来源：Optimized co-fermentation strategy for efficient production of Dihydro-β-ionone from β-Ionol using engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae（Bioorganic Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
二氢-β-紫罗兰酮是高档香精、化妆品和食品领域的重要香料化合物，植物天然含量极低，化学合成路线复杂且污染严重。本研究构建了大肠杆菌—酿酒酵母双菌分工共培养体系：大肠杆菌模块负责将β-紫罗兰醇氧化为β-紫罗兰酮（最高产量884.62 mg/L，转化率44.2%），酿酒酵母模块负责将β-紫罗兰酮还原为二氢-β-紫罗兰酮（终产量829.71 mg/L，转化率41.45%）。通过将氧化与还原步骤分置于两种微生物宿主，显著降低了单一菌株的代谢负担。
研究背景
二氢-β-紫罗兰酮天然存在于桂花、葡萄和茶树等植物中，具有温暖木质和紫罗兰般的香气，是桂花精油的关键成分。除感官价值外，该化合物还表现出抗癌、抗炎和抗菌等药理活性。2023年全球市场估值约36.6亿美元，预计2033年达68.7亿美元。尽管年需求量达10至100吨，但天然提取因含量极低而成本高昂，化学合成仍是主要生产途径，现有合成路线存在诸多困难。因此，开发可持续的生物合成路线成为研究热点。
研究方法
2.1 化学试剂
β-紫罗兰醇、β-紫罗兰酮和二氢-β-紫罗兰酮购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州）。分子生物学试剂，包括异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、大观霉素、卡那霉素和氨苄青霉素，购自生工生物工程（上海）股份有限公司。高效液相色谱（HPLC）级溶剂，包括乙酸乙酯、甲醇和丙酮，购自Sigma-Aldrich（上海）。本研究中使用的其他试剂（均为分析纯）来自上述供应商或其他知名化学试剂公司。
【数据】试剂来源：Sigma-Aldrich、生工生物；IPTG、抗生素等购自生工生物；HPLC级溶剂购自Sigma-Aldrich
2.2 菌株与质粒构建
本研究所用菌株和质粒列于表S1。E. coli DH5α用于常规分子克隆，E. coli BL21 (DE3)用于蛋白表达和发酵实验。质粒按照标准分子克隆技术并根据制造商方案构建。寡核苷酸合成和DNA测序由生工生物（上海）完成。
【数据】克隆宿主：E. coli DH5α；表达宿主：E. coli BL21 (DE3)；测序与引物合成：生工生物
2.3 大肠杆菌产β-紫罗兰酮的培养条件
种子培养在Luria-Bertani（LB）培养基中进行，含10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L NaCl。产β-紫罗兰酮时，将种子培养液接种至250 mL摇瓶中的50 mL生产培养基中，于37°C、200 rpm条件下培养。为考察不同基础培养基和碳源的影响，使用了三种培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）、Terrific Broth（TB；12 g/L胰蛋白胨、24 g/L酵母提取物、9.4 g/L K₂HPO₄、2.2 g/L KH₂PO₄）和2YT（16 g/L胰蛋白胨、10 g/L酵母提取物、5 g/L NaCl）。TB和2YT培养基补充不同碳源（各10 g/L），包括甘油（Gly）、葡萄糖（Glu）、麦芽糖（Malt）、菊粉（Inu）、麦芽糊精（MD）、糊精（DEX）或蔗糖（SUC）。当培养物OD600达到0.6–1.0时，加入IPTG诱导蛋白表达。适当诱导时间后加入β-紫罗兰醇，继续发酵48 h。
【数据】培养基：LB（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）、TB、2YT；碳源浓度：10 g/L；接种量：50 mL/250 mL摇瓶；温度：37°C；转速：200 rpm；诱导OD600：0.6–1.0；发酵时间：48 h
2.4 蛋白表达与纯化
