来源：De novo synthesis of (+)-nootkatone in Escherichia coli using stress-response dynamic regulatory system（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
(+)-诺卡酮是一种高价值的葡萄柚来源倍半萜化合物，在食品调味和生物防治领域应用广泛。本研究在大肠杆菌中构建了完整的(+)-诺卡酮从头生物合成途径，通过筛选FPP合酶和细胞色素P450酶、引入FPP响应型动态调控系统（P_gadE和P_rstA）、优化启动子及补料分批策略，最终将(+)-诺卡酮产量提升至165.1 mg/L，较静态调控提高15倍。该研究为CYP450介导的萜类化合物生物合成提供了新范式。
研究背景
(+)-诺卡酮是一种具有特征性葡萄柚-柑橘香气的倍半萜化合物，源自努特卡柏木心材，是经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的高价值调味剂，广泛用于柑橘风味食品和生物防治领域。其抗癌和呼吸系统疾病预防特性也引起了制药工业的浓厚兴趣。此外，美国环境保护署（EPA）认定诺卡酮为具有抗菌特性的环境友好型杀虫剂。
目前诺卡酮的生产主要依赖果皮提取，大规模植物生产面临地理和季节性限制。传统化学合成使用环境不可持续的重金属催化剂，这促使微生物生物合成诺卡酮成为有前景的替代方案。微生物中的萜类合成利用甲羟戊酸途径（MVA）和经典的2-C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸（MEP）途径。甘油可代谢为乙酰辅酶A（Ac-CoA）或甘油醛3-磷酸（G3P）和丙酮酸（PYR）（图1）。MVA途径从Ac-CoA起始，产生异戊烯基焦磷酸（IPP）。
研究方法
2.1 化学试剂与培养基
酶（DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、T4多核苷酸激酶和限制性内切酶）购自Takara（中国大连）。ClonExpressII一步克隆试剂盒购自Vazyme（中国南京）。Universal Gene Technology Co., Ltd.（中国天津）合成了所有基因，Sangon Biotech（中国上海）合成了所有引物。Macklin（中国上海）提供(+)-戊仑烯和(+)-诺卡酮标准品。
【数据】试剂来源：Takara、Vazyme、Universal Gene Technology、Sangon Biotech、Macklin；标准品：(+)-戊仑烯、(+)-诺卡酮
2.2 质粒、菌株与培养条件
引物、质粒、菌株和基因详见Table S1。蛋白质针对大肠杆菌进行了密码子优化。大肠杆菌Top 10用于克隆，大肠杆菌BW25113用于生产(+)-戊仑烯和(+)-诺卡酮。质粒通过Gibson组装或标准方案组装。用于质粒构建的细胞在Luria–Bertani（LB）培养基（10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10 g/L氯化钠，含适当抗生素）中培养。
萜类生产使用Terrific Broth（TB）培养基（1%甘油、12 g/L胰蛋白胨、24 g/L酵母提取物、9.4 g/L K₂HPO₄和2.2 g/L KH₂PO₄），添加适当抗生素，以1%（v/v）LB过夜培养物接种。培养物在37°C、250 rpm条件下培养至OD₆₀₀达到0.8–1.0，然后用0.5 mmol/L异丙基β-d-1-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，并补充0.5 mmol/L 5-氨基乙酰丙酸和0.1 μM FeSO₄以支持CYP450表达。诱导后，采用含10%（v/v）正十二烷的双相培养系统，在25°C、200 rpm条件下发酵72小时。
