来源：Optimized biomass and bioethanol production from dairy industry side streams by Saccharomyces cerevisiae ATCC 13007 under aerobic and microaerophilic conditions（Cleaner Engineering and Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
乳清是奶酪和凝乳生产的副产物，具有高生化需氧量（BOD）和化学需氧量（COD），直接排放会造成严重环境污染。本研究以甜乳清（SW）和酸乳清（AW）为底物，利用超衰减啤酒酿造菌株酿酒酵母ATCC 13007，通过嗜热β-葡萄糖苷酶预处理将乳糖水解为可发酵糖，系统评估了好氧与微好氧条件对酵母生长和发酵效率的影响。研究发现好氧条件下2倍稀释AW中生物量最高（OD600=2.20），微好氧条件下2倍稀释SW中乙醇浓度达4.5 g/L，好氧培养使乙醇脱氢酶活性提高10倍，展示了乳品副产物作为单细胞蛋白和生物乙醇生产底物的可行性。
研究背景
生物乙醇作为化石燃料的替代品，燃烧时不产生有毒排放，有助于缓解污染和应对全球变暖。利用工业和农业副产物作为生物乙醇生产原料已成为研究热点。乳品工业副产物——乳清，因高BOD和COD而面临处置难题。将乳清转化为单细胞蛋白（SCP）和乙醇，不仅能解决废液处理问题，还能满足全球对生物乙醇日益增长的需求，减少对复杂且昂贵的废水处理方法的依赖。
乳清分为两类：甜乳清（SW）——使用凝乳酶生产硬质干酪的副产物；酸乳清（AW）——酸凝乳生产过程中的副产物。两者均富含乳糖、蛋白质、矿物质等营养成分，是微生物发酵的理想底物。
研究方法
2.1 菌株、培养基与培养条件
酿酒酵母ATCC 13007（原养型，pof+，sta，全基因组序列数据库编号——欧洲核苷酸档案库（ENA）：ERR5358805）购自亚美尼亚共和国“Armbiotechnology”科学生产中心微生物保藏中心。该菌株（艾尔啤酒酿造）分离自超衰减爱尔兰啤酒，可额外分泌葡糖淀粉酶，是利用废弃物进行生物乙醇生产研究的优良候选菌株。
酵母在YPD培养基中培养，其组成为：酵母提取物10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖2 g/L。固体培养基添加20 g/L琼脂。将1.5%过夜培养的预培养物接种至YPD培养基。微好氧条件（不摇动）下，在300 mL锥形瓶中装入250 mL YPD培养。好氧培养则在300 mL锥形瓶中装入100 mL YPD培养基，于30°C、180 rpm摇床培养。用0.1 N HCl将培养基pH调至5.0（pH计，Hanna Instruments，美国），配用HJ1131B电极，使用标准校准液（pH 2.01；pH 5.01；pH 7.01，Hanna Instruments，美国）校准。
【数据】菌株：酿酒酵母ATCC 13007；YPD培养基：酵母提取物10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖2 g/L；琼脂：20 g/L；接种量：1.5%；微好氧：300 mL锥形瓶装250 mL，不摇动；好氧：300 mL锥形瓶装100 mL，30°C、180 rpm；pH：5.0（0.1 N HCl调节）
2.2 乳清处理
初始浓度SW为34.6 g干重/L、AW为38.4 g干重/L，取自亚美尼亚埃里温MARIANNA乳品厂。使用分离自热泉宏基因组的嗜热酶（β-葡萄糖苷酶，EC 3.2.1.21）将乳糖酶解为可发酵糖（葡萄糖和半乳糖）。该酶水解末端非还原性β-D-葡萄糖残基，特别是断裂β-D-糖苷键（β-1→4），释放葡萄糖和半乳糖。