将质粒pET-28a-RiDBR1和pET-28a-EcDBR1转化至E. coli BL21 (DE3)获得重组菌株。菌株在LB培养基中过夜培养作为种子液，随后接种至含卡那霉素（100 mg/L）的培养基中，于37°C、200 rpm振荡培养。当OD600达到0.6–0.8时，加入0.1 mM IPTG，继续在30°C下培养8 h。通过离心（12,000 rpm，20 min，4°C）收集细胞，用1 × PBS（pH 7.4）洗涤两次，重悬于5 mL 1 × PBS（pH 7.4）中，冰上超声破碎。重组蛋白使用Ni亲和层析（Novagen）纯化。使用含递增浓度咪唑（50、100、200和400 mM）的洗脱缓冲液洗脱重组蛋白。酶纯度通过SDS-PAGE确认。蛋白定量使用Bradford蛋白检测试剂盒（Biogems，上海）。
【数据】抗生素：卡那霉素100 mg/L；诱导剂：0.1 mM IPTG；诱导温度：30°C；诱导时间：8 h；离心：12,000 rpm、20 min、4°C；洗脱咪唑浓度：50–400 mM
2.5 酿酒酵母培养条件
酵母培养使用YPD培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L d-葡萄糖）和缺乏色氨酸的合成完全缺陷培养基（SD-TRP，含2% d-葡萄糖）。从SD-TRP琼脂平板挑取单菌落，接种至相应SD-TRP液体培养基中进行培养。预培养物随后转移至含250 mL YPD液体培养基的1 L摇瓶中，于30°C、200 rpm振荡培养约24 h，直至酵母培养物OD600达到15。
【数据】YPD培养基：10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L d-葡萄糖；SD-TRP含2% d-葡萄糖；培养体积：250 mL/1 L摇瓶；温度：30°C；转速：200 rpm；时间：约24 h；终OD600：15
2.6 大肠杆菌—酿酒酵母共培养体系的构建
为利用大肠杆菌—酿酒酵母共培养体系生产二氢-β-紫罗兰酮，首先将IONE1-GDH菌株在最优条件下培养4–48 h。在选定的时间点，通过12,000 rpm离心10 min收集酿酒酵母细胞，用无菌水洗涤两次以去除残留培养基成分，将细胞沉淀调整至所需OD₆₀₀。洗涤后的酵母细胞直接重悬于第一步培养获得的大肠杆菌发酵液中，启动共培养。最终酵母接种密度调整至OD₆₀₀ 30至240之间。最后，大肠杆菌和酿酒酵母的混合物在30°C、200 rpm振荡条件下继续培养48 h。
【数据】大肠杆菌预培养时间：4–48 h；酵母离心：12,000 rpm、10 min；酵母接种OD₆₀₀：30–240；共培养温度：30°C；转速：200 rpm；共培养时间：48 h
2.7 分析方法
通过将乙醇稀释的发酵液在6800 ×g离心10 min获得培养上清液，用上清液进行产物定量。定量分析使用Agilent 1200高效液相色谱（HPLC）系统，配备Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（250 × 4.6 mm；5 μm粒径），柱温30°C。进样量10 μL，等度洗脱条件（70%乙腈和30%水），流速0.8 mL/min，运行30 min。β-紫罗兰醇和二氢-β-紫罗兰酮的检测波长为200 nm，β-紫罗兰酮为300 nm。使用β-紫罗兰酮和二氢-β-紫罗兰酮标准品构建校准曲线进行定量（R² > 0.999）。β-紫罗兰酮的检测限（LOD，信噪比=3）为0.15 mg/L，二氢-β-紫罗兰酮为0.18 mg/L；定量限（LOQ，信噪比=10）分别为0.50 mg/L和0.60 mg/L。通过在空白培养基中加标已知标准品测定回收率，β-紫罗兰酮为97.8 ± 1.6%，二氢-β-紫罗兰酮为96.5 ± 2.1%，表明分析方法准确可靠。
GC–MS验证时，使用固相微萃取（SPME）收集挥发性化合物。发酵瓶密封后在60°C孵育30 min，SPME纤维暴露于顶空后转移至GC–MS进样口进行解吸。GC–MS以氦气为载气，流速1.0 mL/min，不分流进样模式。GC–MS使用Thermo Finnigan Trace ISQ，配备DB-5MS色谱柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm）。EI电离设为70 eV，柱温箱从60°C经多步梯度程序升温至250°C。化合物鉴定基于与标准品的保留时间和质谱比对。
【数据】HPLC条件：C18柱、30°C、10 μL进样、70%乙腈/30%水、0.8 mL/min、30 min；检测波长：200 nm（β-紫罗兰醇/二氢-β-紫罗兰酮）、300 nm（β-紫罗兰酮）；LOD：0.15/0.18 mg/L；LOQ：0.50/0.60 mg/L；回收率：97.8 ± 1.6%/96.5 ± 2.1%；GC–MS：He载气1.0 mL/min、EI 70 eV、DB-5MS柱
