来源：Rational spatial rewiring of key enzymes enhances α-santalene production in Saccharomyces cerevisiae（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
真核细胞工厂的空间区室化常限制代谢通路效率。本研究系统定位了酿酒酵母α-檀香烯生物合成途径中九个核心酶的亚细胞分布，发现核与内质网定位造成的代谢瓶颈。通过生信指导的HMG1截短实现内质网释放、核输出信号（NES）标记关键酶、启动子工程下调ERG9、额外拷贝整合过表达IDI1与ERG20，以及培养基优化提升细胞渗透耐受性，最终在补料分批发酵中实现α-檀香烯滴度568.59 mg/L，较基线菌株提高132倍。
研究背景
萜类化合物结构多样，具有抗癌、抗炎、抗菌等生物活性，在医药、化妆品和食品工业中价值显著。α-檀香烯是檀香精油的主要倍半萜成分，经单加氧反应可转化为檀香醇——檀香油的核心生物活性物质，商业价值极高。传统檀香精油依赖印度檀香心材和根部的水蒸气蒸馏提取，但檀香树生长缓慢、生态要求苛刻，加之过度采伐和气候变化，供应与可持续性严重受限。微生物细胞工厂因生长快、生态足迹小、遗传可操作性强而成为有前景的替代方案。合成生物学的进展已推动微生物代谢通路设计与重构，然而真核细胞内的空间区室化——酶被物理分隔于不同细胞器——常常限制代谢效率。本研究针对酿酒酵母中α-檀香烯合成途径的空间组织进行系统性工程改造。
研究方法
2.1 菌株、培养基与培养条件
大肠杆菌DH5α用于质粒构建与扩增，在LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl，必要时添加20 g/L琼脂固化）中培养，添加100 mg/L氨苄青霉素，温度37°C，转速220 rpm。酿酒酵母BY4742在YPD培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L葡萄糖、20 g/L蛋白胨，必要时添加20 g/L琼脂）中培养，温度30°C，转速220 rpm。筛选使用SD缺陷型平板（SD-尿嘧啶、SD-亮氨酸、SD-组氨酸、SD-赖氨酸），配方为6.7 g/L不含氨基酸的酵母氮源碱、20 g/L葡萄糖、20 g/L琼脂，补充除对应缺陷氨基酸外的氨基酸：尿嘧啶40 mg/L、赖氨酸30 mg/L、腺嘌呤30 mg/L、甲硫氨酸30 mg/L、组氨酸40 mg/L、亮氨酸100 mg/L、色氨酸100 mg/L。YPD-Gal培养基含10 g/L酵母提取物、2 g/L葡萄糖、18 g/L半乳糖、20 g/L蛋白胨。SMD培养基含6.7 g/L不含氨基酸的酵母氮源碱、20 g/L葡萄糖、15 g/L琼脂，氨基酸补充同上。发酵培养基含10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、5 g/L硫酸铵、20 g/L半乳糖、10 g/L葡萄糖、2.5 mM甜菜碱。补料培养基含10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、5 g/L硫酸铵、200 g/L葡萄糖。
【数据】菌株：E. coli DH5α、S. cerevisiae BY4742；培养基：LB、YPD、SD缺陷型、YPD-Gal、SMD、发酵培养基、补料培养基；温度：37°C（大肠杆菌）、30°C（酵母）；转速：220 rpm；氨苄青霉素：100 mg/L
2.2 质粒构建
高保真PCR扩增使用Q5® High-Fidelity 2× Master Mix（New England Biolabs）。酵母基因从S. cerevisiae BY4742基因组DNA扩增，PCR产物用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit（Vazyme）纯化。所有异源基因由GenScript合成。质粒pBS406-ERG8-GFP、pBS406-ERG10-GFP、pBS406-ERG12-GFP、pBS406-ERG20-GFP、pBS406-IDI1-GFP、pBS406-HMG1-GFP、pBS405-GAL1-SanSyn-GFP-tADH1通过Golden Gate组装法构建（Engler et al., 2008）。其余质粒通过Gibson组装法构建（Gibson, 2011）。Golden Gate和Gibson组装分别使用NEBridge® Golden Gate Assembly Kit（BsaI-HF® v2, NEB）和ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit（Vazyme）。重组质粒转化至E. coli DH5α，经PCR和Sanger测序验证。确认正确的构建体保存于−80°C。