【数据】LB培养基：10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L氯化钠；TB培养基：1%甘油、12 g/L胰蛋白胨、24 g/L酵母提取物、9.4 g/L K₂HPO₄、2.2 g/L KH₂PO₄；接种量：1%（v/v）；培养温度：37°C；转速：250 rpm；诱导OD₆₀₀：0.8–1.0；IPTG浓度：0.5 mmol/L；5-氨基乙酰丙酸：0.5 mmol/L；FeSO₄：0.1 μM；正十二烷：10%（v/v）；发酵温度：25°C；发酵转速：200 rpm；发酵时间：72 h
2.3 产物与生物量分析
样品在25°C下以12,000 rpm离心10分钟，分析上清液。气相色谱-质谱联用（GCMS-QP2010SE；Shimadzu）使用DB-5色谱柱（30 m × 0.25 mm内径，df = 0.1 μm），配备HS-20顶空自动进样器。MS以FAAST（Fast Automated SCAN/SIM Type）模式运行。GC-MS参数为：进样器50°C；分流比10:1；氮气载气流速1.5 mL/min；柱温箱100°C（5分钟）以10°C/min升至250°C（8分钟）；MS传输线250°C；离子源230°C。
(+)-戊仑烯和(+)-诺卡酮使用GC-FID系统（Agilent 7890A；Agilent Technologies）定量，配备HP-5色谱柱（30 m × 0.32 mm × 0.25 μm），条件如下：柱温箱100°C（10分钟）以10°C/min升至200°C（8分钟）；进样器250°C；检测器300°C；分流比30:1。通过比较保留时间、保留指数和质谱图与标准品确认(+)-戊仑烯和(+)-诺卡酮的鉴定（Fig. S1）。使用外标曲线定量(+)-戊仑烯和(+)-诺卡酮浓度。
【数据】离心：12,000 rpm、10 min、25°C；GC-MS色谱柱：DB-5（30 m × 0.25 mm内径，df = 0.1 μm）；进样器温度：50°C；分流比：10:1；载气流速：1.5 mL/min；柱温程序：100°C（5 min）→250°C（8 min），10°C/min；传输线：250°C；离子源：230°C；GC-FID色谱柱：HP-5（30 m × 0.32 mm × 0.25 μm）；柱温程序：100°C（10 min）→200°C（8 min），10°C/min；进样器：250°C；检测器：300°C；分流比：30:1
2.4 活性氧（ROS）测定
使用Beyotime（中国上海）的活性氧检测试剂盒测定细胞内活性氧（ROS）水平。非荧光DCFH-DA（2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯）可渗透进入细胞，最终被ROS氧化为荧光性的2′,7′-二氯荧光素（DCF）。大肠杆菌细胞在10 μmol/L DCFH-DA中于37°C孵育20分钟。用磷酸盐缓冲液洗涤细胞三次以去除残留的DCFH-DA。使用荧光分光光度计监测细胞悬液的荧光强度（激发=488 nm，发射=525 nm）。细胞ROS水平以细胞生长归一化（RFU/OD₆₀₀），作为细胞DO水平的代理指标，并与CYP450活性相关。
【数据】DCFH-DA浓度：10 μmol/L；孵育温度：37°C；孵育时间：20 min；洗涤次数：3次；激发波长：488 nm；发射波长：525 nm；归一化方式：RFU/OD₆₀₀
2.5 统计分析
使用SPSS 27.0进行数据分析，采用方差分析（ANOVA）、最小显著性差异（LSD）检验和t检验确定显著性差异。在95%置信水平（P < 0.05）下确定显著性差异。所有测量均进行三次重复。
【数据】统计软件：SPSS 27.0；显著性水平：P < 0.05；重复次数：3次
研究结果
3.1 大肠杆菌中(+)-诺卡酮的从头合成
