来源：Rational metabolic engineering of Escherichia coli for the industrial-scale production of l-phenylalanine（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
L-苯丙氨酸（l-PHE）是药物合成与复合氨基酸输液的重要原料。实验室规模的代谢工程策略往往难以直接移植到工业菌株上。本研究以酪氨酸营养缺陷型菌株PHE07为底盘，综合运用CRISPR/Cas9基因组编辑、启动子工程、中心碳代谢重塑、全局转录因子改造及副产物途径鉴定等手段，历经多轮迭代改造，最终获得工业级生产菌株PHE17，其l-PHE产量达103.15 g/L，产率0.229 g/g，为迄今报道的最高水平。
研究背景
L-苯丙氨酸在复合氨基酸输液中扮演关键角色，也是多巴胺、甲状腺素等药物的合成前体。借助代谢工程手段，在实验室条件下改造模式菌株（如大肠杆菌W3110或谷氨酸棒杆菌）获得高产l-PHE菌株已非难事。但这一策略对已在工业规模运行的起始菌株往往收效甚微。合成生物学工具——包括表征明确的酶元件、调控单元与组学技术——的整合，正在降低工业菌株开发成本、提升开发效率。l-PHE的生物合成途径包含分支酸途径与l-PHE特异分支，受反馈调控、阻遏和衰减等多重调控机制约束。已有研究通过解除关键酶调控、改造全局调控因子等手段促进l-PHE合成，但工业规模下的系统改造策略仍属空白。本研究旨在通过多维度理性改造，实现工业级l-PHE产量与产率的同步突破。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究所用质粒与菌株详见补充材料。大肠杆菌DH5α用于质粒构建。l-PHE生产宿主菌株为L-酪氨酸营养缺陷型菌株PHE07（见补充材料）。基因组编辑及突变文库的染色体整合采用CRISPR/Cas9工具完成。
【数据】宿主菌株：PHE07（L-酪氨酸营养缺陷型）；克隆宿主：E. coli DH5α；编辑工具：CRISPR/Cas9
2.2 CRISPR/Cas9辅助的基因工程改造
#### 2.2.1 基因敲除与过表达突变株的构建
为敲除zwf、tktA、tktB、pykF、yhhY、aspA、mhpA和adhE基因，将含有相应N20序列及重组臂的pTargetF质粒导入经遗传修饰的大肠杆菌中，以识别并切割靶基因。aroFfbr、pheAfbr、aroD、aroE-aroL、pckA和pta基因片段从宿主菌株PHE07的基因组DNA扩增获得；异源基因xfspK和pyc分别从青春双歧杆菌和谷氨酸棒杆菌的基因组DNA扩增。为整合这些基因，将携带靶基因、相应N20序列及重组臂的pTargetF质粒导入工程大肠杆菌。如前人报道，基因表达水平受其基因组位置影响。为实现稳定的基因表达，将ParoF-aroFfbr-PpheA-pheAfbr和ParoE-aroE-ParoD-aroD基因片段分别整合至dadX-cvrA和thrW-ykfN的基因间区。最后，以pTarget-rpoS和pTarget-tyrA为模板，使用相应突变引物进行体外循环扩增，实现rpoS和tyrA基因的定点突变，随后将所得质粒转化入受体菌。本研究所用引物与质粒列于补充材料。
【数据】敲除基因：zwf、tktA、tktB、pykF、yhhY、aspA、mhpA、adhE；整合基因：aroFfbr、pheAfbr、aroD、aroE-aroL、pckA、pta、xfspK（源自B. adolescentis）、pyc（源自C. glutamicum）；整合位点：dadX-cvrA、thrW-ykfN基因间区；突变基因：rpoS、tyrA
#### 2.2.2 启动子变体文库的基因组整合与筛选
为将靶基因与不同强度的启动子（PJ23100：高表达；PJ23107：中表达；PJ23105：低表达）随机组合，将插入片段（左融合臂-启动子变体文库-靶基因-终止子-右融合臂）与pTargetF载体通过Gibson Assembly® Master Mix体外融合。随后样品于50°C孵育60 min。孵育后置于冰上以备转化。之后将孵育产物转化至感受态DH5α细胞。培养15 h后提取质粒文库，转化至l-PHE生产宿主菌株，生成启动子变体突变株。突变株随后利用l-PHE生物传感器进行胞内代谢物分析筛选与表征，同时采用HPLC进行胞外代谢物检测。