研究结果
3.1 不同醇脱氢酶大肠杆菌菌株的β-紫罗兰酮生产工程
为建立高效的β-紫罗兰酮生物合成微生物平台，通过引入三种此前报道可催化β-紫罗兰醇或结构相关仲醇氧化的醇脱氢酶（ADH）基因，构建了三株大肠杆菌菌株。这些候选酶根据其对紫罗兰酮类底物的已知或推定催化活性进行选择。来自芳香新鞘氨醇菌（Novosphingobium aromaticivorans）的NaSDR（NCBI登录号WP_011906790）对空间位阻酮类具有广泛底物特异性；来自红平红球菌DSM 44541（Rhodococcus ruber DSM 44541）的DSMADH（WP_043801412.1）是一种稳健的NAD⁺依赖性氧化还原酶，能氧化脂肪族和芳香族仲醇，具有高溶剂耐受性；来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的AKR4C9（NP_001031505）属于植物醛酮还原酶4C亚家族，对羰基化合物具有广泛底物特异性，可作用于紫罗兰酮类中间体。比较这些酶可鉴定E. coli中β-紫罗兰醇氧化的最有效催化剂。
每株重组菌株在200 rpm振荡条件下与1 g/L β-紫罗兰醇共培养，评估其生产能力。其中，表达NaSDR的菌株表现出最高的生物转化效率，β-紫罗兰酮滴度达308.2 mg/L，其次为表达DSMADH的菌株（268.02 mg/L）。携带AKR4C9的菌株在相同条件下产物形成可忽略不计（图1a）。HPLC分析进一步验证了E. coli-NaSDR菌株的优越生产性能（图1b）。这些结果表明，表达NaSDR的大肠杆菌为后续优化步骤提供了最有效的生物催化底盘，因此被选为下游工艺开发的起始菌株。
【数据】底物浓度：1 g/L β-紫罗兰醇；转速：200 rpm；NaSDR菌株产量：308.2 mg/L；DSMADH菌株产量：268.02 mg/L；AKR4C9菌株产量：可忽略
3.2 质粒拷贝数与辅因子循环优化增强大肠杆菌β-紫罗兰酮生产
质粒拷贝数已知通过改变基因表达水平影响目标化合物生产效率。为评估其对β-紫罗兰酮生物合成的影响，将NaSDR基因组装到三种具有不同复制起点的质粒骨架中：pACYCDuet-1（低拷贝）、pCDFDuet-1（中拷贝）和pRSFDuet-1（高拷贝）。将这些构建体转化至E. coli BL21 (DE3)获得三株重组菌株。如图2a所示，携带pCDFDuet-NaSDR的菌株（命名为IONE1）获得最高β-紫罗兰酮产量。IONE2（pACYCDuet-NaSDR）产量略低，而携带高拷贝质粒pRSFDuet-NaSDR的菌株产量降低。尽管增加质粒拷贝数可提高基因剂量和表达水平，但往往通过转移代谢资源和诱导应激而损害宿主生理。此外，pRSFDuet-1等高拷贝载体的过表达可能导致NaSDR酶部分错误折叠或聚集，导致可溶性蛋白水平降低和催化活性下降，尽管转录输出更高。相反，低拷贝质粒可能产生不足的酶量以维持有效的底物周转。基于pCDFDuet-1的IONE1菌株在表达强度与细胞耐受性之间取得了有利平衡，在不过载宿主能力的情况下支持更有效的生物转化。虽然未定量可溶性NaSDR水平，但β-紫罗兰酮滴度提供了间接证据，表明IONE1中适度的表达水平足以确保有效的催化性能。
由于NADPH是该生物合成途径中的关键辅因子，进一步工程化辅因子再生途径以增强整体通量。将四种此前在大肠杆菌系统中报道的NADPH再生酶分别引入途径中。为确保质粒兼容性和稳定基因表达，编码这些再生酶的基因被克隆到pETDuet-1载体中，该载体具有ColE1复制起点和T7启动子。β-紫罗兰酮生产大肠杆菌菌株的构建策略总览如图2c所示，突出展示了用于酶表达和辅因子再生的质粒模块化整合。在构建的菌株中，共表达NaSDR和葡萄糖脱氢酶（GDH）的IONE1-GDH表现出最高β-紫罗兰酮滴度376.13 mg/L（图2b）。SDS-PAGE分析确认了IONE1-GDH中两种蛋白的成功共表达（图S1）。该菌株因此被选为后续途径工程中β-紫罗兰醇至β-紫罗兰酮转化模块的最佳候选菌株。
【数据】质粒骨架：pACYCDuet-1（低拷贝）、pCDFDuet-1（中拷贝）、pRSFDuet-1（高拷贝）；IONE1-GDH最高产量：376.13 mg/L
3.3 发酵条件优化提升β-紫罗兰酮产量
