来源：Optimizing Huangjiu fermentation for enhanced aroma: Insights into Saccharomyces cerevisiae jiangnan1# strain（Journal of Food Composition and Analysis）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
黄酒中高级醇与乙酸酯的含量失衡是导致饮后不适、上头的关键因素。本研究以酿酒酵母jiangnan1#为对象，对比工业菌株85#，发现其在单边发酵中使高级醇总量降低12.38%，其中2-苯乙醇降幅高达47.32%，且不影响乙酸酯水平。转录组分析揭示Ehrlich通路关键酶ARO9和ARO10的下调是高级醇减少的主因，而ALDH和乙酰辅酶A合成酶的上调促进了酯类积累。该研究为黄酒风味定向调控提供了菌株层面的代谢依据。
研究背景
黄酒作为传统发酵酒精饮品，以其独特风味和营养价值著称。绍兴酒的生产已从手工技艺演变为现代机械化模式，纯种酿酒酵母（如85#、XZ-11）的大规模使用缩短了发酵周期、提高了产量和稳定性。然而，与传统黄酒相比，现代黄酒普遍存在高级醇偏高、乙酸酯偏低的问题，两者比例失衡严重影响风味品质和饮后舒适度——高级醇过量会带来不良口感并引发头痛，而适量高级醇和乙酸酯则能提升黄酒品质。酿酒酵母菌株间的代谢差异被认为是造成这些风味物质变化的关键因素之一，但具体分子机制尚待阐明。
研究方法
2.1 酵母菌株
本研究所用酿酒酵母jiangnan1#（保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC M2021523）具有较好的果香、柔和的口感，以及"醉得快、醒得快、饮后不上头"的特点。另选工业机械化黄酒生产中广泛使用的酿酒酵母85#作为对照菌株。单边发酵中，酿酒酵母jiangnan1#缩写为D-jn1#，酿酒酵母85#缩写为D-85#；双边发酵中，酿酒酵母jiangnan1#缩写为S-jn1#，酿酒酵母85#缩写为S-85#。
【数据】菌株：S. cerevisiae jiangnan1#（CCTCC M2021523）、S. cerevisiae 85#；保藏编号：CCTCC M2021523
2.2 黄酒双边模拟发酵
#### 2.2.1 酵母种子培养物的制备
酵母种子培养物的制备参照Zhao等（2022b）的方法，主要包括：(a) 酿酒酵母菌株的液体培养；(b) 浸米；(c) 蒸米；(d) 三角瓶酵母培养基培养。
【数据】种子培养步骤：液体培养→浸米→蒸米→三角瓶培养；方法来源：Zhao et al. (2022b)
#### 2.2.2 黄酒双边模拟发酵
取上述酵母种子培养物57 mL，加入蒸熟的糯米750 g、生小麦曲58.5 g、熟小麦曲9 g和750 mL水，在3 L三角瓶中进行双边模拟发酵。醪液在30°C稳定条件下进行前发酵（4天），后发酵在15°C下进行16天。所有发酵实验设三次重复。
【数据】种子液：57 mL；糯米：750 g；生小麦曲：58.5 g；熟小麦曲：9 g；水：750 mL；容器：3 L三角瓶；前发酵：30°C，4天；后发酵：15°C，16天；重复次数：3次
2.3 黄酒单边模拟发酵
酵母种子培养物的制备同上。取1 L大米糖化液作为单边模拟发酵体系（残糖含量约200 g/L）。单边模拟发酵为纯微生物发酵，酿酒酵母是唯一变量（D-jn1#和D-85#）。醪液在30°C稳定条件下进行前发酵（5天），后发酵在15°C下进行15天。所有发酵实验设三次重复。
【数据】糖化液体积：1 L；残糖含量：约200 g/L；前发酵：30°C，5天；后发酵：15°C，15天；重复次数：3次
2.4 样品采集
双边发酵分为前发酵（4天）和后发酵（16天）。前发酵采样时间点为48 h和96 h，后发酵采样时间点为240 h和480 h。单边发酵前发酵5天、后发酵15天，前发酵采样时间点包括发酵24 h、72 h和120 h；后发酵采样时间点为240 h和480 h。在上述时间点将发酵液搅拌均匀后取样。样品在8000 × g、4°C条件下离心5 min。上清液用于发酵特性和代谢物分析。微生物等沉淀样品用液氮冷冻后在−80°C保存，用于转录组测序。本研究的详细黄酒发酵流程和主要参数见图S1。