【数据】启动子：PJ23100（高）、PJ23107（中）、PJ23105（低）；组装方法：Gibson Assembly®；孵育温度：50°C；孵育时间：60 min；培养时间：15 h；筛选工具：l-PHE生物传感器 + HPLC
2.3 结构分析与分子对接研究
TyrA催化分支酸转化为预苯酸，并随后催化预苯酸的NAD+依赖性氧化脱羧。目前已有多种TyrA晶体结构可供利用，如流感嗜血杆菌RD的TyrA（PDB: 2PV7）、嗜热产水菌的TyrA（PDB: 2G5C）以及集胞藻PCC 6803的syTyrA（PDB: 2F1K），但大肠杆菌TyrA的晶体结构尚未被解析。因此，以流感嗜血杆菌RD TyrA晶体结构为模板，利用Modeller v9.24构建EcTyrA同源模型。结构比对使用PyMol完成。柔性配体L-酪氨酸通过AutoDock Vina（整合于Chimera中）对接至EcTrpA蛋白。
【数据】模板结构：H. influenzae RD TyrA（PDB: 2PV7）；建模软件：Modeller v9.24；对接软件：AutoDock Vina（Chimera内置）；配体：L-酪氨酸
2.4 荧光强度测定
为筛选l-PHE高产菌株，使用由mtr启动子（Pmtr）驱动的l-PHE生物传感器检测l-PHE，以红色荧光蛋白（RFP）作为报告基因。携带l-PHE生物传感器的突变株在LB培养基中过夜培养后离心收集。每个突变株用新鲜培养基洗涤三次以去除残留培养基。随后，将等量细胞接种至50 mL锥形管中的5 mL M9培养基中。孵育10 h后，使用多功能酶标仪进行荧光分析。每个培养物用PBS缓冲液洗涤三次后，使用Tecan M200 PRO在540 nm激发波长下测定RFP荧光。计算每个培养物的培养基荧光单位（MFU）以量化荧光强度。
【数据】生物传感器：Pmtr启动子驱动RFP；培养基：LB（过夜）、M9（5 mL，50 mL锥形管）；孵育时间：10 h；激发波长：540 nm；仪器：Tecan M200 PRO
2.5 发酵条件
种子培养基与发酵培养基按前人描述配制。批次发酵在250 mL锥形瓶中进行，每瓶含25 mL发酵培养基，按5%（v/v）接种种子培养物。所有发酵在37°C、250 rpm条件下运行45 h。补料分批发酵在BLBIO-30SJ-30SJ-50SJ-50SJ发酵罐（百仑生物科技，上海）中进行，初始装液量20 L。初始葡萄糖浓度设定为20 g/L，发酵过程中通过补加700 g/L葡萄糖将其维持在1–5 g/L范围内。使用25%氨水维持pH 6.8，溶氧（DO）水平保持在40%–50%饱和度。
【数据】批次发酵：250 mL锥形瓶、25 mL培养基、5%（v/v）接种量、37°C、250 rpm、45 h；补料分批发酵：BLBIO-30SJ-30SJ-50SJ-50SJ发酵罐、初始装液20 L、初始葡萄糖20 g/L、维持1–5 g/L、补糖浓度700 g/L、pH 6.8（25%氨水）、DO 40%–50%
2.6 代谢物分析与统计分析
根据PHE12在450吨工业规模发酵中的生长曲线，在10、20和40 h分别取样制备代谢物提取液，每个时间点设六次重复。用于LC-MS分析的代谢物提取按前人方法进行。极性代谢物分析采用超高效液相色谱（UHPLC）系统（Vanquish，Thermo Fisher Scientific），配Waters ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱（2.1 mm × 100 mm，1.7 μm）及Orbitrap Exploris 120质谱仪（Orbitrap MS，Thermo）。代谢物鉴定使用R包及BiotreeD（版本3.0）。l-PHE、莽草酸、DHS和奎尼酸浓度采用HPLC定量，使用InfinityLab Poroshell 120 SB-C18色谱柱（4.6 × 150 mm，5 μm；Agilent Technologies, Inc.）。数据统计比较采用ANOVA分析，显著性差异通过Tukey-t检验评估（P < 0.05）。所有分析使用GraphPad Prism 9.0软件完成。