我们首先筛选了两种FPP合酶用于生产(+)-戊仑烯。菌株C01携带MVA途径酶、ispA（来自大肠杆菌）和CnVS，(+)-戊仑烯产量达到102.8 mg/L（图2左图）。来自酿酒酵母的Erg20F96W在我们先前研究中表现出优于野生型Erg20的性能（Zhang et al., 2022），产量达到51.3 mg/L（菌株C02）。
为在大肠杆菌中从头合成(+)-诺卡酮，我们评估了四种CYP450：P450cam（来自恶臭假单胞菌）、P450BM3（来自巨大芽孢杆菌）、CYP109B1（来自枯草芽孢杆菌168菌株）、HPO（来自灰毛莨）。HPO需要共表达来自拟南芥的细胞色素P450还原酶（AtCPR）。为减轻CYP450 N端在大肠杆菌（缺乏内部膜结构）中的潜在屏障效应，我们截短了HPO和AtCPR的预测N端信号/锚定片段（SignalP 6.0；Fig. S2），并在其N端融合了八残基牛肽（8RP），以增强工程化酶的亲水性（Fig. S3）。
将六种CYP450变体引入菌株C01，定量(+)-诺卡酮产量。P450cam F89V,Y98F,L246A变体（Sowden et al., 2005）（菌株CP01）产生的(+)-诺卡酮产量最高，达到10.7 mg/L（图2右图），紧随其后的是P450cam F89V,Y98F,V249L（菌株CP02），产量为9.6 mg/L。P450BM3 R48L,Y52F,F88A和CYP109B1的产量约为5.3 mg/L。相反，野生型和截短型植物来源的HPO和AtCPR均未产生可检测的(+)-诺卡酮。大肠杆菌中缺乏专门的(+)-诺卡醇脱氢酶导致(+)-诺卡酮水平极低，这与先前关于HPO的研究结果相似（Wang et al., 2010, 2016）。进一步筛选(+)-诺卡酮脱氢酶可能会鉴定出使用HPO/AtCPR产生(+)-诺卡酮的菌株。然而，目前的实验设计无法区分膜定位问题和脱氢酶限制，而现有的原核CYP450（P450cam）在(+)-诺卡酮生产中已显示出优势。因此，P450cam F89V,Y98F,L246A被证明是大肠杆菌中最活跃的(+)-诺卡酮氧化酶，并用于后续实验。
不同CYP450酶导致(+)-诺卡酮产量水平不同，但均导致OD₆₀₀显著下降。(+)-诺卡酮生物合成途径中关键酶的诱导表达可能扰乱大肠杆菌的正常代谢和生长。
【数据】菌株C01：(+)-戊仑烯102.8 mg/L；菌株C02（Erg20F96W）：51.3 mg/L；菌株CP01（P450cam F89V,Y98F,L246A）：(+)-诺卡酮10.7 mg/L；菌株CP02（P450cam F89V,Y98F,V249L）：9.6 mg/L；P450BM3 R48L,Y52F,F88A和CYP109B1：约5.3 mg/L；HPO/AtCPR：未检测到(+)-诺卡酮
3.2 FPP胁迫响应启动子对(+)-诺卡酮生产的影响
先前报道表明，表达CYP450的低拷贝数载体可改善大肠杆菌的生长和代谢，同时提高产物产量（Ajikumar et al., 2010）。(+)-诺卡酮产量随载体复制起始位点而变化：pSC101（6.7 mg/L，1–5拷贝）、pBBR1（3.7 mg/L，20拷贝）和CloDF13（10.9 mg/L，20–40拷贝）（图3A）。低表达策略未能提高(+)-诺卡酮产量，表明CYP450介导的反应扰乱了细胞代谢，特别是从头萜类合成。此外，升高的反式-反式-法尼醇水平（Fig. S3）表明内源性磷酸酶对FPP的水解（Wang et al., 2016）限制了萜类生物合成。敲除内源性磷酸酶可减少法尼醇积累，但对早期细胞生长有负面影响（Wang et al., 2010）。由于P450cam表达已显著降低生物量，禁用该途径可能不是最佳策略。因此，控制细胞内FPP积累和优化上游途径至关重要。
Dahl等人证明整合启动子P_gadE和P_rstA可响应FPP水平（Dahl et al., 2013b）。为平衡(+)-诺卡酮合成并最小化FPP积累，FPP反馈启动子P_gadE驱动MVA途径酶表达，FPP前馈启动子P_rstA驱动CnVS表达。该设计利用增强的CnVS转录（P_rstA）同时抑制MVA途径过表达（P_gadE）以限制FPP积累。此外，这种动态调控使重组菌株无需昂贵的诱导剂即可合成产物。
