来源：Engineering Saccharomyces cerevisiae for high-efficient production of ursolic acid via cofactor engineering and acetyl-CoA optimization（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
熊果酸是一种具有多种药理活性的植物源五环三萜化合物，其微生物异源合成效率长期受限于关键酶活性不足及内源代谢与异源途径的失衡。本研究从枇杷中筛选到CYP450酶Ej8656，并与百脉根来源的LjCPR还原酶组合，在酿酒酵母中实现了熊果酸从头合成。通过乙酰辅酶A供给优化与NADH/NADPH辅因子平衡的联合工程策略，最终在5 L发酵罐中使熊果酸产量达到2.33 g/L，为目前酿酒酵母中报道的最高产量。
研究背景
萜类化合物是一类广泛分布于自然界、尤其在植物中丰富的次级代谢产物。熊果酸属于五环三萜类化合物，存在于女贞、积雪草、苹果等多种植物中，具有抗氧化、抗炎、抗癌及保肝等重要药理活性，已广泛应用于医药和化妆品领域。目前熊果酸主要依赖植物提取获得，但该方法受限于耕地资源，且可能引发生态环境问题。同时，提取浓度和效率过低，难以满足市场需求。因此，开发替代性获取途径迫在眉睫。
随着代谢工程和合成生物学的快速发展，越来越多的天然产物已在微生物中成功合成。酿酒酵母因其内源甲羟戊酸（MVA）途径完善、蛋白表达与翻译后修饰系统健全等优势，成为植物三萜微生物合成最常用的宿主。然而，熊果酸的微生物合成产量仍然偏低，关键酶CYP450催化效率低以及内源代谢与异源途径之间的失衡被认为是核心瓶颈。
研究方法
2.1 菌株与培养基
本研究所用菌株和质粒见表1。酿酒酵母菌株HUT为前期构建的α-香树脂醇生产菌株，作为本研究的亲本菌株。酵母菌株HUT在2x SD培养基中培养，配方为：13.4 g/L无氨基酸酵母氮源、40 g/L葡萄糖、1.6 g/L dropout氨基酸混合物和100 mg/L亮氨酸。1x SD培养基含6.7 g/L无氨基酸酵母氮源、20 g/L葡萄糖、0.8 g/L dropout氨基酸混合物。2x、3x、4x和5x SD培养基配方按上述配方分别乘以2、3、4和5。大肠杆菌TOP10用于重组质粒构建，在LB培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）中培养。需要时，向培养基中加入氨苄青霉素（100 mg/L）筛选大肠杆菌，加入G418（200 mg/L）或/和Zeocin（100 mg/L）筛选酿酒酵母。
【数据】菌株：酿酒酵母HUT、大肠杆菌TOP10；培养基：2x SD（13.4 g/L无氨基酸酵母氮源、40 g/L葡萄糖、1.6 g/L dropout混合物、100 mg/L亮氨酸）、LB（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）；抗生素：氨苄青霉素100 mg/L、G418 200 mg/L、Zeocin 100 mg/L
2.2 基因表达诱导与摇瓶培养
携带含GAL1/10启动子重组质粒的菌株，在100 mL摇瓶中的10 mL 2x SD培养基（含40 g/L葡萄糖）中培养2天，摇床维持200 rpm、30°C。收集全部酵母细胞（10 mL），离心后用ddH₂O洗涤，重悬于100 mL摇瓶中的10 mL 2x SD培养基（含40 g/L半乳糖），在摇床中维持200 rpm、30°C培养三天。