【数据】PCR酶：Q5® High-Fidelity 2× Master Mix；组装试剂盒：NEBridge® Golden Gate Assembly Kit (BsaI-HF® v2)、ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit；保存温度：−80°C
2.3 利用CRISPR-Cas9或同源重组构建菌株
工程酵母菌株采用CRISPR-Cas9基因组编辑系统（DiCarlo et al., 2013）或同源重组（Rothstein, 1991）构建。酵母转化采用醋酸锂/单链DNA法（Gietz & Schiestl, 2007）。阳性转化子在相应缺陷培养基或含抗生素培养基上筛选。亚细胞定位质粒通过将酿酒酵母密码子优化的GFP基因经柔性GGGS连接肽融合至各目标酶C端构建。线性化质粒通过同源重组整合至S. cerevisiae BY4742基因组的启动子区域。基于CRISPR-Cas9的方案中，质粒pCas9 + delta-gRNA与线性化供体DNA共转化至酵母细胞，涂布于抗生素抗性或营养缺陷互补的选择性培养基。sgRNA的spacer序列使用Benchling设计。为消除pCas9 + delta-gRNA质粒，转化子在液体YPD培养基中培养12 h，梯度稀释后涂板。挑取单菌落至10 μL无菌ddH₂O中，取1–2 μL点样于URA选择性平板。在URA选择平板上不能生长的菌落视为已成功丢失pCas9 + gRNA质粒。为构建生产菌株，将S0至S4表达盒与pCas9 + delta-gRNA共转化至BY4742，生成工程菌株SBYS0、SBYS1、SBYS2、SBYS3和SBYS4。随后，A1和A2表达盒通过同源重组导入SBYS3和SBYS4，获得菌株SBYS3-A1、SBYS3-A2、SBYS4-A1和SBYS4-A2。进一步将B1和B2表达盒转化至SBYS4-A1和SBYS4-A2，构建菌株SBYS4-A1-B1、SBYS4-A1-B2、SBYS4-A2-B1和SBYS4-A2-B2。最后，R表达盒独立整合至上述各菌株，获得最终工程菌株：SBYS4-A1-B1-R、SBYS4-A1-B2-R、SBYS4-A2-B1-R和SBYS4-A2-B2-R。
【数据】转化方法：醋酸锂/单链DNA法；质粒消除培养：YPD液体培养基12 h；点样量：1–2 μL于10 μL ddH₂O中
2.4 荧光显微镜与图像处理
挑取单个酵母菌落接种至8 mL YPD（需半乳糖诱导的菌株用YPD-Gal），30°C、220 rpm过夜培养。将过夜培养物稀释至初始OD600约0.2，重新培养至OD600≈0.7。随后取2 mL培养物，5000 rpm离心2 min，用2 mL SMD培养基重悬。取300 μL细胞悬液加至ConA包被的盖玻片上，孵育5 min使细胞附着。荧光成像使用OLYMPUS IX83全自动荧光显微镜，图像用ImageJ（Version 1.54k）处理（Schneider et al., 2012）。
【数据】初始OD600：约0.2；收获OD600：≈0.7；离心：5000 rpm、2 min；细胞悬液：300 μL；孵育：5 min；显微镜：OLYMPUS IX83
2.5 酵母摇瓶培养与α-檀香烯提取
阳性转化子接种至5 mL YPD，30°C、200 rpm培养24 h。取1 mL转接至250 mL摇瓶中的50 mL YPD-Gal培养基，相同条件下培养24 h。随后加入10%（v/v）正十二烷（5 mL），继续发酵3–4天。发酵结束后，取10 mL培养物室温5000 rpm离心5 min，提取正十二烷层，用正己烷稀释，Na₂SO₄脱水，0.22 μm尼龙膜过滤，GC–MS分析。