在菌株C03中用P_gadE替换MVA模块启动子，(+)-戊仑烯产量达到174.2 mg/L。在菌株C04中用P_rstA进一步调控CnVS表达，产量提高至190.6 mg/L（图3B），并显著减少了副产物反式-反式-法尼醇（Fig. S4）。结果表明，这种动态调控策略不仅有效减少了FPP的积累，还显著增加了萜类合成通量，这与Dahl等人的发现一致。随后，在菌株C04（CP09）中引入P_tac控制的P450cam F89V,Y98F,L246A，(+)-诺卡酮产量达到20.8 mg/L，(+)-戊仑烯达到238.8 mg/L。使用P_rstA在菌株CP10中表达P450cam，将(+)-诺卡酮产量提升至67.0 mg/L，同时将(+)-戊仑烯积累降至217.7 mg/L，证明了动态调控CYP450表达对萜烯氧化物生产的重要性。
结果表明，静态CYP450表达导致(+)-诺卡酮产量低，而动态调控显著提高其产量。此外，CYP450循环中的解偶联反应会产生ROS，如过氧化氢和羟基自由基。为阐明动态CYP450调控更有效的原因，我们测量了不同菌株中的ROS水平，以评估CYP450表达与ROS水平之间的关系。菌株C01和C04（均不表达CYP450）在72小时内表现出相似的ROS水平。CYP450的引入在不同时间点显著影响ROS水平。在静态调控下，CP01中的ROS水平在24小时后比C01高四倍（Fig. S5A）。在动态调控下，CP10在24小时时ROS水平比CP04高五倍。这些结果表明CYP450显著影响细胞ROS水平。此外，菌株CP10在72小时内ROS水平比CP01高约29.3%（Fig. S5A），而(+)-诺卡酮产量增加了五倍（从10.7 mg/L到67.0 mg/L）。虽然CYP450催化效率尚未定量，但这些结果表明ROS在该范围内作为有益胁迫信号，与(+)-诺卡酮产量正相关。
【数据】pSC101载体：6.7 mg/L（1–5拷贝）；pBBR1载体：3.7 mg/L（20拷贝）；CloDF13载体：10.9 mg/L（20–40拷贝）；菌株C03（P_gadE）：(+)-戊仑烯174.2 mg/L；菌株C04（P_gadE+P_rstA）：190.6 mg/L；菌株CP09（P_tac-P450cam）：(+)-诺卡酮20.8 mg/L，(+)-戊仑烯238.8 mg/L；菌株CP10（P_rstA-P450cam）：(+)-诺卡酮67.0 mg/L，(+)-戊仑烯217.7 mg/L；CP01 ROS水平：C01的4倍（24 h）；CP10 ROS水平：CP04的5倍（24 h）；CP10 ROS水平：比CP01高29.3%（72 h）；(+)-诺卡酮产量增加：5倍（10.7→67.0 mg/L）
3.3 验证P_rstA响应转录因子并优化P_rstA
P_gadE的激活机制涉及大肠杆菌中谷氨酸依赖性抗酸（GADR）系统，涉及多种转录因子，包括PhoP（Aiso et al., 2011; Ma et al., 2003; Sayed & Foster, 2009）。然而，仅提高FPP通量是不够的，因为(+)-戊仑烯向(+)-诺卡酮的不完全转化主要受限于P450cam的催化效率。我们旨在理解P_rstA的调控机制（该启动子控制CnVS和P450cam模块）并增强其动态调控能力。本研究聚焦于P_rstA对萜类合成途径基因的控制，促使我们鉴定并优化其转录因子识别域。