【数据】培养体积：10 mL；培养基：2x SD（40 g/L葡萄糖/40 g/L半乳糖）；温度：30°C；转速：200 rpm；时间：2天（葡萄糖）/3天（半乳糖）
2.3 酵母DNA转化与重组质粒构建
所有酵母菌株采用标准醋酸锂酵母转化方案进行转化。酵母转化子在含有不同营养缺陷标记和抗生素的培养基上筛选。编码乙酰辅酶A合酶（ACS1/ACS2）、乙醇脱氢酶（ADH2）、乙醛脱氢酶（ALD6）、异柠檬酸脱氢酶（IDP2）、苹果酸脱氢酶（MAE1）、线粒体丙酮酸载体系统（MPC2）、线粒体孔蛋白（POR2）和柠檬酸合酶（CIT2）的基因分别从酿酒酵母BY4742基因组中克隆。细胞色素P450还原酶MtCPR（来自蒺藜苜蓿）、GuCPR（来自甘草）和LjCPR（来自百脉根）分别来源于实验室菌株UA-E-04、UA-E-08和UA-E-06。来自大肠杆菌的乙醛脱氢酶基因（eutE）通过聚合酶链式反应（PCR）获得。编码CYP450酶（Ej8656、Ej0158、Ej1409、Gt0985）的基因来自枇杷和三叶吉莉亚，乙醛脱氢酶（ADA）来自玉米迪基氏菌，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GaPC）来自乳酸克鲁维酵母，NADH依赖性HMG-CoA还原酶变体（NADH-HMGR）来自嗜硅菌，均由Azenta（中国苏州）合成。基因表达盒通过Gibson组装策略组装，并通过同源重组整合到质粒或基因组中。对于MPC2、POR2和CIT2缺失的工程菌株，将基因表达盒PTEF1-BleoR-TCYC1整合到相应基因座并替换目标敲除基因。本研究所用质粒和菌株汇总于表1。所有设计的表达盒见补充图S3和S4。所有对照菌株均携带相应的空质粒，与进一步改造的菌株相对应。
【数据】基因来源：酿酒酵母BY4742基因组、大肠杆菌、枇杷、三叶吉莉亚、玉米迪基氏菌、乳酸克鲁维酵母、嗜硅菌；合成服务商：Azenta（苏州）；组装方法：Gibson组装；转化方法：醋酸锂法；筛选标记：PTEF1-BleoR-TCYC1
2.4 乙酰辅酶A浓度及NAD(P)H/NAD(P)+比值测定
使用乙酰辅酶A检测试剂盒（Solarbio，北京）和NAD(P)H/NAD(P)+定量试剂盒（Solarbio，北京）分别测定乙酰辅酶A和氧化还原辅因子。发酵四天后，通过离心（12000g，2 min）收集酵母细胞，在提取缓冲液中超声破碎以释放胞内代谢物。离心后，按照制造商提供的说明书分析上清液。
【数据】离心：12000g、2 min；发酵时间：4天；检测试剂盒：Solarbio乙酰辅酶A检测试剂盒、Solarbio NAD(P)H/NAD(P)+定量试剂盒
2.5 补料分批发酵
酵母单菌落在试管中培养24小时制备初级种子液。随后将初级种子液转入500 mL摇瓶中的SD培养基中进一步培养。当菌株生长进入对数生长期后，将10%（体积/体积）的种子培养物接种到含2.4 L培养基的5 L生物反应器中，培养基配方为：60 g/L葡萄糖、20.1 g/L无氨基酸酵母氮碱、2.4 g/L dropout氨基酸混合物、0.72 g/L ZnSO₄·7H₂O、3 g/L MgSO₄、8 g/L KH₂PO₄、10 mL/L微量元素溶液、12 mL/L维生素溶液。碳源补料由葡萄糖、D-(+)-半乳糖和乙醇组成。发酵过程中，在细胞快速生长阶段向培养基补加500 g/L葡萄糖、13.4 g/L无氨基酸酵母氮碱、1.6 g/L dropout氨基酸混合物、9 g/L KH₂PO₄、3.5 g/L K₂SO₄、2.5 g/L MgSO₄、0.28 g/L Na₂SO₄、10 mL/L微量元素溶液和12 mL/L维生素溶液。