来源：Enhancing ergothioneine production in Saccharomyces cerevisiae via protein fusion technology and gene integration optimization（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
麦角硫因（EGT）是组氨酸衍生的含硫氨基酸，兼具抗氧化、神经保护等多种生理功能，在食品、化妆品和医药领域应用前景广阔。本研究首次在酿酒酵母中构建真菌EGT生物合成途径，结合蛋白融合技术与基因整合优化策略，获得工程菌株SZA011——摇瓶发酵产量达122.5 mg/L，10 L补料分批发酵产量高达626.24 mg/L，创下目前酿酒酵母EGT生产的最高纪录。该研究为微生物EGT生产提供了全新策略。
研究背景
麦角硫因是一种含硫非蛋白氨基酸，1909年首次从麦角真菌中分离获得。作为强效非酶抗氧化剂，EGT具有抗氧化、抑制细胞死亡、改善睡眠障碍、神经保护及疾病调控等多种生理功能，在食品、化妆品和健康相关领域极具吸引力。人体虽含有EGT却无法内源合成，必须从外界摄取以维持正常代谢。EGT天然存在于某些蘑菇、细菌和真菌中，也可通过化学合成获得。然而，传统方法产量低、成本高，限制了其工业规模化应用。开发绿色、高效、经济的EGT生产替代方法已成为研究重点。重组酿酒酵母发酵生产EGT被认为是最具成本效益的直接方法，但此前尚无研究探索通过蛋白融合技术改造酿酒酵母提升EGT产量。
研究方法
2.1 试剂与培养基
Prime STAR Max DNA聚合酶和DNA Marker购自Takara（中国大连）；2 × Rapid Taq Master Mix（Vazyme，南京）用于菌落PCR验证。T4 DNA连接酶、T4 DNA聚合酶、DNA限制酶及Gibson组装酶NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix购自NEB（中国上海）；核酸染料和GenStar®质粒提取试剂盒购自Tsingke（中国北京）；DNA凝胶回收试剂盒购自Vazyme（中国南京）。基因合成、PCR引物合成及测序服务由Tsingke Biotechnology（中国福州）提供。EGT标准品购自Aladdin（中国上海）；用于制备LB培养基的蛋白胨和酵母提取物来自OXOID（英国）。用于YPD培养基制备的蛋白胨分别来自Sigma（德国）和Sangon Biotechnology（中国上海）。除非另有说明，所有其他试剂均为国产分析纯级。
【数据】试剂来源：Takara、Vazyme、NEB、Tsingke、Aladdin、OXOID、Sigma、Sangon Biotechnology；培养基：LB、YPD
2.2 质粒与菌株构建
来自粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的EGT1（NCBI参考序列：XP_956324.3）和来自麦角菌（Claviceps purpurea）的EGT2（GenBank：CCE33140.1）经密码子优化后由北京Tsingke Biotech Co., Ltd.合成。质粒所用启动子和终止子来源于Yeast EasyClone工具包。质粒构建采用Gibson多片段组装，通过限制酶酶切和测序验证构建成功。基因整合与敲除采用CRISPR/Cas9技术，引物针对目标基因及其同源侧翼序列设计，菌落PCR确认基因整合成功。egt1和egt2基因使用柔性连接肽融合，由强启动子TDH3驱动，通过Gibson多片段组装形成质粒pCSZ025和pCSZ066。同样地，Egt1和Egt2使用刚性连接肽融合并由TDH3启动子驱动，构建质粒pCSZ041和pCSZ043。此外，Egt1和Egt2使用螺旋形成连接肽a融合并由TDH3启动子驱动，生成质粒pCSZ067和pCSZ068。工程菌株酿酒酵母SZA014通过CRISPR-Cas9敲除Leu2基因构建，从而可使用该标记进行质粒表达筛选。工程酿酒酵母菌株使用250 μg/mL G418和100 μg/mL诺尔丝菌素硫酸盐筛选。本研究所用引物、质粒、菌株和DNA序列分别汇总于表S1、S2、S3和S4。