与P_gadE不同，P_rstA特异性响应PhoP蛋白，调控大肠杆菌中rstA和rstB的表达以维持Mg²⁺稳态。I类倍半萜合酶在催化过程中需要三个Mg²⁺离子的配位来触发IPP电离和初始碳阳离子形成（Christianson, 2017）。我们假设该过程以及FPP消耗导致细胞内Mg²⁺浓度显著下降，激活PhoP/PhoQ系统以维持Mg²⁺稳态（Huang et al., 2020; Ogasawara et al., 2007）。因此，PhoP直接调控rstA基因的转录。在P_rstA上发现了一个保守核苷酸序列（-acctgatgaaaacttgtttagaa-），称为PhoP box（图4A）（Zwir et al., 2005）。
为评估该基因的功能重要性，我们对该序列进行了突变研究。通过引入P_rstA突变体文库，筛选出响应性能增强的启动子变体。其中，P4\P_rstA突变体表现出最强的动态响应特性，在维持低背景表达的同时显著提高了诱导后的转录水平。将P4\P_rstA应用于菌株CP11（携带P4\P_rstA-CnVS和P_tac-P450cam）和CP13（携带P4\P_rstA-CnVS和P4\*P_rstA-P450cam），考察了启动子工程对(+)-戊仑烯和(+)-诺卡酮产量的影响（图4B）。
【数据】PhoP box序列：-acctgatgaaaacttgtttagaa-；突变体：P4\*P_rstA；检测时间点：72 h
3.4 摇瓶培养与补料分批策略优化
为评估P4\P_rstA启动子和不同质粒复制起始位点对生产的影响，我们比较了不同菌株在挡板摇瓶中的表现（图5）。菌株CP13（携带P4\P_rstA-CnVS和P4\*P_rstA-P450cam）在挡板摇瓶中(+)-诺卡酮产量达到128.9 mg/L。该产量较CP10（67.0 mg/L）提高了近一倍，表明P_rstA启动子工程显著增强了CYP450的表达调控。
进一步采用补料分批策略。在摇瓶发酵过程中，定期补充甘油作为碳源，监测甘油消耗、(+)-戊仑烯和(+)-诺卡酮产量以及OD₆₀₀变化（图6）。通过优化甘油补料方案，最终(+)-诺卡酮产量达到165.1 mg/L，较静态调控（10.7 mg/L）提高了15倍。
【数据】菌株CP13（挡板摇瓶）：(+)-诺卡酮128.9 mg/L；菌株CP10：67.0 mg/L；补料分批终产量：165.1 mg/L；较静态调控提高：15倍
讨论与解读
本研究通过系统性的代谢工程策略，在大肠杆菌中实现了(+)-诺卡酮的高水平从头合成。研究亮点在于：首先，通过筛选FPP合酶和CYP450酶确定了最佳催化组合——ispA与P450cam F89V,Y98F,L246A变体；其次，创造性地引入FPP响应型动态调控系统（P_gadE和P_rstA），有效解决了FPP积累和法尼醇副产物问题；再次，通过P_rstA启动子工程（PhoP box优化）增强了动态调控的响应强度；最后，结合补料分批策略将产量推至165.1 mg/L。
值得注意的是，研究发现CYP450表达引起的ROS水平升高在一定范围内与产物产量正相关，这提示ROS可能作为有益的胁迫信号参与调控。然而，维持ROS平衡以避免氧化胁迫仍是未来研究需要关注的问题。
编译者解读
该研究展示了动态调控策略在解决CYP450介导萜类氧化中代谢失衡问题的强大潜力。传统静态过表达CYP450往往导致前体竞争、ROS积累和细胞生长抑制，而FPP响应型启动子实现了"按需表达"的精细调控。P_rstA启动子工程通过优化PhoP box增强动态响应范围，为合成生物学中的启动子工程提供了范例。165.1 mg/L的产量虽与商业化生产尚有距离，但15倍的提升幅度表明动态调控策略在萜类衍生物生物合成中具有普适价值。未来若能将ROS水平控制在最优窗口，并解决CYP450催化效率瓶颈，该平台有望进一步向产业化迈进。
参考来源
He X. De novo synthesis of (+)-nootkatone in Escherichia coli using stress-response dynamic regulatory system. Food Bioscience, 2025. DOI: 10.1016/j.fbio.2025.108047
DOI: 10.1016/j.fbio.2025.108047