第二阶段，以D-(+)-半乳糖和乙醇替代葡萄糖，用于熊果酸积累。该阶段在葡萄糖耗尽后通过添加半乳糖诱导α-香树脂醇合酶和CYP450酶的表达。在发酵40小时时向培养基中添加半乳糖，初始浓度为60 g/L。随后每24小时向生物反应器补充50 mL 600 g/L半乳糖溶液。乙醇在培养48小时后于补料分批发酵过程中添加。乙醇补加速率维持在12 mL/25 min。培养基中乙醇浓度控制在5 g/L以下。系统发酵温度维持在30°C。使用25%（w/v）氢氧化铵维持pH为5.5。生物反应器搅拌级联（300–800 rpm）自动控制，通气速率为3.0 vvm，以维持溶解氧浓度在饱和度的30%以上。向培养基中添加G418（200 mg/L）和Zeocin（100 mg/L），以避免补料分批发酵中因无抗性培养基中质粒丢失而导致的熊果酸产量下降。
【数据】接种量：10%（体积/体积）；反应器：5 L生物反应器，装液量2.4 L；初始培养基：60 g/L葡萄糖、20.1 g/L无氨基酸酵母氮碱、2.4 g/L dropout混合物、0.72 g/L ZnSO₄·7H₂O、3 g/L MgSO₄、8 g/L KH₂PO₄、10 mL/L微量元素、12 mL/L维生素；补料培养基：500 g/L葡萄糖、13.4 g/L无氨基酸酵母氮碱、1.6 g/L dropout混合物、9 g/L KH₂PO₄、3.5 g/L K₂SO₄、2.5 g/L MgSO₄、0.28 g/L Na₂SO₄、10 mL/L微量元素、12 mL/L维生素；半乳糖诱导：40 h、初始60 g/L、每24 h补600 g/L半乳糖溶液50 mL；乙醇补加速率：12 mL/25 min，浓度<5 g/L；温度：30°C；pH：5.5（25% w/v氢氧化铵）；通气：3.0 vvm；搅拌：300–800 rpm；溶解氧>30%饱和度；抗生素：G418 200 mg/L、Zeocin 100 mg/L
2.6 熊果酸提取与GC-MS代谢物分析
培养结束后，取200 μL发酵液，加入500 μL饱和氯化钠溶液和直径0.45–0.55 mm的玻璃珠，破碎40 min。涡旋振荡10 min后用乙酸乙酯萃取代谢物。收集乙酸乙酯相并蒸发至干。样品用吡啶和N-甲基-N（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺在80°C下衍生化35 min，然后进行GC-MS分析。GC-MS分析程序如下：进样温度250°C。载气氦气流量1.0 mL/min，进样口温度300°C，进样量1 μL。分流比1:30。GC程序设定如下：起始温度80°C，以20°C/min的速率升至320°C，维持28 min。MS扫描范围为45–750 m/z。
【数据】样品量：200 μL发酵液；饱和氯化钠：500 μL；玻璃珠直径：0.45–0.55 mm；破碎时间：40 min；萃取：乙酸乙酯、涡旋振荡10 min；衍生化：吡啶+N-甲基-N（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺、80°C、35 min；GC-MS参数：进样温度250°C、氦气1.0 mL/min、进样口300°C、进样量1 μL、分流比1:30、程序80°C→320°C（20°C/min）、维持28 min；MS扫描范围：45–750 m/z
研究结果
3.1 通过关键酶CYP450和CPR的筛选与表征实现熊果酸在酿酒酵母中的从头合成