酶处理前，将AW和SW的pH均调至6.5以利于β-葡萄糖苷酶高效作用。乳清样品预热至80°C后，加入β-葡萄糖苷酶（1000 U/L），继续孵育30 min。释放的葡萄糖浓度采用葡萄糖氧化酶/过氧化物酶（GOD/POD）法测定。反应混合物含：4-氨基安替比林（0.30 mM）、苯酚（5 mM）、醋酸钠缓冲液（100 mM，pH 5.8）、辣根过氧化物酶1 U、来源于产黄青霉的葡萄糖氧化酶1 U。取10 μL处理后的乳清加入1.50 mL反应混合物中，于30°C孵育10 min，随后在550 nm处测定显色反应（Cary 60 UV-Vis分光光度计，安捷伦科技，德国）。
为评估浓度对酵母生长的影响，实验中使用未稀释和2倍稀释的AW和SW样品。将SW和AW稀释2倍是为了减少抑制性化合物并优化底物浓度。前期实验表明，该调整可为微生物（大肠杆菌）生长和氢化酶活性创造有利条件，与未稀释乳清相比可提高氢气（H2）产量。这可能归因于抑制性物质（如乳酸）浓度降低、渗透压调整以及糖浓度平衡——这些因素同样可显著影响酵母生长和发酵效率。因此，除调节氧水平外，本研究还采用了废弃物材料浓度依赖性研究策略，以探索高发酵效率条件。
【数据】SW初始浓度：34.6 g干重/L；AW初始浓度：38.4 g干重/L；酶处理pH：6.5；预热温度：80°C；β-葡萄糖苷酶用量：1000 U/L；酶解时间：30 min；GOD/POD法：4-氨基安替比林0.30 mM、苯酚5 mM、醋酸钠缓冲液100 mM（pH 5.8）、辣根过氧化物酶1 U、葡萄糖氧化酶1 U；检测波长：550 nm；孵育条件：30°C、10 min
2.3 酵母生长与培养基理化参数研究
酵母生物量生长通过Cary 60 UV-Vis分光光度计（安捷伦科技，德国）在600 nm处测定培养物光密度（OD）来监测。比生长速率（μ）按公式（1）计算：μ = (ln OD2 − ln OD1)/(t2 − t1)，其中OD2和OD1分别为t2和t1小时时酵母培养物的OD值，且（t2−t1）小时内OD2:OD1 = 2。
整个酵母生长过程中，监测胞外pH和氧化还原电位（ORP）动力学。胞外pH使用配备HI1131电极的HI3220 pH计（Hanna Instruments，美国）测定。ORP测量使用ORP铂电极（Pt，HI3131，HANNA Instruments，葡萄牙）和钛硅酸盐（Ti-Si）电极，于25 ± 1°C下进行。ORP电极使用含有16.13 g/L K3[Fe(CN)6]和21.12 g/L K4[Fe(CN)6]的参比溶液（pH 6.86）校准：ORP为254 ± 10 mV（25°C）。
【数据】OD测量波长：600 nm；比生长速率公式：μ = (ln OD2 − ln OD1)/(t2 − t1)；ORP测量温度：25 ± 1°C；ORP校准液：16.13 g/L K3[Fe(CN)6] + 21.12 g/L K4[Fe(CN)6]，pH 6.86，ORP 254 ± 10 mV
2.4 蛋白氮测定
蛋白氮含量采用凯氏定氮法测定。实验开始时（酵母在AW或SW中培养的0–96小时），将样品（3.50 mL）转移至无菌Eppendorf管中，随后储存于−20°C。样品解冻后，取每份样品2 mL（未离心，含酵母细胞）转移至水解管中。随后加入催化剂（7 g K2SO4和CuSO4混合物，比例为1:9）、3–5粒防沸石和10 mL浓H2SO4，使用TURBOTHERM凯氏消解仪（Gerhardt，德国）于450°C消解45 min。消解后，使用VAPODEST 200–450蒸馏单元（Gerhardt，德国）进行蒸馏，加入80 mL 34%（w/v）NaOH和100 mL蒸馏水，使氨释放。氨通过pH依赖性颜色变化（从紫色变为绿色）被固定，使用50 mL 4%（w/v）H3BO3和Tashiro指示剂。含氨馏出液用0.1 N HCl滴定，直至指示剂颜色从绿色变为紫色。根据中和的酸体积，使用蛋白质氮换算因子6.125计算蛋白质中的氮含量。结果以g/L表示。
