来源：Optimization of dairy sludge fermentation culture medium to produce extracts containing bioactive peptides using co-culture of Limosilactobacillus fermentum and Saccharomyces cerevisiae（Journal of Functional Foods）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
乳品工业污泥富含蛋白质资源，却常被当作废弃物处理。本研究以干酪乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）共培养发酵乳品污泥，通过响应面法优化获得最大湿生物量条件，并系统评价了无细胞培养提取物（CFCE）的ACE抑制、抗氧化、抗菌及细胞毒性活性。结果显示，最优条件下湿生物量达3.074 g/L，DPPH自由基清除率约79.89%，对HT-29癌细胞IC50为80.17 mg/mL。该策略为乳品废弃物高值化利用提供了可行路径。
研究背景
生物活性肽由3至20个氨基酸组成，分子量低于6000道尔顿。从食物来源及副产物中提取的肽类具有降血压、降胆固醇、抗氧化、抗菌、免疫调节等多重功能，并参与细胞分裂和黏附等关键细胞过程。酶解、发酵和分子技术是制备生物活性肽的常用手段，其中发酵法凭借微生物产蛋白酶的能力，能将蛋白质分解为更短的生物活性肽段，应用最为普遍。细菌、真菌或酵母既可作为底物中的天然菌群，也可作为外源发酵剂引入。由于微生物蛋白酶多样性丰富，发酵可产生不同大小和序列的肽段。本研究以乳品污泥为发酵基质，采用双菌共培养策略，旨在优化含生物活性肽的无细胞培养提取物的生产工艺并考察其生物学特性。
研究方法
2.1 培养基与化学试剂
以下材料购自德国Merck公司：MRS琼脂和肉汤、PDB、PDA、Mueller Hinton肉汤（MHB）、脱脂乳、磷酸盐缓冲液（PBS）、三氯乙酸（TCA）和过硫酸钾。ABTS试剂（2,2′-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)）和DPPH试剂（2,2-二苯基-1-苦肼基）购自加拿大Sigma公司。ACE（血管紧张素转换酶）、HHL底物（马尿酰-组氨酰-亮氨酸）和十二烷基硫酸钠（SDS）购自美国Sigma-Aldrich公司。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）和胎牛血清（FBS）购自英国Gibco公司。乳品污泥取自伊朗马什哈德Pegah Khorasan Razavi乳品厂。
【数据】试剂来源：Merck（德国）、Sigma（加拿大）、Sigma-Aldrich（美国）、Gibco（英国）；乳品污泥来源：Pegah Khorasan Razavi乳品厂（伊朗马什哈德）
2.2 乳品污泥的制备与纯化
乳品污泥取自Pegah Khorasan乳品厂。为去除不溶性蛋白质并降低微生物含量，在90°C下热处理5分钟。随后使用半工业级双喷嘴喷雾干燥器（Soroush Sanat，伊朗）以逆流方式进行干燥。设定入口温度180°C、入口流速44.5 mL/min，获得均匀的乳品污泥粉末。
【数据】热处理温度：90°C；时间：5min；喷雾干燥入口温度：180°C；入口流速：44.5 mL/min
2.3 微生物活化
Llb. fermentum 4–17 购自菲尔多西大学农学院食品工业组微生物保藏中心。将其接种于MRS琼脂，37°C培养24小时。确认无污染后，挑取纯菌落转接至MRS肉汤并在上述条件下培养。S. cerevisiae PTCC 5052 同样购自该保藏中心，接种于PDA培养基，27°C培养72小时。确认无污染后，挑取纯菌落转接至PDB培养基并在上述条件下培养。
【数据】Llb. fermentum 4–17培养条件：MRS琼脂/肉汤，37°C，24h；S. cerevisiae PTCC 5052培养条件：PDA/PDB，27°C，72h
2.4 湿生物量生产条件优化
本研究采用响应面法（RSM）在三个水平上优化乳品污泥培养基中的发酵条件。变量包括培养温度、接种类型和培养时间，详见表1。根据Dineshbhai等人（2022）的方法，Llb. fermentum 和 S. cerevisiae 单独培养时接种量为2%（w/v），共培养时各为1%（w/v）。实验设计采用RSM框架内的中心复合设计（CCD），以优化影响响应变量（湿生物量产量）的变量。响应变量以三次实验重复的平均湿生物量产量（g/L）表示。
