底盘细胞以进一步增强L-乳酸生产能力。此外，考虑到酵母对生物合成氧的需求通常较低（Mooiman等，2021），后续发酵使用厌氧摇瓶。Cyb2编码L-乳酸细胞色素c氧化还原酶，催化乳酸转化为丙酮酸（Engqvist等，2015）。在TAM-L1菌株中，用LacLDH替换Cyb2以防止L-乳酸转化为丙酮酸，从而促进L-乳酸积累。该工程菌株命名为TAM-L3（TAM-L2ΔCyb2::LacLDH），在三角摇瓶中可产生6.80 g/L L-乳酸；在厌氧摇瓶培养中产量增加至7.76 g/L（图1C）。
【数据】TAM-L1：6.20 g/L L-LA；TAM-L2：5.78 g/L L-LA；TAM-L3（好氧）：6.80 g/L；TAM-L3（厌氧）：7.76 g/L
3.2 丙酮酸分流代谢途径的改造
引入的外源L-乳酸合成途径与乙醇途径存在竞争，因为二者共享胞内丙酮酸和NADH（图1A）。丙酮酸脱羧酶（PDC）和乙醇脱氢酶（ADH）分别催化丙酮酸转化为乙醛和乙醛转化为乙醇（Ke等，2015）。PDC由Pdc1、Pdc5和Pdc6编码的三个高度同源的亚型组成。然而，由于呼吸功能天然被葡萄糖抑制，Pdc1–Pdc5双缺陷菌株在厌氧条件下生长停滞（Ishida等，2006）。因此，本研究使用Cre-loxP系统将Pdc1、Pdc6和Adh1位点替换为LacLDH，在保证菌株生长活性的同时弱化乙醇合成途径并增加L-LDH拷贝数（图2A）。通过分别用LacLDH替换Pdc1和Pdc6，获得TAM-L4（TAM-L3ΔPdc1::LacLDH）和TAM-L5（TAM-L3ΔPdc6::LacLDH）菌株，其L-乳酸产量分别为7.8和8.4 g/L（图2B）。同时用LacLDH替换Pdc1和Pdc6获得TAM-L6菌株（TAM-L3ΔPdc1::LacLDHΔPdc6::LacLDH）。该菌株在摇瓶发酵72小时时L-乳酸产量增加至12.3 g/L（图2C）。此外，敲除Adh1（编码ADH的基因）以阻止乙醛合成乙醇副产物，产生TAM-L7菌株（TAM-L6ΔAdh1），摇瓶发酵72小时后L-乳酸产量增加至22.56 g/L（图2C）。经过上述代谢调控，乙醇合成被成功抑制，从10.58 g/L降至4.28 g/L（图2D）。
【数据】TAM-L4：7.8 g/L；TAM-L5：8.4 g/L；TAM-L6：12.3 g/L（72 h）；TAM-L7：22.56 g/L（72 h）；乙醇：10.58→4.28 g/L
3.3 失活甘油三磷酸脱氢酶（GPD）阻断甘油合成途径
在经典厌氧发酵中，酿酒酵母通过甘油合成途径消耗胞内过量NADH以维持辅因子平衡；然而，该途径副产物甘油的合成和积累降低了L-乳酸的产率（Jiang等，2021）。为弱化竞争途径并防止甘油产生，敲除了编码甘油三磷酸脱氢酶的Gpd1和Gpd2基因。所得Gpd1敲除菌株TAM-L8和Gpd2敲除菌株TAM-L9的L-乳酸产量分别为25.4和25.5 g/L。随后同时敲除Gpd1和Gpd2产生菌株TAM-L10（TAM-L7ΔGpd1ΔGpd2）。在对菌株生长无明显影响的情况下（图3A–B），重组菌株TAM-L10产生的L-乳酸产量增加至29.8 g/L，产率为0.82 g/L/h，是初始耐酸TAM菌株的近30倍（图3C）。
【数据】TAM-L8：25.4 g/L；TAM-L9：25.5 g/L；TAM-L10：29.8 g/L、产率0.82 g/L/h、为初始菌株近30倍
3.4 转运蛋白工程促进L-乳酸合成
scJen1（系统名称YKL217w）最早被发现编码酿酒酵母中的乳酸和丙酮酸通透酶，参与乳酸的胞内转运（Casal等，1999）。然而，有矛盾的报道认为JEN1和ADY2均编码单羧酸转运蛋白，可能用于控制酿酒酵母细胞中的乳酸输出。Ady2编码质膜羧酸转运蛋白，参与乳酸的胞外转运（Pacheco等，2012）。本研究同时进行了Jen1的过表达和敲除实验以进行比较；携带Jen1敲除的菌株命名为TAM-L11（TAM-L10ΔJen1），其L-乳酸产量更高，为34.9 g/L，而过表达Jen1的菌株命名为TAM-L12（TAM-L10::Jen1），90小时产量为23.7 g/L（图4A–B）。这些结果表明，在缺乏葡萄糖的情况下，L-乳酸能够作为碳源重新进入细胞以补充胞内转运。随后，在TAM-L11中过表达Ady2以进一步促进L-乳酸的外排。由此产生的TAM-L13菌株（TAM-L11ΔJen1::Ady2）在摇瓶发酵72小时后L-乳酸产量进一步增加至50.5 g/L（图4C–D）。L-乳酸的转运速率通过高效液相色谱法测定，以发酵培养上清液（U）中测得的L-乳酸滴度与发酵培养破碎液（C）的比值确定。L-乳酸的转运速率从69.3%增加至97.6%，几乎所有L-乳酸都能被转运出去。L-乳酸转运速率的提高表明Jen1和Ady2在L-乳酸的胞内和胞外转运中均发挥特别关键的作用。