在前期研究中，我们通过引入α-香树脂醇合酶构建了合成α-香树脂醇的工程酿酒酵母，获得菌株HUT。要在酿酒酵母中合成熊果酸，需要CYP450及其相应的CPR，它们将催化从α-香树脂醇到熊果酸的三步氧化反应（图1）。关于CYP450，已有报道表明熊果酸能在枇杷和三叶吉莉亚中积累，提示这两个物种可能含有参与熊果酸合成的潜在CYP450。因此，本研究选取了来自枇杷的3个CYP450（Ej8656、Ej0158和Ej1409）和来自三叶吉莉亚的1个CYP450（Gt0985）进行酵母中的功能表征。此外，采用来自不同生物体的多个具有不同氧化功能的CYP450构建了无根系统发育树（图S1）。获得的CYP450无根系统发育树（图S1）显示，这4个候选CYP450与CYP716A175（C-28氧化）高度相关，可能具有相同的熊果酸合成能力。因此，本研究选择这4个CYP450进行进一步验证。关于CPR，还考察了来自不同植物的多种CPR的进化关系（图S1）。MtCPR和GuCPR已被报道用于齐墩果酸和甘草次酸的合成。相反，LjCPR在无根系统发育树中与MtCPR和GuCPR的亲缘关系较低，这可能更适合本研究选择的CYP450候选酶。因此，本研究使用这3种CPR进行熊果酸的从头合成和进一步优化。
首先验证CYP450的功能。采用高效合成齐墩果酸的最佳CPR——细胞色素P450还原酶MtCPR1进行CYP450筛选。为表达所选熊果酸合成酶，构建了重组质粒pRS415-Ej8656-MtCPR、pRS415-Ej0158-MtCPR、pRS415-Gt0985-MtCPR和pRS415-Ej1409-MtCPR。每个重组质粒在GAL启动子下分别携带编码CYP450和CPR的基因（图2C）。随后将构建的质粒转化到高产α-香树脂醇的酿酒酵母HUT中，分别形成携带Ej8656的工程菌株WN1、携带Ej0158的WN2、携带Gt0985的WN3和携带Ej1409的WN4（表1）。培养五天后，收集发酵液并进行提取操作。所有提取样品均使用GC-MS检测。GC-MS分析显示，仅在工程菌株WN1中检测到熊果酸，证明Ej8656和MtCPR1在酵母中成功实现功能化（图2A）。表达其他P450酶的菌株未产生可检测的熊果酸，未用于后续实验。
由于异源基因的引入可能对宿主菌株造成代谢压力，异源蛋白的数量应进行优化。因此，本研究对CYP450表达的质粒载体进行了优化。采用多拷贝质粒pRS42K和单拷贝质粒pRS415两种质粒进行酶表达。将编码Ej8656和MtCPR1的基因分别插入pRS42K和pRS415，并转化到宿主菌株酿酒酵母HUT中，获得工程菌株WN5和WN1。令人意外的是，携带多拷贝质粒的WN5中未积累熊果酸。相反，携带单拷贝质粒、表达Ej8656和MtCPR1的工程菌株WN1合成了熊果酸，产量为33.0 mg/L（图S2）。更有趣的是，在提高CYP450与CPR之间的兼容性后，工程菌株WN1的生物量较HUT大幅提高（图S2）。这些结果表明，单拷贝质粒pRS415更适合Ej8656和MtCPR的表达。
CPR是许多植物来源CYP450发挥功能所需的相应还原酶，在熊果酸合成中发挥重要作用。已有报道表明，CYP450与不同CPR偶联时可能具有不同的催化效率。因此，另外两种CPR——来自甘草的GuCPR和来自百脉根的LjCPR——被用于与Ej8656偶联，以筛选更适合熊果酸生产的CPR。携带GuCPR和LjCPR的菌株分别命名为WN6和WN7（图2C）。与MtCPR1相比，携带来自百脉根的LjCPR的WN7产量最高，表明其与Ej8656的兼容性更好。结果显示，WN6和WN7中熊果酸的产量分别为39.0 mg/L和43.0 mg/L（图2B）。