为进一步提高β-紫罗兰酮滴度，对工程菌株IONE1-GDH的发酵条件进行了系统优化。碳源在微生物代谢中起关键作用，既是能量提供者，也是生物量和产物合成的前体。鉴于菌株对碳底物的特异性偏好，评估了不同培养基和碳源。在测试条件下，LB培养基持续支持最高β-紫罗兰酮产量，表明其适合IONE1-GDH菌株（图3a）。
接下来，优化了底物添加前的培养参数，包括诱导温度、IPTG浓度、诱导OD600和诱导持续时间。如图3b–e所示，最佳发酵方案为：在OD600 ≈ 1.0时以0.2 mM IPTG于30°C诱导24 h，随后补充β-紫罗兰醇。在此条件下，β-紫罗兰酮滴度达396.78 mg/L。IPTG浓度超过此水平后，产物产量逐渐下降，可能是由于过表达引起的代谢负担。这些结果表明，培养基组成和诱导参数都显著影响生产菌株的性能。微调这些条件可在维持细胞活力和代谢平衡的同时有效提高产物产量。
底物添加后，进一步优化发酵温度以提高IONE1-GDH菌株的β-紫罗兰酮产量。30°C——大肠杆菌萜类生物合成中常用的温度——被确认为该过程的最适温度（图4a）。随后，评估底物浓度的影响以确定底物可用性与宿主代谢能力之间的最佳平衡。如图4b所示，在底物浓度为2 g/L时获得最高β-紫罗兰酮滴度和转化效率。在此条件下，IONE1-GDH菌株在摇瓶培养中产生884.62 mg/L的β-紫罗兰酮，对应最大摩尔转化率44.2%。为进一步确认产物身份，对发酵液进行了GC–MS分析（图4c和图S2）。观察到β-紫罗兰酮的特征峰（红色箭头标示），确认了从β-紫罗兰醇的成功生物转化。此处获得的β-紫罗兰酮产量显著超过此前大肠杆菌中从头合成方法的结果，凸显了模块化优化策略的有效性。工程菌株IONE1-GDH因此被选用于下游共培养发酵和二氢-β-紫罗兰酮生物合成。
【数据】最佳诱导条件：OD600≈1.0、0.2 mM IPTG、30°C、24 h；此条件下产量：396.78 mg/L；最适底物浓度：2 g/L；最高产量：884.62 mg/L；最大摩尔转化率：44.2%
3.4 二氢-β-紫罗兰酮生产菌株筛选
在烯还原酶家族中选择了三个DBR候选基因，代表不同的进化起源和底物偏好。来自青蒿（Artemisia annua）的AaDBR1被选为已知的β-紫罗兰酮还原酶，此前已在本课题组得到验证；来自覆盆子（Rubus idaeus）的RiDBR1（NCBI：AEL78825.1）参与覆盆子酮生物合成，还原结构与β-紫罗兰酮相似的4-羟基苯丙酮；来自加拿大飞蓬（Erigeron canadensis）的EcDBR1（NCBI：XP_0...
（注：原文结果部分在EcDBR1处截断，后续内容原文未提供完整节选）
【数据】DBR候选：AaDBR1（青蒿）、RiDBR1（覆盆子，NCBI：AEL78825.1）、EcDBR1（加拿大飞蓬，NCBI：XP_0...）；原文未详述后续筛选数据
讨论与解读
本研究通过将氧化与还原功能模块分置于大肠杆菌和酿酒酵母两种微生物宿主，成功实现了从β-紫罗兰醇到二氢-β-紫罗兰酮的两步级联生物转化。大肠杆菌模块经系统优化后，β-紫罗兰酮产量达884.62 mg/L（转化率44.2%）；整合酿酒酵母模块后，终产物二氢-β-紫罗兰酮产量达829.71 mg/L（转化率41.45%），均显著优于此前报道的生物合成方法。两种微生物之间的功能分工降低了单一菌株的代谢负担，该模块化共培养框架不仅提升了合成效率，还为工业化生物生产提供了适应性平台，尤其与补料分批或生物反应器操作等放大策略兼容。
编译者解读
该研究的关键设计在于将两步氧化还原反应拆解到两种菌株中，避免了单一宿主内多酶过表达带来的代谢冲突。大肠杆菌模块中引入GDH实现NADPH再生、酿酒酵母模块利用内源Pos5p支持还原反应，体现了辅因子平衡在级联催化中的核心地位。然而，两步转化总收率（41.45%）仍受限于中间产物跨膜运输和底物毒性的潜在瓶颈。未来若能在共培养比例动态调控和底物流加策略上进一步优化，该双菌体系有望成为萜类香料化合物生物合成的通用平台。
参考来源
Ke K. Optimized co-fermentation strategy for efficient production of Dihydro-β-ionone from β-Ionol using engineered Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae. Bioorganic Chemistry, 2026. DOI: 10.1016/j.bioorg.2026.109469
DOI: 10.1016/j.bioorg.2026.109469