【数据】双边发酵采样点：48h、96h、240h、480h；单边发酵采样点：24h、72h、120h、240h、480h；离心条件：8000 × g，5 min，4°C；保存温度：−80°C
2.5 发酵理化参数分析
按照Zhao等（2022a）报道的方法测定酒精度、总酸和氨基酸态氮含量。残糖含量采用3,5-二硝基水杨酸法检测。
【数据】检测指标：酒精度、总酸、氨基酸态氮、残糖；残糖检测方法：3,5-二硝基水杨酸法
2.6 高级醇及主要挥发性风味化合物分析
采用分散液液微萃取-气相色谱-质谱联用（LLME-GC-MS）测定模拟发酵后黄酒中的四种高级醇，以4-甲基-2-戊醇（0.4536 g/L乙醇溶液）为内标。样品制备方法参照Zhao等（2022b）的描述。四种高级醇的校准曲线方程见表S5。采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME-GC-MS）检测黄酒中的关键挥发性风味化合物，以2-辛醇（0.1018 g/L乙醇溶液）为内标进行定量分析。详细检测信息如下：Thermo Fisher Trace GC Ultra配备TG-Wax色谱柱（30 m × 0.25 mm，膜厚0.25 μm）和TSQ Quantum XLS质谱检测器。载气为氦气（0.8 mL/min）。进样口温度250°C，不分流模式。柱温箱程序：40°C保持2 min，然后以4°C/min升至230°C并保持5 min。所有质谱图在70 eV电子轰击（EI）模式下采集，全扫描范围33–400 amu。挥发性化合物与内标的峰面积比用于反映挥发性化合物的丰度并评估样品间差异。
【数据】内标1：4-甲基-2-戊醇（0.4536 g/L乙醇溶液）；内标2：2-辛醇（0.1018 g/L乙醇溶液）；色谱柱：TG-Wax（30 m × 0.25 mm，膜厚0.25 μm）；载气：氦气，0.8 mL/min；进样口：250°C，不分流；柱温：40°C保持2 min→4°C/min→230°C保持5 min；电离：70 eV EI；扫描范围：33–400 amu
2.7 黄酒生产规模发酵实验
所得菌株的工业应用按照实际工厂生产在30千升发酵罐中进行。使用jiangnan1#和85#（对照）发酵了四批黄酒（共120千升）。
【数据】发酵罐规模：30千升；批次：4批；总产量：120千升
2.8 黄酒饮后舒适度评价
为更直观地评估中试菌株jiangnan1#和85#所产黄酒的感官舒适度，向品酒小组随机呈现两种不同剂量的品尝样品——低剂量（300 mL）和高剂量（600 mL）。本研究在国家黄酒工程技术研究中心（浙江绍兴）组建了感官团队（香气和口味），由10名年龄在25–55岁、具有丰富黄酒品尝和感官分析经验的专家组成。所有参与者均有超出所提供剂量范围的黄酒饮用史，且为从事黄酒相关工作的专业产品评定人员。处理后的数据为不同团队成员的平均分。饮用感官评价包括：头晕、头痛、恶心、口干、呕吐、认知能力和运动协调性。采用日常饮用方式，整个过程持续2 h至3 h。饮酒后0–10 h为饮后体验（清醒阶段），饮酒后10 h之后为饮后清醒体验。消费者填写感官体验表，包括饮酒期（饮酒后0–10 h）和清醒期（>10 h）。所有样品和属性独立随机分配进行盲评，采用5分线性量表评分，5分分别表示感知程度：0（不可感知，无影响）–1（基本感知，基本无影响）–2（轻微）–3（中度）–4（明显）–5（强烈）。
【数据】低剂量：300 mL；高剂量：600 mL；专家组：10人，25–55岁；评价维度：头晕、头痛、恶心、口干、呕吐、认知能力、运动协调性；饮用时长：2–3 h；评分量表：0–5分
2.9 转录组测序
使用标准提取方法从微生物沉淀中提取RNA，用Agilent 2100生物分析仪检测完整性。使用NEBNext® Ultra™ RNA Library Prep Kit for Illumina®试剂盒方法构建转录组测序文库。对测序数据进行数据质量控制。去除含有接头的读段、含未知碱基N超过序列长度5%的读段以及含有低质量碱基的读段；过滤后的数据即为高质量clean reads。