【数据】取样时间点：10、20、40 h；重复数：6次/时间点；LC-MS系统：Vanquish UHPLC + Orbitrap Exploris 120；色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide（2.1 × 100 mm，1.7 μm）；HPLC色谱柱：InfinityLab Poroshell 120 SB-C18（4.6 × 150 mm，5 μm）；统计方法：ANOVA + Tukey-t检验（P < 0.05）；软件：GraphPad Prism 9.0
研究结果
3.1 l-PHE生物合成途径关键靶点的优化
#### 3.1.1 共表达aroFfbr与pheAfbr基因以缓解反馈调控
工业规模的l-PHE生产仍面临重大挑战，主要因其生物合成途径受到广泛调控，包括反馈调控、转录抑制与衰减以及全局调控（图1a）。为提升l-PHE产量，考察了在亲本菌株PHE07中过表达反馈抗性基因变体aroFfbr与pheAfbr的联合效果。为此，首先通过CRISPR/Cas9系统将DNA片段ParoF-aroFfbr-PpheA-pheAfbr整合至PHE07菌株染色体，构建菌株PHE08。随后通过补料分批发酵比较PHE08与PHE07的性能（图1b和1c）。如图1b所示，PHE08菌株的生长趋势与PHE07相当。值得注意的是，高生物量积累可在稳定期带来高l-PHE生成（图1c）。然而，PHE08仅产生77.15 ± 1.58 g/L的l-PHE，较PHE07（74.01 ± 1.60 g/L）仅提高4.24%。此外，与PHE07相比，PHE08中aroFfbr与pheAfbr的共过表达并未显著影响l-PHE的比生产速率。这种效果不佳可能归因于AroFfbr酶在将中心碳代谢流导向分支酸合成途径方面的强度不足，或PheAfbr酶无法有效驱动中间体流向l-PHE生物合成。因此，PHE08菌株中aroFfbr与pheAfbr的共过表达可能导致代谢通量失衡。对aroFfbr与pheAfbr共过表达的研究揭示了发酵结束时PHE07和PHE08菌株中关键中间体（如3-脱氢奎尼酸（DHQ）、3-脱氢莽草酸（DHS）、莽草酸（SIK）和分支酸（CHA））的积累。如图1d所示，与PHE07相比，PHE08中DHQ和DHS的积累量急剧增加，分别达到3.48 g/L和5.84 g/L。此外，PHE08菌株中SIK和CHA的积累仍维持高浓度。这证实了PHE08菌株中aroFfbr与pheAfbr的共过表达导致了代谢通量失衡。因此可以预期，若能消除中间体的积累，将有望实现更高的产量。
【数据】PHE08产量：77.15 ± 1.58 g/L；PHE07产量：74.01 ± 1.60 g/L；提高幅度：4.24%；DHQ积累：3.48 g/L（PHE08）；DHS积累：5.84 g/L（PHE08）
#### 3.1.2 共过表达aroE与aroD基因以消除中间体积累
PHE08菌株中DHQ和DHS的积累提示AroD和AroE酶活性不足。因此，在PHE08菌株中考察了两个基因的共过表达效果。如图1b和1c所示，PHE09菌株在58 h发酵中产生80.84 ± 2.50 g/L的l-PHE，生产率为1.43 g/L/h。与PHE08相比，PHE09菌株中3-脱氢奎尼酸（DHQ）和3-脱氢莽草酸（DHS）的浓度显著降低，分别为1.78 g/L和2.24 g/L。然而，发酵结束时分支酸（CHA）出现显著积累（图1d）。这一结果表明，aroD与aroE的共过表达未能有效将中间体分支酸导向l-PHE生物合成途径。如图2a所示，采用启动子工程动态调控aroD、aroE、aroFfbr和pheAfbr的表达，以实现分支酸通用途径与l-PHE生物合成途径之间的最佳碳通量平衡。
【数据】PHE09产量：80.84 ± 2.50 g/L；生产率：1.43 g/L/h；发酵时间：58 h；DHQ浓度：1.78 g/L；DHS浓度：2.24 g/L