【数据】种子培养：5 mL YPD、24 h、30°C、200 rpm；转接量：1 mL至50 mL YPD-Gal；正十二烷：10%（v/v）、5 mL；发酵时间：3–4天；离心：5000 rpm、5 min、室温；滤膜：0.22 μm尼龙膜
2.6 GC–MS定量
使用Agilent GC-7890B联用MS-5977B，HP-5MS毛细管柱，选择离子监测（SIM）模式。条件：进样口温度250°C，离子源温度250°C，电子能量70 eV，溶剂延迟10 min。程序升温：40°C保持3 min，以10°C/min升至130°C，再以2°C/min升至180°C，再以50°C/min升至300°C，保持10 min。质量范围：m/z 40–500；SIM离子：93、94、105、107、119、122、202。以β-石竹烯为外标定量α-檀香烯。
【数据】进样口温度：250°C；离子源温度：250°C；电子能量：70 eV；溶剂延迟：10 min；SIM离子：93, 94, 105, 107, 119, 122, 202；外标：β-石竹烯
2.7 标准曲线
称取β-石竹烯4 mg，溶于正己烷制备10 mL储备液（400 mg/L）。将储备液梯度稀释，制备100、50、25、5、1 mg/L的标准品。GC–MS分析定量，积分色谱峰面积生成标准曲线。
【数据】储备液浓度：400 mg/L；标准品浓度：100、50、25、5、1 mg/L
2.8 补料分批发酵
挑取单菌落接种至10 mL YPD培养基，30°C、220 rpm振荡培养24 h。将两份种子培养物合并，以10%（v/v）接种量接种至1 L摇瓶中的200 mL发酵培养基。相同条件下再培养24 h后，将全部培养物转移至含2 L新鲜发酵培养基的5 L发酵罐中。发酵温度30°C，pH用NH₄OH自动调节维持在5.0–5.5之间。溶氧（DO）通过调节搅拌速度（300–450 rpm）控制在30%，通气速率2–3 L/min。定期监测葡萄糖浓度和细胞密度（OD600）。分批培养24 h后启动连续葡萄糖补料策略，补料速率根据实时残余葡萄糖测量动态调整，维持低葡萄糖水平以避免乙醇积累。48 h时加入半乳糖（60 g）诱导GAL启动子表达，同时加入250 mL正十二烷作为原位萃取剂，终止葡萄糖补料。发酵持续至144 h。在指定时间点收集有机相样品，离心去除细胞碎片，稀释后进行分析。
【数据】种子培养：10 mL YPD、24 h、30°C、220 rpm；接种量：10%（v/v）；发酵罐：5 L，装液量2 L；温度：30°C；pH：5.0–5.5（NH₄OH自动调节）；DO：30%；搅拌：300–450 rpm；通气：2–3 L/min；半乳糖：60 g；正十二烷：250 mL；发酵总时间：144 h
研究结果
3.1 α-檀香烯生物合成途径关键酶的亚细胞定位谱
α-檀香烯由法尼基焦磷酸（FPP）环化合成。FPP是15碳中间体，源自酿酒酵母的甲羟戊酸（MVA）途径。该途径中，一分子二甲基烯丙基焦磷酸（DMAPP）与两分子异戊烯基焦磷酸（IPP）依次缩合形成FPP——倍半萜的直接前体（图1A）。FPP可被檀香烯合酶转化为α-檀香烯。为在S. cerevisiae BY4742中启动α-檀香烯的异源生产，我们使用基于CRISPR-Cas9的基因组编辑方法（DiCarlo et al., 2013），将黄皮（Clausena lansium）檀香烯合酶基因（SanSyn）（Schalk, 2013）整合至其基因组δ位点（图1B），由半乳糖诱导型GAL1启动子控制，获得基线菌株SBYS0（除非特别说明，本研究所有产量比较均以SBYS0为参照组），该菌株在半乳糖诱导后产生4.29 mg/L α-檀香烯（图1C）。
为系统提升α-檀香烯产量，我们创新性地将关键酶重新定位与模块化代谢工程策略——基因过表达、通量重定向、培养基优化和放大发酵——相结合。鉴于亚细胞定位对代谢通量具有关键影响，我们首先利用GFP标记蛋白结合荧光显微镜，系统绘制了α-檀香烯生物合成途径中九个关键酶的亚细胞分布图谱。定位模式依据与细胞器特异性标记物的比较进行判定（Zhu et al., 2019）。如图2A所示，ERG8、ERG12、ERG19、ERG20、IDI1和SanSyn主要定位于细胞质，而ERG10和ERG13明显局限于细胞核。值得注意的是，限速酶HMG1（Bröker et al., 2018; Meng et al., 2020）呈现内质网膜定位，提示其可能面临内质网膜屏障造成的可及性限制和通量瓶颈。