【数据】RNA完整性检测：Agilent 2100生物分析仪；建库试剂盒：NEBNext® Ultra™ RNA Library Prep Kit for Illumina®；质控标准：去除接头读段、N>5%、低质量碱基
2.10 差异表达基因分析与功能注释
使用Bowtie2软件将clean reads与参考基因组比对，获得Reads在参考基因组上的位置信息。使用RSEM软件计算不同发酵时间基因表达水平的FPKM（每千碱基转录本每百万片段数）。使用DESeq2软件进行差异表达基因（DEGs）筛选，筛选标准为|log2(FoldChange)| ≥ 1且Padjust ≤ 0.05。使用OmicShare工具（https://www.omicshare.com/）对差异基因进行GO（基因本体）功能富集分析和KEGG（京都基因与基因组百科全书）通路富集分析。
【数据】比对软件：Bowtie2；表达定量：RSEM（FPKM）；DEGs筛选：DESeq2，|log2(FoldChange)| ≥ 1，Padjust ≤ 0.05；富集分析：OmicShare工具
2.11 统计分析
所有实验均设三次重复，统计分析基于三次重复的数据进行。
【数据】重复次数：3次
研究结果
3.1 jiangnan1#与85#在不同发酵条件下的理化性质差异
单边发酵是一种先糖化后发酵的技术，已广泛用于啤酒生产。在该技术中，酿酒酵母是唯一微生物，可以避免其他微生物对产品的不可预测影响，直接反映酿酒酵母的发酵特性。因此，选择单边发酵来区分jiangnan1#和85#的发酵特征差异。如表1所示，随着发酵进行，酒精度和总酸含量升高，残糖逐渐降低，这符合酿酒酵母的发酵特征。在发酵最初24 h内，D-jiangnan1#和D-85#的酒精度无显著差异，但24 h后与D-85#相比显著降低（P < 0.05），这可能与两者自身的代谢差异有关。在前发酵期间，氨基酸态氮（AAn）含量先降后升，而在后发酵期间呈现相反趋势。这主要是因为单边发酵的初始AAn含量等于大米糖化液中的蛋白质含量。酿酒酵母的生长代谢在前发酵期间消耗氮源，因此AAn含量开始下降。进入后发酵（厌氧）阶段后，发酵温度降低，酿酒酵母生长减缓，细胞开始凋亡，自溶产物导致AAn含量升高。胞内氮库在高级醇形成中起关键作用：它通过增强蛋白质合成刺激细胞增殖，并在整个发酵过程中维持酵母中糖转运蛋白的活性。此外，氨基酸脱氨后产生的α-酮酸可通过Ehrlich途径脱羧并还原形成相应的醇类。在后发酵阶段（240 h后），存活的酿酒酵母可继续代谢合成次级代谢产物，消耗氨基酸导致AAn下降。在双边发酵过程中，小麦曲提供的酶可逐步将淀粉糖化为还原糖，酸蛋白酶催化蛋白质转化产生的氨基酸被利用。因此，随着发酵进行，酒精度、总酸和AAn均升高，残糖除外（表2）。发酵结束后，两种酿酒酵母菌株的理化指标均符合国家黄酒标准。两菌株间的总酸和酒精度均无显著差异。无论前发酵和后发酵是否完成，S-jiangnan1#的AAn均低于S-85#（P < 0.05）。
【数据】单边发酵：D-jiangnan1# 24h后酒精度显著低于D-85#（P < 0.05）；双边发酵：S-jiangnan1#的AAn显著低于S-85#（P < 0.05）；理化指标均符合国家黄酒标准
3.2 jiangnan1#与85#在不同发酵条件下高级醇的差异
高级醇是导致宿醉的主要因素，严重影响黄酒品质。在单边发酵过程中，高级醇含量随发酵进行逐渐增加（表3）。这与发酵温度、酿酒酵母浓度、充足的前体物质等因素有关。高级醇主要在前发酵阶段产生，约占95%，后发酵期间含量趋于稳定并略有增加。以酿酒酵母为唯一变量时，jiangnan1#发酵黄酒中4种高级醇的总量显著低于85#，尤其是2-苯乙醇含量在整个发酵过程中显著低于对照组（P < 0.01）。双边发酵是模拟机械化工艺、涉及多种微生物的发酵方式。如表4所示，双边发酵中高级醇主要在前发酵阶段产生，含量随发酵进行逐渐增加，与单边发酵结果一致。此外，前发酵期间4种高级醇含量略有波动，可能是由于发酵加剧所致。发酵240 h后该过程趋于稳定，此时jiangnan1#的异戊醇和2-苯乙醇含量较85#显著降低（P < 0.05），表明jiangnan1#可降低黄酒发酵中的高级醇含量。基于鲤鱼醉酒模型，Sun等发现高级醇是发酵酒精饮品中的关键致醉物，尤其是2-苯乙醇和异戊醇与乙醇联合时可协同加速醉酒。高级醇的慢性毒性以及肝毒性和神经毒性已有报道。总体而言，jiangnan1#在黄酒酿造中表现出低产高级醇的特性，尤其在单边发酵条件下。双边发酵中高级醇含量高于单边发酵，这可能是多种微生物和外源酶协同作用的结果。