#### 3.1.3 四个关键基因的启动子工程实现通量平衡
为将靶基因与不同强度启动子（PJ23100：高表达；PJ23107：中表达；PJ23105：低表达）随机组合，使用Gibson Assembly试剂盒将靶基因片段与启动子片段进行体外随机融合。所得组合文库随后通过CRISPR/Cas9系统整合至PHE07/pCas9染色体（图2a）。随后，利用l-PHE生物传感器（pBR332 pmtr-RFP）进行体内评估，并结合HPLC进行体外检测，对突变株进行筛选与表征（图2b）。经过初筛，共随机选取372个菌落，在96深孔板中培养。培养15 h后，测定荧光强度与细胞生长，结果以热图呈现（见补充材料）。其中，150个荧光强度较高的突变株被分离用于启动子测序。序列分析揭示了150个候选株中存在30种不同的组合（图2b）。随后，所有突变株均进行了摇瓶批次发酵（图2b）。如图2b所示，所选突变株PO30在所有突变株中展现出最高的l-PHE产量。为验证这一结果，对突变株PO30（即PHE10，见补充材料）和PHE07进行了补料分批发酵（图2c和2d）。如图2d所示，在整个发酵周期内，PHE10菌株的l-PHE产量显著高于对照菌株。发酵结束时，PHE10产生88.26 ± 2.00 g/L的l-PHE，较对照PHE07提高19.25%。如图1d所示，PHE10菌株中DHQ和DHS的浓度显著降低，分别达到0.68 g/L和0.85 g/L，较PHE07分别降低5.12倍和6.87倍。此外，与PHE09相比，PHE10菌株中CHA滴度降低0.49 g/L，达到2.08 g/L。启动子工程实现通量平衡是优化代谢途径的有力手段，可广泛应用于各类生物技术场景。基因表达的精确控制能够提升目标化合物产量并改善整体细胞性能。如本研究所示，借助启动子工程，通过动态调控四种关键酶的表达，PHE10中的中间体成功从分支酸途径重定向至l-PHE分支途径。然而，PHE10的产率（0.207 g/g）相对于最大理论产率（0.489 g/g）仍偏低。值得注意的是，对工业规模生产而言，更高的产率比单纯提高产量更具吸引力。因此，为提高产率，不仅需要过表达l-PHE生物合成途径中的关键酶，还需考虑中心碳代谢的工程改造。该策略旨在避免碳资源损失（如CO2），阻断前体消耗途径，从而将碳通量重定向至l-PHE生物合成途径。
【数据】筛选菌落数：372；荧光较强突变株数：150；启动子组合数：30；PHE10产量：88.26 ± 2.00 g/L；较PHE07提高：19.25%；DHQ浓度：0.68 g/L（降低5.12倍）；DHS浓度：0.85 g/L（降低6.87倍）；CHA滴度：2.08 g/L（较PHE09降低0.49 g/L）；PHE10产率：0.207 g/g；理论最大产率：0.489 g/g
3.2 中心碳代谢的改造与动态调控
本研究的目标是重新分配中心代谢途径（如三羧酸循环、糖酵解途径和磷酸戊糖途径）的通量，在减少CO2排放的同时增加胞内PEP和E4P库，从而确保充足的产率。
#### 3.2.1 设计不依赖NADPH的磷酸戊糖途径以减少CO2排放
l-PHE的生物合成是一个多步酶促反应过程。
【数据】原文未详述
3.3 潜在副产物途径的鉴定与改造
【数据】原文未详述
3.4 全局调控因子的鉴定与工程改造
【数据】原文未详述
3.5 菌株的最终整合与验证
【数据】原文未详述
【数据】原文未详述
讨论与解读
本研究通过系统的理性代谢工程策略，成功构建了工业级l-PHE高产菌株PHE17。该菌株在不补充酪氨酸的条件下，l-PHE积累量达103.15 g/L，产率0.229 g/g，为目前大肠杆菌产l-PHE的最高报道水平。研究首次报道了工业l-PHE生产菌株的迭代工程策略，为其他芳香族氨基酸工业菌株的改造提供了重要参考。从合成生物学应用角度看，本研究的核心价值在于将实验室成熟的CRISPR/Cas9编辑、启动子工程与生物传感器筛选等工具系统整合到工业菌株开发流程中，并引入了不依赖NADPH的磷酸戊糖途径等创新设计。研究同时揭示了一个重要问题——单一过表达关键基因可能引发代谢通量失衡（如PHE08中DHQ和DHS积累），而动态调控才是解决通量分配的有效手段。不足之处在于，部分中间改造步骤的代谢物数据在原文节选中未完整呈现，且工业规模放大的可重复性仍需更多独立验证。
参考来源
Chen M. Rational metabolic engineering of Escherichia coli for the industrial-scale production of l-phenylalanine. Bioresource Technology, 2025. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132325
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132325