【数据】接种量：单培养2%（w/v），共培养各1%（w/v）；实验设计：CCD；重复次数：3次
2.5 最优处理无细胞培养提取物（CFCE）的制备
基于乳品污泥发酵条件优化结果，选择最佳处理，参照Dineshbhai等人（2022）的方法并略作修改，从选定处理中制备无细胞培养提取物（CFCE）。
【数据】制备方法：参照Dineshbhai等（2022）略作修改
2.6 最优处理ACE抑制活性评价
以HHL为底物，参照Hati等人（2015）的方法略作修改，测定最优处理的ACE抑制活性百分比。抑制活性的测定依据Cushman等人（1961）的方法。取200 μL CFCE样品与200 μL 5 mM HHL悬液混合，加入20 μL ACE酶启动反应，37°C孵育30分钟。孵育结束后，加入1 mL 1 N盐酸终止反应。混合物再于37°C孵育30分钟。使用分光光度计（Perkin Elmer UV Winlab US-710 CT 06484–4794，Shelton，CT，USA）在228 nm波长处测定溶液吸光度。对照样品使用2 mL去离子水稀释的马尿酸。ACE抑制活性按下式计算：
ACE（%）= [(HA对照 − HA样品)/HA对照] × 100
上述公式中，HA样品代表CFCE样品的吸光度，HA对照代表对照样品的吸光度。
【数据】HHL浓度：5mM；ACE酶用量：20μL；反应温度：37°C；反应时间：30min+30min；终止液：1N盐酸1mL；检测波长：228nm
2.7 最优处理抗氧化活性评价
#### 2.7.1 ABTS活性评价
参照Hernandez等人（2007）的方法略作修改，测定CFCE样品对ABTS自由基水解的抑制率。首先配制7 mM ABTS和2.45 mM过硫酸钾，定容至10 mL。溶液在室温避光条件下孵育12小时，然后用5 mM生理磷酸盐缓冲液将734 nm波长处的吸光度调节至0.7 ± 0.2。随后取10 μL CFCE样品与1 mL ABTS储备液混合，室温孵育6分钟。孵育后，使用分光光度计（UV-1601，Shimadzu，京都，日本）在734 nm处测定吸光度。
ABTS自由基活性% = [(A1 – A2)/A1] × 100
上述公式中，A1代表空白样品吸光度，A2代表CFCE样品吸光度。
【数据】ABTS浓度：7mM；过硫酸钾浓度：2.45mM；定容体积：10mL；孵育时间：12h（室温避光）；调节吸光度：0.7±0.2（734nm）；样品用量：10μL；ABTS溶液：1mL；反应时间：6min（室温）；检测波长：734nm
#### 2.7.2 DPPH自由基清除活性评价
首先用乙醇将DPPH稀释至0.1 mM。随后将50 μL CFCE样品（10 mg/mL）与150 μL DPPH溶液混合。避光孵育30分钟后，使用分光光度计（Shimadzu，日本UV-1800系列）在517 nm波长处测定吸光度。以乙醇单独作为空白对照。
DPPH自由基清除活性（%）= [1 − (A1/A0)] × 100
上述公式中，A0为空白吸光度，A1为样品吸光度。
【数据】DPPH浓度：0.1mM；样品浓度：10mg/mL；样品用量：50μL；DPPH用量：150μL；孵育时间：30min（避光）；检测波长：517nm
#### 2.7.3 铁还原抗氧化能力（FRAP）评价
参照Li等人（2013）的方法略作修改，评价CFCE样品的铁还原能力。首先将1 mL蒸馏水和1 mL 1%（w/v）铁氰化钾加入1 mL CFCE样品中。配制好的溶液在50°C孵育20分钟，加入10 mL 10%（w/v）TCA溶液，用离心机（3 K15，Sigma，Osterode am Harz，德国）在1500 rpm离心5分钟进行均质化。下一步，取2 mL上清液与2 mL蒸馏水和1 mL 1%（w/v）三氯化铁混合，室温孵育10分钟。使用分光光度计（Shimadzu，日本UV-1800系列）在700 nm波长处测定所得溶液的吸光度。
【数据】铁氰化钾浓度：1%（w/v）；孵育温度：50°C；孵育时间：20min；TCA浓度：10%（w/v）；离心转速：1500rpm；离心时间：5min；三氯化铁浓度：1%（w/v）；室温孵育：10min；检测波长：700nm
2.8 最低抑菌浓度（MIC）评价