【数据】单边发酵：jiangnan1# 4种高级醇总量显著低于85#；2-苯乙醇含量显著低于对照（P < 0.01）；高级醇主要在前发酵产生（约95%）；双边发酵240h后：异戊醇和2-苯乙醇显著降低（P < 0.05）
3.3 jiangnan1#与85#在不同发酵条件下挥发性风味化合物的差异
黄酒的挥发性风味化合物主要包括醇类、醛类、酸类、酯类等。与醛类和高级醇相反，酯类（尤其是乙酸乙酯）可以舒缓神经、促进新陈代谢，并减轻影响舒适度的关键成分的作用。我们检测了两种不同技术下jiangnan1#和85#分别发酵的黄酒中的醇类和酯类。Xu等发现酿酒酵母菌株与不同地区黄酒风味差异显著相关。同样，Ai等得出结论，菌株可显著影响黄酒的最终品质。主要醇类和酯类的含量及变化趋势如图1所示。除壬酸乙酯、丁酸苯乙酯、巴豆酸乙酯和异戊酸乙酯仅在双边发酵体系中检出外，其余29种化合物在两种发酵体系中均存在。单边发酵中，jiangnan1#的醇类和酯类含量与85#相比无显著变化（图1A）。这可能是因为在单一微生物体系中，jiangnan1#的乙醇生产能力弱于85#，导致挥发性化合物等次级代谢产物减少。发酵过程中乙酸酯的生物合成主要由酿酒酵母在乙酰转移酶的帮助下利用高级醇完成。在双边发酵中，多种微生物和外源酶可参与高级醇和酯类的合成，对其形成表现出促进作用。在S-jn1#中，醇类和酯类增加（图1B），这仍保证了S-jn1#中四种高级醇的含量在发酵结束时低于S-85#。总体而言，jiangnan1#在两种发酵条件下均表现出高产乙酸酯的特性，且双边发酵中的酯类含量显著更高。双边发酵技术是jiangnan1#在保证发酵完成的前提下实现黄酒酿造中低产高级醇和高产乙酸酯的关键。
【数据】检出化合物：双边发酵检出33种（4种仅在双边发酵检出），单边发酵检出29种；单边发酵：醇酯含量无显著变化；双边发酵：S-jn1#醇酯含量增加且4种高级醇仍低于S-85#
3.4 双边发酵过程中jiangnan1#与85#的DEGs分析
研究发现，基因表达调控水平的差异导致发酵过程中出现许多表型差异。酿造微生物中高级醇合成途径已有研究，但关键基因间的相互作用仍待探索，尤其是在工业酿酒酵母菌株中。
讨论与解读
本研究证实了酿酒酵母菌株在调控黄酒中高级醇和乙酸酯产生中的关键作用。jiangnan1#菌株通过降低高级醇和增加乙酸酯来改善风味。这与Ehrlich通路、氨基酸代谢和糖酵解/糖异生途径中关键基因的下调有关，这些变化减少了高级醇的产生。此外，jiangnan1#菌株在乙酸酯产量方面的优异表现可能归因于其与其他微生物及发酵环境的协同作用，这些因素共同塑造了发酵动态。未来研究应深入探讨酵母与其他微生物之间的协同作用，以全面理解它们对发酵动态的集体影响。后续研究将评估不同发酵条件下酯合成基因表达的波动，并将这些变化与实际酯产量相关联。
编译者解读
该研究巧妙利用"单边发酵"体系将酿酒酵母从复杂微生物群落中剥离，清晰定位了菌株自身代谢对高级醇合成的贡献，再以双边发酵验证真实生产场景中的表现——这种"先拆解、再整合"的策略值得借鉴。jiangnan1#在降低2-苯乙醇方面的显著效果（−47.32%）具有直接工业应用价值，但双边发酵中高级醇降幅收窄至8.33%，提示混菌体系中其他微生物的贡献不可忽视。转录组数据指向Ehrlich通路关键酶的下调，为后续基因编辑或定向进化提供了明确靶点。局限在于饮后舒适度评价样本量较小，且酯合成基因表达与产量的相关性尚待系统验证。
参考来源
Ma, D. (2025). Optimizing Huangjiu fermentation for enhanced aroma: Insights into Saccharomyces cerevisiae jiangnan1# strain. Journal of Food Composition and Analysis, 2025. DOI: 10.1016/j.jfca.2024.107051
DOI: 10.1016/j.jfca.2024.107051