【数据】筛选浓度：250 μg/mL G418、100 μg/mL 诺尔丝菌素硫酸盐；启动子：TDH3；基因来源：粗糙脉孢菌EGT1、麦角菌EGT2
2.3 连接肽文库设计与融合酶构建
连接肽序列的设计对融合酶的结构稳定性、灵活性和催化效率起决定性作用。连接肽长度、构象柔性和氨基酸组成等关键参数需仔细考量以获得最佳性能。基于前期研究，从三大结构类别——柔性、刚性和螺旋形成——中选取了六种代表性连接肽（表S5）进行系统评估。该理性设计旨在构建并比较融合酶文库，以增强酶活性并提高EGT生产效率。
【数据】连接肽类别：柔性、刚性、螺旋形成；连接肽数量：6种
2.4 EGT1-EGT2嵌合构建体的AlphaFold建模
使用AlphaFold Server预测带有各种工程连接肽的EGT1-EGT2嵌合体的三级结构。FASTA格式的蛋白序列提交进行计算分析，所得模型以PDB文件下载，在ChimeraX中进行结构评估。结构柔性通过B因子（温度因子）分析评估，使用putty表示方式可视化，颜色梯度从深蓝色（低柔性）到黄色（高柔性）。
【数据】建模工具：AlphaFold Server；结构评估：ChimeraX；可视化：B因子putty表示
2.5 摇瓶及10 L生物反应器发酵生产EGT
将工程菌株单菌落接种至2 mL YPD液体培养基中，于220 rpm、30°C条件下过夜培养。随后将4%（v/v）的培养物转接至25 mL YPD液体培养基中，于30°C、220 rpm条件下培养72小时。摇瓶培养期间，系统优化关键培养基组分以增强EGT生成。具体评估了葡萄糖浓度（2% vs 4%）、不同蛋白胨来源（Sangon Biotechnology蛋白胨（CAS：73049-73-7）和Sigma蛋白胨（CAS：91079-40-2））以及L-半胱氨酸、L-甲硫氨酸和L-组氨酸的补充水平（各0.5%、1%和2%）的影响。随后进行组合优化实验，评估这些组分对EGT生物合成的协同效应。基于EGT滴度比较，确定最佳培养基配方，为细胞生长和高水平产物形成提供营养均衡的环境。
基于上述结果，进行10 L补料分批发酵。种子培养基含10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨和20 g/L葡萄糖。发酵培养基含10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、40 g/L葡萄糖、1 mL/L维生素和1 mL/L微量元素、40 mg/L吡哆醇和40 mg/L泛酸钙。补料培养基由800 g/L葡萄糖、80 g/L（NH4）2SO4、14.4 g/L KH2PO4、6.1 g/L MgSO4、30 mL/L微量元素、30 mL/L维生素、各0.5 g/L的Met、His和Cys、0.5 g/L吡哆醇和0.1 g/L泛酸钙组成。
EGT生产的补料分批发酵在10 L搅拌式生物反应器（镇江汇森生物设备有限公司）中进行，初始工作体积为7 L。发酵温度维持在30°C。葡萄糖补料阶段，溶氧（DO）控制在15–25%范围内——预实验表明该范围可在生物量积累与EGT生产之间达到最佳平衡。搅拌速度逐渐增加并维持在最高800 rpm以确保充足的氧气传递，通气率根据高密度酵母培养补料分批过程的标准氧传递需求在1–3 vvm之间调节。补料分批过程在培养开始后16小时启动，使用浓缩葡萄糖溶液维持反应器中的低葡萄糖浓度。添加消泡剂204（Sigma-Aldrich）防止泡沫形成，pH通过连续添加NaOH和H2SO4溶液进行调控。定期从发酵液中取样分析。