【数据】样品体积：3.50 mL；分析取样量：2 mL（未离心）；催化剂：7 g（K2SO4:CuSO4 = 1:9）；浓H2SO4：10 mL；消解条件：450°C、45 min；蒸馏：80 mL 34%（w/v）NaOH + 100 mL蒸馏水；吸收液：50 mL 4%（w/v）H3BO3 + Tashiro指示剂；滴定：0.1 N HCl；蛋白氮换算因子：6.125
2.5 总碳水化合物（TC）和挥发性固体（VS）评估
总碳水化合物含量在酵母生长0–96 h期间采用苯酚-硫酸法测定。通过离心（13500 rpm，10 min，Daihan Scientific CF-10，韩国）收集适当生长阶段的酵母细胞，随后定量上清液中的碳水化合物含量。将200 μL 5%（v/v）苯酚和1 mL 36%（v/v）硫酸与400 μL测试样品混合。混合物随后在25–30°C水浴中孵育10 min。在485 nm处测定所得溶液的吸光度，以对照（仅含试剂的蒸馏水）为参比。使用1 g/L葡萄糖溶液构建校准曲线，连续稀释获得0.04至200 μg/mL的浓度范围。总碳水化合物含量基于葡萄糖校准曲线计算，TC浓度以g/L表示。
乳清中糖浓度通过改良版Sumner 3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂法测定还原基团。简要步骤：取10 μL 5倍稀释乳清，加入0.5 mL改良DNS试剂，在沸水浴中孵育15 min。冷却后，向每份样品加入0.5 mL蒸馏水，充分混匀，在546 nm处测定吸光度。使用0至10 mM的葡萄糖溶液建立标准校准曲线。
【数据】离心：13500 rpm、10 min；苯酚-硫酸法：200 μL 5%（v/v）苯酚 + 1 mL 36%（v/v）硫酸 + 400 μL样品；孵育：25–30°C、10 min；检测波长：485 nm；校准曲线：1 g/L葡萄糖，0.04–200 μg/mL；DNS法：10 μL 5倍稀释乳清 + 0.5 mL DNS试剂；沸水浴：15 min；检测波长：546 nm；校准曲线：0–10 mM葡萄糖
研究结果
3.1 乳清处理优化与酿酒酵母ATCC 13007培养特性
使用嗜热β-葡萄糖苷酶将乳糖酶解为可发酵糖（半乳糖和葡萄糖）。未处理AW中乳糖浓度为41 ± 2 g/L，与此前报道值一致。酶解后的糖含量（DNS试剂法测定）结果汇总于表1。酶处理后，检测到约14.70 ± 1.70 g/L葡萄糖和15.70 ± 1.80 g/L半乳糖，表明废弃物被高效酶解，可增加可发酵碳水化合物的数量。未处理和酶处理的乳清中总碳水化合物含量（苯酚-硫酸法测定）在未稀释SW（34.6 ± 2.0 g干重/L）和AW（38.4 ± 2.0 g干重/L）中均约为18.0 ± 2.0 g/L。所有上述溶液及其2倍稀释样品均用于酵母培养。结果与酵母在标准YPD中生长的对照组进行比较。
酿酒酵母ATCC 13007在好氧条件下所有培养基中均表现出强劲生长，2倍稀释AW和SW的OD值最高，优于未稀释溶液。相比之下，微好氧条件下所有培养基的生长速率较慢，OD值显著降低，尤其在未稀释AW和SW中尤为明显。结果表明，氧含量和培养基稀释度在pH 5.0条件下均显著影响酿酒酵母ATCC 13007的生长动力学（图1）。