【数据】TAM-L11（ΔJen1）：34.9 g/L；TAM-L12（过表达Jen1）：23.7 g/L（90 h）；TAM-L13：50.5 g/L（72 h）；转运速率：69.3%→97.6%
3.5 能量与氧化还原辅因子补偿促进L-乳酸生物合成
在酿酒酵母中，氧化还原辅因子在偶联分解代谢与合成代谢及能量产生中发挥关键作用。根据已有报道，NDE1和NDE2影响产物谱和胞内代谢物水平（Maeda等，2020）。在限氧培养条件下，缺失NADH脱氢酶基因可减少NADH消耗并促进胞质NADH水平升高；此外，在以细胞呼吸为主导的方式下增加了L-乳酸产量。因此，敲除两个参与氧化还原平衡调控的NADH脱氢酶基因（NDE1和NDE2）以重新分配胞质NADH，获得菌株TAM-L14（ΔNDE1）、TAM-L15（ΔNDE2）和TAM-L16（ΔNDE1ΔNDE2），其产量分别为52.4、53.1和63.3 g/L（图5A、5B）。此外，由pfkA编码的磷酸果糖激酶（PFK）催化果糖-6-磷酸转化为果糖-1,6-二磷酸，是Embden-Meyerhof-Parnas（EMP）途径的限速步骤之一；该途径决定了微生物对葡萄糖的有效利用（Tsuge等，2015）。因此，将来自大肠杆菌的果糖-6-磷酸激酶编码基因pfkA在TAM-L16菌株中异源表达，产生TAM-L17（TSL-13ΔNDE1ΔNDE2::pfkA）菌株（图5C）。TAM-L17菌株产生的L-乳酸产量增加至72.7 g/L，84小时内消耗90 g/L葡萄糖，转化率达到0.66 g/g（图5D）。因此，从能量调控的角度来看，pfkA的异源表达促进了L-乳酸的高效合成。
【数据】TAM-L14（ΔNDE1）：52.4 g/L；TAM-L15（ΔNDE2）：53.1 g/L；TAM-L16（ΔNDE1ΔNDE2）：63.3 g/L；TAM-L17：72.7 g/L、消耗葡萄糖90 g/L（84 h）、转化率0.66 g/g
3.6 15-L生物反应器中通过工艺优化实现L-乳酸过量生产
为提高其工业适用性，将TAM-L17菌株在15-L生物反应器中进行生长和发酵，并对其生长条件的四个方面进行优化：种子液培养、溶氧控制、补料控制和pH控制。
【数据】发酵规模：15-L生物反应器；优化方面：种子液培养、溶氧控制、补料控制、pH控制
讨论与解读
本研究以耐酸酿酒酵母TAM为底盘，通过遗传工程优化了酿酒酵母中L-乳酸合成的代谢途径，并调整了发酵条件。获得的耐酸酿酒酵母TAM-L17在15-L生物反应器中、pH 4.5条件下成功实现了高水平的L-乳酸生产，产量达192.3 g/L（产率0.78 g/g）。该研究展示了基于耐酸菌株中代谢工程与发酵调控相结合的策略，有助于探索酿酒酵母生产L-乳酸的潜力。
编译者解读
本研究最值得借鉴之处在于系统性的代谢流逐级优化思路——从引入异源合成途径开始，依次弱化乙醇和甘油竞争途径、改造转运系统、补偿能量与辅因子，每一步都有明确的代谢依据和数据支撑。尤其是不使用中和剂即可在pH 4.5条件下达到192.3 g/L的产量，显著降低了下游纯化成本，这对工业化生产极具吸引力。值得注意的是，作者选择耐酸TAM菌株而非实验室常用菌株作为底盘，体现了菌株背景对极端发酵条件适应性的重要性。局限在于15-L规模与工业生产仍有差距，且发酵过程中渗透压和产物抑制等问题在更大规模下可能更加突出。
参考来源
Liu T. Combinatorial metabolic engineering and process optimization enables highly efficient production of L-lactic acid by acid-tolerant Saccharomyces cerevisiae. Bioresource Technology, 2023.
DOI: 10.1016/j.biortech.2023.129023
DOI: 10.1016/j.biortech.2023.129023