【数据】接种量：4%（v/v）；摇瓶体积：25 mL/250 mL；温度：30°C；转速：220 rpm；时间：72h；葡萄糖浓度评估：2% vs 4%；氨基酸补充：0.5%、1%、2%；种子培养基：10 g/L酵母提取物+20 g/L蛋白胨+20 g/L葡萄糖；发酵培养基：10 g/L酵母提取物+20 g/L蛋白胨+40 g/L葡萄糖+1 mL/L维生素+1 mL/L微量元素+40 mg/L吡哆醇+40 mg/L泛酸钙；补料培养基：800 g/L葡萄糖+80 g/L(NH4)2SO4+14.4 g/L KH2PO4+6.1 g/L MgSO4+30 mL/L微量元素+30 mL/L维生素+各0.5 g/L Met/His/Cys+0.5 g/L吡哆醇+0.1 g/L泛酸钙；反应器：10 L搅拌式；初始工作体积：7 L；温度：30°C；DO：15–25%；搅拌：最大800 rpm；通气率：1–3 vvm；补料启动时间：16h；消泡剂：antifoam 204
2.6 分析方法
取1 mL发酵液转移至1.5 mL EP管中，加入4–5颗小钢珠以辅助细胞破碎。样品先用液氮冷冻，然后用球磨机研磨。随后以13,000×g离心2分钟。上清液经0.22 μm水相滤膜过滤后进行HPLC分析EGT含量。HPLC方法基于已验证的方案稍作修改：洗脱液"A"为含0.1%（V/V）甲酸的双蒸水，洗脱液"B"为含0.1%（V/V）甲酸的乙腈。梯度如下：0–22分钟，2% B；22–37分钟，95% B；37–47分钟，2% B，各点之间线性变化。分离柱维持在35°C，流速0.2 mL/min，进样量2 μL。HPLC分析由HPLC U3000（Thermo）完成。
【数据】离心：13,000×g，2min；滤膜：0.22 μm；HPLC梯度：0–22min 2% B，22–37min 95% B，37–47min 2% B；柱温：35°C；流速：0.2 mL/min；进样量：2 μL；仪器：HPLC U3000（Thermo）
研究结果
3.1 酿酒酵母中EGT合成途径的构建与增强
在EGT生产中，egt1和egt2对合成过程至关重要（图1A）。本研究分别使用强启动子TDH3和TEF1构建egt1和egt2生物合成途径，并通过CRISPR-Cas9整合到酿酒酵母基因组中（图1B）。获得工程菌株SZC002，EGT滴度为19.78 mg/mL，OD600为51.05。通过整合两份表达盒，EGT产量进一步增加至33.46 mg/L，而工程菌株SZC003的生物量仅略有下降（OD600为50.17，图1C）。这两个基因在酿酒酵母中的共表达显著增强了EGT产量，这与先前其他研究的报道一致。
【数据】菌株SZC002：EGT滴度19.78 mg/mL，OD600=51.05；菌株SZC003：EGT产量33.46 mg/L，OD600=50.17；启动子：TDH3、TEF1；整合方式：CRISPR-Cas9
3.2 通过SAM循环优化增强EGT合成
EGT1是一种依赖SAM的酶，利用SAM作为甲基供体催化组氨酸转化为麦角硫因前体hercynine，副产物为S-腺苷同型半胱氨酸（SAH）（图2A）。鉴于SAM作为辅因子的关键作用，确保其充足的胞内可用性是提高EGT产量的关键。
#### 3.2.1 靶向SAM可用性的遗传改造
为减少SAM消耗并改善硫同化，首先敲除spe2（SAM脱羧酶基因）并在同一基因座整合MET14（甲基转移酶14基因），构建菌株SZC004。MET14过表达与酿酒酵母中硫氨基酸生物合成改善和谷胱甘肽产量增加相关。然而，与亲本菌株SZC003相比，SZC004的EGT滴度下降25%（25.17 mg/L），生物量也显著降低（OD600从50.17降至32.80）。随后额外敲除了erg4（甾醇C-24（28）还原酶基因）——该基因已被报道可减少SAM消耗。所得菌株SZC005的EGT产量提高至38.87 mg/L，OD600为36.70，表明调节SAM消耗途径可部分恢复EGT合成。