【数据】基线菌株SBYS0产量：4.29 mg/L α-檀香烯；定位：ERG8/ERG12/ERG19/ERG20/IDI1/SanSyn为细胞质，ERG10/ERG13为细胞核，HMG1为内质网膜
3.2 HMG1的理性设计与空间重编程
为解决这一问题，我们设计了一种截短型HMG1变体，将酶重新定位至细胞质。利用跨膜结构域预测软件（TMHMM-2.0）（Moller et al., 2001），我们确定第522位氨基酸为潜在截短位点，获得细胞质变体，命名为522tHMG1（图S2A和S2C）。GFP融合显微镜验证其成功重定位至细胞质（图2B）。尽管表达522tHMG1的菌株SBYS2（图3A）的α-檀香烯产量有所提高（14.52 mg/L）（图3B），但提升幅度有限，表明实验验证的必要性。使用另一种预测算法（DeepTMHMM）（Hallgren et al., 2022）进一步评估显示截短位点存在微小差异（第520位对第522位），说明预测本身具有内在不确定性。
随后我们测试了文献中仅有的两个截短变体：531tHMG1（Polakowski et al., 1998）和AA531tHMG1（Donald et al., 1997）。值得注意的是，表达531tHMG1的菌株（SBYS4）实现了显著更高的产量（26.05 mg/L），证明微小的氨基酸差异可对催化性能产生关键影响（图3B）。这些发现不仅与此前报道一致（Meng et al., 2020; Polakowski et al., 1998），还揭示了酶截短的复杂性和情境依赖性，强调了经验验证的价值。531tHMG1变体的优越性能与此前关于HMG1胞质表达增强代谢通量的报道相符（Polakowski et al., 1998）。重要的是，我们最初尝试的522tHMG1凸显了生物信息学预测需经实验验证的重要性，也表明文献来源的变体未必能直接适用于不同的代谢情境。
【数据】522tHMG1菌株SBYS2产量：14.52 mg/L；531tHMG1菌株SBYS4产量：26.05 mg/L；截短位点：522（TMHMM-2.0预测）、520（DeepTMHMM预测）、531（文献报道）
3.3 ERG13空间重塑联合IDI1共过表达与DPP1破坏增强α-檀香烯滴度
HMG1成功重定位后，我们进一步探究将两个核定位酶ERG13和ERG10重定位至细胞质是否能进一步增强MVA途径的代谢通量。我们将每个酶与源自酵母Nmd3的核输出信号（NES）（Gadal et al., 2001）融合，通过荧光显微镜确认了亚细胞重定位（图2C）。基于两个表现优异的携带HMG1截短变体的菌株（SBYS3和SBYS4），我们构建了额外表达盒，实现IDI1与天然ERG13或ERG13-NES的共过表达。这些表达盒基因组整合至DPP1位点——二酰甘油焦磷酸磷酸酶编码基因，该位点破坏可减少竞争性FPP水解（图4A）。RT-qPCR证实，SBYS4-A1和SBYS4-A2中IDI1的相对mRNA水平均比亲本菌株SBYS4高10倍以上（图4C）。
功能上，IDI1与细胞质ERG13-NES及531tHMG1的共过表达（菌株SBYS4-A2）将α-檀香烯滴度显著提升至56.16 mg/L，几乎是其天然ERG13对应菌株SBYS4-A1的两倍（图4B）。在SBYS3背景菌株中也观察到类似趋势，但总体滴度低于SBYS4衍生菌株。这些结果表明空间酶协同和策略性染色体整合对最大化代谢通量和产物产量均至关重要（图4B）。
【数据】SBYS4-A2产量：56.16 mg/L；IDI1 mRNA水平：较SBYS4提高>10倍；整合位点：DPP1
3.4 ERG10空间重塑联合ERG20过表达、LPP1破坏与ERG9下调进一步推高α-檀香烯滴度
为进一步增加FPP供应，我们引入了编码ERG20与天然ERG10或ERG10-NES的额外表达盒，整合至LPP1位点——另一个二酰甘油焦磷酸磷酸酶，其破坏同样可限制竞争性FPP水解，同时允许额外拷贝整合（图5A）。与设计一致，RT-qPCR分析证实工程菌株中ERG20 mRNA水平显著提高15倍以上（图5E）。出乎意料的是，ERG20过表达与空间重塑的ERG10组合并未立即改善α-檀香烯滴度，某些情况下甚至降低了产量（图5B），这可能是由于增强的FPP通量经角鲨烯合酶（ERG9）流向甾醇生物合成。