微好氧条件下96 h酵母生长比好氧条件低约1.4倍，OD600达到1.60 ± 0.05。相比之下，好氧条件下生长更高，培养96 h时OD600最大值达2.2，表明该菌株更好地适应富氧环境。对照（YPD）样品在24 h达到最大生长（μ为0.28 ± 0.01 h−1），在生长后期稳定期（120 h）细胞数量下降。AW和SW中的生长特性与YPD培养基中的生长相似，与乳清稀释度无关。此外，在AW上培养时酵母生长增加约1.2倍。
未稀释和2倍稀释SW样品的比生长速率（μ）一致，微好氧条件下μ值为0.120 ± 0.002 h−1。相比之下，好氧条件下未稀释和2倍稀释SW的μ分别为0.31 ± 0.01 h−1和0.41 ± 0.02 h−1。根据AW样品在好氧条件下的比生长速率，2倍稀释AW获得最高μ值0.38 ± 0.01 h−1，显示出优于其他考察条件的生长表现（表3）。
培养过程中胞外pH变化动力学也被研究，以评估糖酵解强度和代谢副产物（如乙酸、苹果酸、柠檬酸等）的产生。AW和SW中酵母生长期间pH下降（见图2），表明细胞进行活跃的发酵代谢，导致有机酸（如乙酸）的形成。pH最大降幅（ΔpH = 1.00 ± 0.03）出现在微好氧条件下2倍稀释SW样品中，可能由于高碳水化合物浓度增强了微生物发酵。与SW相比，AW的pH无显著变化，这可能归因于高乳酸含量抑制了酵母生长，提示两种乳清之间微生物活性或代谢过程存在差异。例如，此前研究发现，来自凝乳酶干酪生产的SW，虽然与生产过程中产生的AW组成相似，但乳酸含量低16倍。其他研究报告AW中乳酸与乳糖之比为0.02 g/g，据此推算本研究的样品可含有约0.9 g/L乳酸，处于酿酒酵母报道值的低端和耐受范围内（抑制浓度从2.5%开始检测到）。因此，本研究还可为酿酒酵母对乳酸或乳酸盐的适应性提供见解。已有研究表明，在本研究采用的pH 5.0条件下（乳酸盐为主要形式），酿酒酵母的主要转录响应与铁稳态相关，主要由转录因子Aft1调控。
研究结果表明，氧可用性对酿酒酵母代谢有显著影响，好氧条件下的生长明显高于微好氧条件。这与氧水平和培养基组成对酿酒酵母比生长速率的综合效应高度相关。虽然好氧条件通常支持更快更旺盛的生长，但该菌株在SW中也表现出相当强的适应性，即使在限氧条件下也是如此。这些观察结果与先前研究一致，该研究强调氧分压的变化显著影响酿酒酵母的生长。
图3显示了pH 5.0条件下酿酒酵母在AW和SW培养基中微好氧和好氧培养时ORP的变化。结果显示，ORP变化模式取决于乳清类型、稀释因子和对照培养基。所有样品的ORP初始值均为正值。酵母生长期间ORP下降约150 mV，表明还原过程的启动。与AW和SW上的酵母生长不同，对照样品从第3小时开始ORP值持续下降，达到（−40.0 ± 1.2）mV。未稀释和2倍稀释的AW维持较高ORP值，而2倍稀释SW具有较低ORP值，提示更强的还原活性（图3B）。最终ORP值稳定在100 ± 3 mV。这些结果表明，AW总体上比SW维持更高的ORP水平，提示较低的还原潜力。SW和AW中均观察到ORP最大降幅（150 ± 10 mV），与生长变化相关。
观察到的pH和ORP变化可能反映了酵母发酵过程中的潜在代谢过程。pH下降提示有机酸（如乙酸盐或乳酸盐）的积累，而ORP降低则表明向更还原的代谢物（如乙醇）转变，与活跃的发酵代谢一致。好氧条件下，NADH通过呼吸的部分再氧化可调节ORP，反映发酵和氧化途径之间的平衡。