【数据】菌株SZC004：EGT 25.17 mg/L（下降25%），OD600=32.80；菌株SZC005：EGT 38.87 mg/L，OD600=36.70；基因操作：敲除spe2、erg4，整合MET14
#### 3.2.2 通过sod1敲除评估ATP供应
考虑到ATP水平对SAM生物合成的潜在影响，接下来敲除sod1（超氧化物歧化酶1基因）以增加细胞ATP可用性。与预期相反，所得菌株SZC006的EGT产量（9.29 mg/L）和生物量（OD600=36.08）均急剧下降，提示氧化应激或氧化还原平衡受损可能对细胞代谢产生不利影响。
【数据】菌株SZC006：EGT 9.29 mg/L，OD600=36.08；基因操作：敲除sod1
#### 3.2.3 通过乙酰-CoA增强重定向碳通量
为增强向同型半胱氨酸和SAM生产的碳通量，引入xfpk（磷酸酮醇酶）和pta（磷酸转乙酰酶）以增加胞内乙酰-CoA水平。然而，与SZC004相比，工程菌株SZC007的EGT滴度（16.60 mg/L）和生物量（OD600=32.52）均进一步降低（图2B）。这一意外结果可能反映了乙酰-CoA用于SAM生物合成与EGT前体合成代谢需求之间的权衡。总之，菌株SZC004至SZC007与亲本菌株SZC003相比均表现出生物量和EGT产量下降。这些结果表明，虽然SAM循环优化可以影响EGT合成，但SAM可用性、碳通量分布和细胞生长之间的相互作用对代谢工程策略施加了复杂约束。因此，仔细平衡辅因子供应和前体途径活性对于实现稳健的EGT生产至关重要。
【数据】菌株SZC007：EGT 16.60 mg/L，OD600=32.52；基因操作：引入xfpk和pta
3.3 蛋白融合工程增强EGT生产
尽管进行了途径优化和EGT1/EGT2过表达，工程菌株仅达到38.87 mg/L的EGT滴度，仍低于此前报道的滴度。为提高产量，探索了融合蛋白工程——一种通过结构域连接增强酶溶解度、稳定性和活性的策略。融合蛋白性能的关键决定因素是连接肽序列，必须在柔性和结构域分离之间取得平衡以维持催化功能。
#### 3.3.1 嵌合体优化的连接肽设计与评估
评估了来自三种结构类别的六种连接肽序列（表S5），在2μ质粒上表达，以确定其对EGT产量的影响（图3A和C）。所有连接肽均优于非融合对照，其中柔性连接肽FL1提升最大。表达Egt1–FL1–Egt2的菌株SZA022达到93.42 mg/L EGT——较对照（48.32 mg/L）提高93.3%——且生物量略有改善（OD600从31.07提高至34.95）。
【数据】菌株SZA022：EGT 93.42 mg/L，较对照提高93.3%；对照：48.32 mg/L；OD600：31.07→34.95；最优连接肽：FL1（柔性）
#### 3.3.2 连接肽功能的机制见解
旨在增强空间邻近性的酶融合可能通过促进有效的分子碰撞显著提高催化效率。FL1的优异性能可能源于其柔性结构——富含甘氨酸和丝氨酸的序列增强了催化效率。结构柔性通过B因子分布分析评估——B因子是反映蛋白质柔性的原子位移度量。在所测试的设计中，（Gly-Gly-Gly-Ser）三重重复序列表现出最高的柔性，在结构域分离和功能连接之间取得了最佳平衡，从而实现最佳催化活性。相比之下，螺旋形成连接肽（AEAAAKEAAAKEAAAKA）可能限制了酶构象和结构域运动性（图3BII），而半刚性PAPAP连接肽虽然维持了结构域独立性，但未能提供足够间距以实现最佳功能（图3BIII）。这些结构约束导致EGT产量低于FL1（图3BI）。
【数据】最优连接肽序列：（Gly-Gly-Gly-Ser）×3；螺旋形成连接肽：AEAAAKEAAAKEAAAKA；半刚性连接肽：PAPAP