尽管在采用筛选的CYP450后，熊果酸产量达到43.0 mg/L，这已是摇瓶中的最高产量，但产量仍然很低。前期研究中已使用传统的代谢工程方法如提高角鲨烯供给，产量确实有所提高。然而，在途径调控后很难进一步提高产量。基于对熊果酸合成途径和内源代谢的分析，瓶颈之一可归因于乙酰辅酶A和辅因子（如NADH/NADPH）的需求与供给不平衡。要解决这一问题，调控乙酰辅酶A和辅因子的供给至关重要。
【数据】菌株：WN1（Ej8656+MtCPR1）、WN2（Ej0158+MtCPR）、WN3（Gt0985+MtCPR）、WN4（Ej1409+MtCPR）、WN5（多拷贝质粒）、WN6（Ej8656+GuCPR）、WN7（Ej8656+LjCPR）；熊果酸产量：WN1为33.0 mg/L、WN6为39.0 mg/L、WN7为43.0 mg/L；培养时间：5天；检测方法：GC-MS；质粒类型：pRS415（单拷贝）、pRS42K（多拷贝）
3.2 乙酰辅酶A生物合成途径工程提高熊果酸产量
乙酰辅酶A是MVA途径的重要前体，已被证明对三萜类化合物的生产至关重要。酿酒酵母中乙酰辅酶A主要通过两条途径合成（图1）：一条来自丙酮酸脱氢酶（PDH）旁路；另一条来自乙醇再氧化途径，涉及乙醇脱氢酶（ADH）、乙醛脱氢酶（ALD）和乙酰辅酶A合酶（ACS）。为调控乙酰辅酶A供给，选择上述基因进行过表达。考虑到CPR与辅因子的兼容性，在后续实验中使用MtCPR和LjCPR，分别代表“较强”和“较弱”的CPR，以进一步比较不同CPR在辅因子工程方法中的功能。
本研究在WN1和WN7中分别过表达了ACS1/ACS2、ADH2和ALD6三个基因，形成工程菌株WN11、WN12、WN13、WN14、WN71、WN72、WN73和WN74（表1）。携带空质粒pRS42K的WN1和WN7作为对照菌株，分别命名为WN1c和WN7c（表1）。为进一步丰富乙酰辅酶A库，通过敲除乙酰辅酶A消耗途径中的基因来调控其消耗途径（图1）。本研究敲除的基因包括编码线粒体孔蛋白的POR2、编码线粒体转运蛋白的MPC2和编码柠檬酸合酶的CIT2。所得菌株分别命名为WN15、WN16、WN17、WN75、WN76和WN77。所有用于调控乙酰辅酶A供给的工程菌株均进行摇瓶实验。培养5天后，收集发酵液并提取进行GC-MS分析。工程菌株的构建过程见图S5。
其中，乙醛脱氢酶（ALD6）的过表达表现出最佳效果。具体而言，过表达ALD6的工程菌株WN14和WN74中，熊果酸产量分别达到43.0 mg/L和51.0 mg/L（图3A、3B）。对于敲除乙酰辅酶A消耗基因的菌株（包括WN17、WN76），未发现显著改善（图3A、3B）。
【数据】过表达基因：ACS1/ACS2、ADH2、ALD6；敲除基因：POR2、MPC2、CIT2；菌株：WN11-WN14、WN71-WN74（过表达）、WN15-WN17、WN75-WN77（敲除）；熊果酸产量：WN14为43.0 mg/L、WN74为51.0 mg/L；培养时间：5天；对照菌株：WN1c、WN7c（空质粒pRS42K）
3.3 细胞氧化还原稳态的平衡以提高熊果酸产量
熊果酸的合成需要大量的NADPH和NADH。细胞内NADPH和NADH的水平受多种代谢途径的调控。本研究首先测定了菌株WN1和WN7中NADPH/NADP+和NADH/NAD+的比值。结果显示，WN7的NADPH/NADP+比值高于WN1，而两者的NADH/NAD+比值差异不大。基于此，进一步对辅因子相关基因进行调控。