综上，本研究探索了酿酒酵母ATCC 13007在AW和SW中微好氧和好氧条件下的生长特性。结果强调了氧可用性在促进酵母生长中的重要作用——好氧条件持续产生比微好氧条件更高的比生长速率（μ）和更显著的微生物活性。特别是未稀释SW在好氧条件下表现出最高生长速率，突显其作为酵母培养底物的适用性。生长过程中观察到的pH下降进一步表明活跃发酵，尤其在SW中pH下降更为明显，提示更高的微生物活性。
【数据】未处理AW乳糖浓度：41 ± 2 g/L；酶解后葡萄糖：14.70 ± 1.70 g/L；酶解后半乳糖：15.70 ± 1.80 g/L；TC：约18.0 ± 2.0 g/L（SW和AW）；SW干重：34.6 ± 2.0 g/L；AW干重：38.4 ± 2.0 g/L；微好氧96 h OD600：1.60 ± 0.05；好氧96 h最大OD600：2.2；YPD对照最大μ：0.28 ± 0.01 h−1（24 h）；AW生长增加：约1.2倍；SW微好氧μ：0.120 ± 0.002 h−1；SW好氧μ：0.31 ± 0.01 h−1（未稀释）、0.41 ± 0.02 h−1（2倍稀释）；2倍稀释AW好氧μ：0.38 ± 0.01 h−1；最大ΔpH：1.00 ± 0.03（微好氧2倍稀释SW）；AW乳酸含量：约0.9 g/L；ORP最大降幅：150 ± 10 mV；对照ORP最低值：−40.0 ± 1.2 mV；ORP稳定值：100 ± 3 mV
3.2 培养介质VS和TC变化分析
VS水平的变化可揭示酿酒酵母在不同氧可用性条件下的代谢活性和底物利用效率。初始测量表明，AW样品中VS浓度为8.5 ± 1.2 g/L……
【数据】AW初始VS：8.5 ± 1.2 g/L（原文节选至此，后续数据原文未详述）
讨论与解读
本研究证实了乳品工业副产物（甜乳清和酸乳清）作为酿酒酵母ATCC 13007生物乙醇和生物量生产底物的可行性。核心发现包括：好氧条件下2倍稀释AW中最大μ（0.40 ± 0.01 h−1）和生物量积累最高，对应约7.50 g/L葡萄糖和半乳糖及0.40 g/L氮浓度，比微好氧条件高30–50%。挥发性固体（VS）在2倍稀释AW中48 h达到33.00 ± 0.90 g/L，表明强烈的发酵活性；好氧条件下未稀释SW在120 h获得最大蛋白产量（约占总有机碳的52%）。最大乙醇产量（4.50 ± 0.10 g/L）出现在微好氧条件下2倍稀释SW培养24 h时。氧可用性关键调控酿酒酵母ADH活性和同工酶动力学，好氧培养使ADH活性比微好氧条件提高10倍——好氧培养48 h时ADH活性达700 ± 50 U/mg，反映了从ADH1驱动的乙醇生产向ADH2介导的乙醇消耗的代谢转变。
编译者解读
本研究以乳品副产物为底物、以氧供给为调控杠杆，在"废弃物资源化"与"代谢工程"之间找到了巧妙的结合点。方法上值得借鉴的是双维度策略——同时调整氧水平和底物稀释度，系统性地优化了发酵条件。好氧条件下生物量显著提升而微好氧条件下乙醇产量更高，这一氧依赖性代谢切换为工业上按需调控产物方向提供了操作窗口。不过，乳清成分复杂，乳酸等抑制物对菌株代谢的干扰机制仍待深入解析；未来若能将氧调控策略与工程菌株的代谢通路改造相结合，有望进一步提升乳品副产物的转化效率与经济性。
参考来源
Anikyan L. Optimized biomass and bioethanol production from dairy industry side streams by Saccharomyces cerevisiae ATCC 13007 under aerobic and microaerophilic conditions. Cleaner Engineering and Technology, 2026. DOI: 10.1016/j.clet.2026.101160
DOI: 10.1016/j.clet.2026.101160