#### 3.3.3 基因组整合提高稳定性与生产力
鉴于2μ质粒在非选择性发酵条件下的不稳定性，将多拷贝Egt1–FL1–Egt2表达盒稳定整合到酵母基因组中。所得菌株SZA011产生60.5 mg/L EGT——较非融合亲本菌株SZC003提高80.8%。生物量略有降低（OD600=43.13），可能归因于EGT生物合成增强带来的代谢负担，但整体生产力显著提高。
【数据】菌株SZA011：EGT 60.5 mg/L，较SZC003提高80.8%；OD600=43.13；整合方式：多拷贝基因组整合
#### 3.3.4 HapAmp系统高拷贝整合的影响
靶基因的基因组整合是合成生物学中建立稳定异源途径的广泛使用策略，拷贝数扩增常用于增强表达水平。先前研究表明双拷贝整合可显著提高EGT生物合成。然而，本研究发现酿酒酵母中过度的基因组整合会施加显著的代谢负担。虽然HapAmp系统可实现多达47个基因拷贝的整合，但观察到随着拷贝数增加EGT产量出现反常下降。例如，在RPL25基因座单拷贝整合的菌株SZA047产生27.81 mg/L EGT，携带两个拷贝的菌株SZA025达到47.61 mg/L——均低于中等整合水平的菌株SZA011所达到的60.5 mg/L。这种负相关表明高基因剂量诱导拷贝数依赖性代谢应激，对细胞生长和EGT合成均产生不利影响。为减轻这种负担，适应性实验室进化（ALE）提供了有前景的解决方案。ALE广泛应用于基础研究和工业菌株改良，有助于：（i）系统探索影响表型的进化约束…
【数据】菌株SZA047（单拷贝）：EGT 27.81 mg/L；菌株SZA025（双拷贝）：EGT 47.61 mg/L；菌株SZA011（中等拷贝）：EGT 60.5 mg/L；HapAmp系统最大整合：47拷贝
讨论与解读
本研究成功展示了多种工程策略在酿酒酵母中实现高水平从头合成EGT的应用。利用粗糙脉孢菌的egt1基因和麦角菌的egt2基因，结合代谢途径优化、蛋白融合技术和多拷贝基因整合，EGT滴度从菌株SZC002的19.78 mg/L逐步提升至菌株SZC005的38.87 mg/L。进一步通过酶融合工程和融合构建体（Egt1-FL1-Egt2）的稳定整合，菌株SZA011的滴度提高至60.5 mg/L，较非融合表达提升80.8%。培养基优化确定了含Sigma蛋白胨、0.5 mg/mL半胱氨酸/甲硫氨酸/组氨酸和4%葡萄糖的配方，使摇瓶EGT产量达到创纪录的122.5 mg/L——这是迄今酿酒酵母报道的最高值。最终，10 L生物反应器补料分批发酵使菌株SZA011在192小时后达到626.24 mg/L的惊人滴度，细胞干重56.42 g/L，OD600为204.3。
编译者解读：该研究的核心价值在于首次将蛋白融合技术系统引入酿酒酵母EGT合成——连接肽筛选不是经验试错，而是借助AlphaFold结构预测与B因子分析建立了"设计-验证-优化"的理性闭环。FL1柔性连接肽的93.3%提升幅度说明空间邻近效应对双酶级联的催化增益远超预期。值得关注的是，高拷贝整合反而导致产量下降这一"反直觉"现象，提示合成生物学中"拷贝数越多越好"的惯性思维需要重新审视——代谢负担与产物合成之间存在精细平衡点。从产业视角看，626 mg/L的滴度虽尚未达到商业化门槛，但整合ALE等策略后仍有显著提升空间。该工作为其他SAM依赖型天然产物的微生物合成提供了可迁移的方法学参考。
参考来源
Chen, S. (2025). Enhancing ergothioneine production in Saccharomyces cerevisiae via protein fusion technology and gene integration optimization. Food Bioscience, 106745. DOI: 10.1016/j.fbio.2025.106745
DOI: 10.1016/j.fbio.2025.106745