在WN1基础上，分别过表达IDP2（编码异柠檬酸脱氢酶）、MAE1（编码苹果酸脱氢酶）和eutE（编码乙醛脱氢酶），以及敲除ADH2和GDP1，构建了系列工程菌株。结果显示，过表达IDP2的菌株熊果酸产量有所提高。同时，在WN7基础上进行的辅因子工程也取得了类似效果。
【数据】菌株：WN1、WN7及其衍生菌株；辅因子比值：NADPH/NADP+、NADH/NAD+；过表达基因：IDP2、MAE1、eutE；敲除基因：ADH2、GDP1；检测方法：Solarbio辅因子定量试剂盒
3.4 联合辅因子工程提高熊果酸生物合成的兼容性
在分别优化乙酰辅酶A供给和辅因子平衡的基础上，本研究进一步将两种策略联合应用于熊果酸生产。通过组合过表达ALD6和IDP2等基因，构建了联合工程菌株。结果显示，联合工程菌株的熊果酸产量进一步提高。同时测定了各工程菌株的乙酰辅酶A水平和NADH/NAD+比值，以评估联合工程对胞内代谢的影响。
【数据】联合工程菌株：WN8系列；检测指标：熊果酸产量、乙酰辅酶A水平、NADH/NAD+比值
3.5 摇瓶培养条件优化与放大发酵
在完成菌株工程改造后，对最优菌株WN85进行了培养条件优化。通过优化培养基组成和培养条件，熊果酸产量在摇瓶中进一步提高。随后，利用5 L生物反应器进行补料分批发酵放大实验。发酵过程中监测了细胞生长、葡萄糖消耗、乙醇积累和α-香树脂醇/熊果酸产量等参数。
【数据】菌株：WN85；摇瓶优化后产量：90.0 ± 2.0 mg/L；发酵罐规模：5 L；放大发酵产量：2300 ± 180 mg/L
讨论与解读
本研究通过系统的关键酶筛选、辅因子工程和乙酰辅酶A供给优化，在酿酒酵母中实现了熊果酸的高效合成。从枇杷中筛选的CYP450酶Ej8656与百脉根来源的LjCPR组合表现出最佳的催化兼容性。通过过表达ALD6增强乙酰辅酶A供给，以及调控NADH/NADPH平衡，熊果酸产量从初始的33.0 mg/L逐步提升至摇瓶中的90.0 mg/L。最终在5 L发酵罐中通过补料分批发酵使熊果酸产量达到2.33 g/L，为原始菌株WN1的70倍，也是目前酿酒酵母中报道的最高产量。这一成果表明，多层次的代谢工程策略——从酶筛选到辅因子平衡再到发酵优化——是提高三萜类化合物微生物合成效率的有效途径。
编译者解读：本研究提供了一个值得借鉴的系统性代谢工程范例。其亮点在于"组合拳"式的优化策略：先筛选高活性且兼容性好的CYP450/CPR酶对，再分别解决前体供给和辅因子平衡，最后通过发酵工程放大。这种从分子到工艺的多尺度优化思路，对其它植物源萜类化合物的微生物合成具有直接参考价值。值得注意的是，单拷贝质粒反而优于多拷贝质粒这一反直觉发现，提示异源蛋白表达量并非越高越好，酶与宿主代谢的适配往往比表达强度更关键。不足之处在于，乙酰辅酶A消耗基因的敲除未产生显著效果，说明胞内代谢网络远比线性路径复杂，未来或可借助通量组学分析进一步解析限速节点。
参考来源
Jia N. Engineering Saccharomyces cerevisiae for high-efficient production of ursolic acid via cofactor engineering and acetyl-CoA optimization. Biochemical Engineering Journal, 2024.
DOI: 10.1016/j.bej.2023.109189
DOI: 10.1016/j.bej.2023.109189