依据美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）指南，采用微量稀释法测定最低抑菌浓度。第一步将CFCE以1 mg/mL溶解于二甲基亚砜（DMSO）中。随后以MHB为培养基对该溶液进行系列稀释。用于测定MIC的细菌包括 E. coli ATCC 25922、S. aureus ATCC 25923、S. typhi PTCC 1609 和 L. innocua ATCC 33090。为每种细菌制备1.5 × 10⁸ CFU/mL（相当于0.5 McFarland标准）的菌悬液，使用96孔微量板进行MIC测定。
【数据】CFCE溶解浓度：1mg/mL（DMSO）；菌悬液浓度：1.5×10⁸ CFU/mL（0.5 McFarland）；测试菌株：E. coli ATCC 25922、S. aureus ATCC 25923、S. typhi PTCC 1609、L. innocua ATCC 33090
研究结果
3.1 热处理对乳品污泥培养基形态的影响
本研究中，乳品污泥作为微生物发酵培养基使用，培养基的热处理使其颗粒尺寸分布均匀、质地均一、无颗粒聚集现象。除观察到的形态变化外，发酵培养基的热处理还影响了其组分的理化性质。此外，该过程还增加了培养基颗粒的表面积与体积比。表面积与体积比的增加改善了微生物对营养物质的获取，最终促进了生物量产量增加和代谢产物的形成。
【数据】热处理效果：颗粒分布均匀、质地均一、无聚集；表面/体积比：增加（原文未给出具体数值）
3.2 湿生物量生产最优条件研究
本研究采用RSM确定湿生物量生产的最佳操作条件。基于CCD，进行了39次试验，在三个水平上优化三个独立变量对湿生物量产量的影响。获得的湿生物量数据使用Design-Expert软件（版本13.0.5）分析，随后进行方差分析（ANOVA）。本实验提出的模型为二次模型，模型计算的p值小于0.0001，表明基于ANOVA表该模型显著。决定系数（R²）为0.9451，校正决定系数（R²adj）为0.9007，进一步证实了该模型的高度显著性。该模型的失拟检验p值为0.9812，表明失拟不显著。ANOVA表中的p值用于评估各变量、平方效应和交互作用的显著性。p值小于0.05表示具有统计学显著性，而p值大于0.05则表示无统计学显著性。基于表1，每个变量在该模型中单独均显著。然而，仅温度与时间的交互作用（AB）显著，平方效应（B²）显著，其余变量间的交互作用不显著。
图1中的所有图展示了独立变量温度和时间对湿生物量产量的交互效应，分别针对单菌株酿酒酵母 S. cerevisiae PTCC 5052、Llb. fermentum 4–17 细菌以及该酵母与细菌的共培养。基于研究结果，当发酵过程中时间变量保持恒定时，湿生物量产量随温度升高呈比例增加。另一方面，当图中温度变量保持恒定时，随着时间延长，湿生物量产量增加。总体而言，时间增加对生物量产量的影响大于温度增加的影响。此外，如果温度和时间同时增加至35°C和48小时，湿生物量产量的增加幅度大于各变量单独增加时的幅度。
接种类型这一独立变量对湿生物量产量有显著影响。基于图"a"中湿生物量产量数据，S. cerevisiae 单独培养无法产生大量生物量。S. cerevisiae 单菌株在乳品污泥培养基中培养似乎因不良相互作用和无法利用乳糖而无法产生大量生物量。图"b"关注生长初期，探究 Llb. fermentum 4–17 单独培养产生的湿生物量。分析显示，该细菌的接种可产生大量湿生物量。然而，在生长初期之后，由于培养基中碳源和氮源等必需营养素缺乏以及pH降低，该细菌失去产生大量湿生物量的能力。
然而，在该细菌与 S. cerevisiae 的共培养中，Llb. fermentum 通过产生有机酸降低pH，为 S. cerevisiae 的生长创造有利条件。S. cerevisiae 反过来通过产生细菌生长所需的维生素和氨基酸等必需因子来促进 Llb. fermentum 的生长。统计设计结果显示，最高湿生物量产量（3.074 g/L）在温度34.86°C、Llb. fermentum 4–17 与 S. cerevisiae PTCC 5052 共培养43.1小时时获得。