为缓解这一竞争性消耗，我们将天然ERG9启动子替换为较弱的葡萄糖诱导型启动子（pHXT1）（Lewis & Bisson, 1991），从而削弱ERG9表达，限制FPP向角鲨烯的转化（图5C）。RT-qPCR进一步证实启动子替换后ERG9转录本丰度显著降低（图5E）。值得注意的是，ERG20过表达仅在ERG9启动子减弱后才对有效的通量重定向发挥关键作用。这一组合策略在菌株SBYS4-A1-B2-R（表达ERG10-NES、天然ERG13、截短531tHMG1、ERG20过表达和pHXT1驱动的ERG9）中实现了α-檀香烯滴度的巨大提升，达到199.41 mg/L，较基线菌株SBYS0提高近50倍（图1C和图5D）。有趣的是，最优产量在ERG10定位于细胞质而ERG13保留于细胞核时获得，表明实现平衡的代谢通道化需要非直观的空间酶分配。
【数据】ERG20 mRNA水平：提高>15倍；SBYS4-A1-B2-R产量：199.41 mg/L；较SBYS0提高：近50倍；整合位点：LPP1；ERG9启动子：pHXT1
3.5 培养基优化与放大发酵实现工业相关滴度
为进一步提升α-檀香烯产量，我们以最优菌株SBYS4-A1-B2-R为对象，评估了培养基补充物（用于维持细胞渗透压）和通气方式，优化发酵条件。首先测试了甘油补充（5 g/L和10 g/L）以及将摇瓶封口膜替换为纱布覆盖。这些改变分别产生可忽略或适度的改善（图6A）。随后测试了五种浓度的甜菜碱补充（图6B）：添加0.5 mM、1 mM、2.5 mM、5 mM和10 mM甜菜碱。其中2.5 mM甜菜碱效果最佳，α-檀香烯滴度达到255.23 mg/L。在5 L生物反应器中进行的补料分批发酵中，采用优化培养基（含2.5 mM甜菜碱）和两阶段葡萄糖补料策略（维持低葡萄糖水平以避免乙醇积累），最终α-檀香烯滴度达到568.59 mg/L（图6C），较基线菌株SBYS0提高132倍。
【数据】甘油：5 g/L、10 g/L；甜菜碱浓度：0.5、1、2.5、5、10 mM；最优甜菜碱：2.5 mM，滴度255.23 mg/L；补料分批发酵最终滴度：568.59 mg/L；较SBYS0提高：132倍
讨论与解读
倍半萜类化合物如α-檀香烯及其氧化衍生物α-檀香醇在制药、香精和化妆品领域应用广泛。由于从檀香树天然提取的可用性和可持续性问题，微生物生物合成成为有吸引力的替代方案。尽管α-檀香烯生物合成此前已在酿酒酵母中重构，但实现工业相关产量仍具挑战。本研究通过系统的酶定位工程、基因表达优化、通量重定向和发酵条件优化，实现了α-檀香烯生物合成的显著提升。
真核生物（如酵母）中的亚细胞区室化常通过物理分离途径酶而限制代谢效率。此前研究表明，缩短酶间空间距离可显著改善代谢通量和产物产量（Geraldi et al., 2021）。本研究揭示了ERG10和ERG13的天然核定位是MVA途径早期的潜在瓶颈。令人意外的是，将两种酶均重定位至细胞质并非最优方案；最大α-檀香烯产量需要平衡的空间排布——ERG10在细胞质而ERG13保留在细胞核。这一反直觉的发现表明，乙酰辅酶A的高效通道化可能依赖于特定的空间分隔模式，而非简单的共定位。
【编译者解读】该研究最值得借鉴之处在于将"空间工程"从概念推向了可操作的方法论——先系统定位瓶颈，再理性设计重定位方案，且每一步都辅以实验验证。生信预测的522位截短与文献报道的531位截短效果差异显著，这一对比生动说明了计算预测的局限与经验验证的不可替代。最终132倍的产量提升来自多种策略的协同叠加，而非单一改造。局限在于策略组合的普适性仍需在更多萜类产物和其他酵母宿主中验证，空间工程与代谢改造的协同机制也值得更深入的定量解析。
参考来源
Tan W. Rational spatial rewiring of key enzymes enhances α-santalene production in Saccharomyces cerevisiae. Bioresource Technology, 2025. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.133027
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.133027