Liu等人（2021）的研究考察了乳酸乳球菌乳酸亚种与 S. cerevisiae 单培养和共培养对乳链菌肽产量提升的影响。该研究结果表明，共培养条件下的生物量产量显著高于单培养条件。乳酸乳球菌单培养20小时后观察到的低生物量产量似乎是由营养耗竭和有害化合物抑制导致的，最终引起细菌死亡。相反，当 S. cerevisiae 单独培养时，其生长速率在初期因发酵培养基中低pH而缓慢，但20小时后因酸性条件的形成其生长速率加快。在乳酸乳球菌与酵母共培养过程中，细菌通过分泌有机酸积极促进酸度升高，为酵母生长创造有利环境。酵母则通过产生氨基酸（缬氨酸、亮氨酸）和维生素B6等关键因子促进 Llb. fermentum 的生长。
Bertsch、Roy和LaPointe（2019）考察了 Lacticaseibacillus rhamnosus 三个菌株（ATCC 9595、R0011和RW-9595M）与 S. cerevisiae 单培养和共培养对胞外多糖（EPS）产生的影响。他们还监测了乳酸菌中关键基因的表达。结果表明，与RW-9595M或R0011菌株共培养不影响乳糖消耗，而与ATCC 9595菌株共培养则显著影响乳糖消耗，表明存在菌株依赖性差异。此外，L. rhamnosus 的胞外多糖产量取决于稳定期和指数期的基因激活。在共培养中，Lacticaseibacillus rhamnosus 的RW-9595M菌株表现出比单培养更高的靶基因表达。这种增加的基因活性被发现与酸性胁迫有关。
【数据】模型p值：<0.0001；R²=0.9451；R²adj=0.9007；失拟p值=0.9812；最高湿生物量：3.074 g/L；最优温度：34.86°C；最优时间：43.1h；最优接种：共培养
3.3 最优处理CFCE的抑制活性研究
ACE是肾素-血管紧张素系统的组成部分，调节血压。其作用涉及将血管紧张素I转化为血管紧张素II，导致血管舒张并同时降解缓激肽。该过程最终导致血压升高。ACE抑制剂阻止血管紧张素I向II的转化和缓激肽的降解，从而发挥抗高血压作用。来自优化发酵处理的CFCE在产生ACE抑制肽方面显示出优于酶解工艺的显著优势。这种优越性源于多个因素，包括降低的抗原性、抗营养因子（ANF）的降解以及产生有益效果。
【数据】ACE抑制活性：原文未在节选部分给出具体数值
3.4 最优处理CFCE的细胞毒性研究
【数据】HT-29细胞系；IC50：80.17 mg/mL（来自摘要）
3.5 最优处理CFCE的抗菌活性研究
【数据】测试菌株：S. aureus ATCC 25923、E. coli ATCC 25922；最高抗菌活性：针对 S. aureus（来自摘要）
3.6 最优处理CFCE的蛋白水解活性与细胞活力研究
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究通过中心复合设计成功优化了乳品污泥发酵条件，确定了湿生物量最大化的关键参数组合：温度34.86°C、共培养接种、发酵时间43.1小时。共培养体系中两种微生物的协同代谢——乳酸菌产酸降低pH为酵母创造适宜环境，酵母则提供维生素和氨基酸促进乳酸菌生长——是生物量提升的核心机制。CFCE表现出多方面的生物活性，包括ACE抑制、抗氧化、抗菌和细胞毒性，其中对金黄色葡萄球菌的抗菌作用最为突出，DPPH自由基清除率约79.89%，对HT-29癌细胞的IC50为80.17 mg/mL。发酵法相比酶解法和分子方法具有原料成本低、环境污染小的优势，且利用乳品工业废弃物作为基质，兼具资源循环和环境治理双重效益。
编译者解读
本研究将乳品工业废弃物转化为高附加值生物活性肽提取物，体现了合成生物学"废弃物-资源"闭环设计的思路。共培养策略利用两种微生物的代谢互补性，避免了外源添加昂贵生长因子的成本。值得注意的是，CFCE的粗提物即表现出可观的生物活性，若进一步纯化鉴定具体肽段序列，活性潜力或可大幅提升。未来方向包括肽段分离纯化、体内活性验证及临床前安全性评价，这将决定该技术能否从实验室走向功能性食品和药品的实际应用。
参考来源
Heydarian, A. (2024). Optimization of dairy sludge fermentation culture medium to produce extracts containing bioactive peptides using co-culture of Limosilactobacillus fermentum and Saccharomyces cerevisiae. Journal of Functional Foods, 2024. DOI: 10.1016/j.jff.2023.105982
DOI: 10.1016/j.jff.2023.105982