来源：Integrated metabolic and process engineering enables broadly tunable lactate-based polyester biosynthesis in Escherichia coli（Biochemical Engineering Journal）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
聚乳酸（PLA）等可生物降解聚酯是石油基塑料的理想替代品，但微生物合成长期受制于PHA合酶PhaC对乳酰辅酶A的低亲和力。本研究在大肠杆菌中整合酶融合工程、代谢工程与低废物细胞循环发酵，通过柔性连接肽构建PhaC-L-Pct融合酶，将PLA产量提升至1.91 wt% DCW，共聚物P(3HB-co-LA)中乳酸单元占比实现17.3–70.0 mol%的宽幅可调——为可降解聚酯的低碳规模化生产提供了全新框架。
研究背景
PLA及乳酸基共聚酯的微生物合成具有立体选择性和减少化石原料依赖的固有优势，但两大核心挑战长期未解：一是如何在获得高产量的同时提高乳酸（LA）掺入比例；二是如何精确调控聚合物组成以满足多元应用需求。当前聚(3-羟基丁酸-co-乳酸)（P(3HB-co-LA)）微生物合成的主要瓶颈在于PHA合酶PhaC对乳酰辅酶A（LA-CoA）的底物亲和力显著低于对3-羟基丁酰辅酶A（3HB-CoA）的亲和力，导致LA单元掺入率低、产物物性与纯PLA差异显著。已有策略包括引入丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶PctCp以催化LA-CoA生成，但PctCp自身也存在底物识别和稳定性问题。本研究尝试以酶融合、代谢网络改造与新型发酵工艺的集成方案系统性破解上述瓶颈。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养条件
本研究所用全部工程菌株及其基因型和相关质粒详见表1。大肠杆菌MG1655（ATCC 700926）作为亲本宿主菌株。通过λ-Red同源重组系统（pKD46/pKD13/pcp20）构建了一系列基因敲除突变株，包括Δdld、ΔadhE、ΔackA-pta、ΔyjgB、ΔrecA（编码RecA重组酶，同源重组和SOS应答的核心介导因子）和ΔatoB（编码乙酰乙酰辅酶A硫解酶，催化两分子乙酰辅酶A缩合为乙酰乙酰辅酶A）。修饰后的质粒载体pTrc99A4携带trc启动子和氨苄青霉素抗性基因（AmpR），用于遗传操作。关键遗传元件包括：源自食树脂假单胞菌的PHA合酶突变基因PhaC^Pre^DTGK（E130D/T325T/S477G/Q481K）；源自丙酸梭菌的丙酰辅酶A转移酶突变基因Pct^Cp^V193A；独立表达的串联基因PhaC^Pre^DTGK-Pct^Cp^V193A；通过10个氨基酸的柔性连接肽（GGGGSGGGGS）连接的融合基因PhaC^Pre^DTGK-L-Pct^Cp^V193A和Pct^Cp^V193A-L-PhaC^Pre^DTGK；独立表达（无连接肽）的串联基因PhaC^Pre^DTGK-Pct^Cp^V193A——该构建体中PhaC和Pct以独立蛋白形式从同一质粒共表达，不含任何肽段连接，菌株名称中以"(Ind)"后缀区分（即MGPLA1(Ind)和MGPHBLA(Ind)）；以及源自贪铜菌的串联基因PhaA（编码β-酮硫解酶）和PhaB（编码乙酰乙酰辅酶A还原酶）。所有基因均针对大肠杆菌MG1655的密码子偏好性进行优化（生工生物，上海），侧翼添加限制性酶切位点用于后续质粒构建，并引入核糖体结合位点（RBS）序列（见补充材料）。所有菌株保留内源D-乳酸合成途径（基因组ldhA），未进行过表达。大肠杆菌DH5α（ATCC）用于质粒维持和转化。重组菌株接种于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37°C、200 rpm振荡培养12 h制备种子液。初级发酵以1%（v/v）接种量转接至优化培养基（LB添加2%葡萄糖、0.5 mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）和10 mM泛酸钙），30°C、200 rpm振荡培养。细胞循环发酵中，初始培养24 h后通过离心（8000 rpm，15 min，4°C）收集菌体，无菌水洗涤后转接至添加2%乳酸钠或2%乙酸钠的新鲜优化培养基中继续培养24 h。
【数据】宿主菌株：E. coli MG1655 (ATCC 700926)；敲除基因：dld、adhE、ackA-pta、yjgB、recA、atoB；氨苄青霉素浓度：100 μg/mL；种子培养：37°C、200 rpm、12 h；初级发酵：1%接种量、2%葡萄糖、0.5 mM IPTG、10 mM泛酸钙、30°C、200 rpm；细胞循环发酵：8000 rpm离心15 min（4°C）、2%乳酸钠或2%乙酸钠、额外24 h
2.2 分子生物学操作
质粒提取使用SanPrep柱式质粒试剂盒（生工生物）。重组质粒通过限制性酶切-连接克隆构建：PhaC^Pre^DTGK-Pct^Cp^V193A、PhaC^Pre^DTGK-L-Pct^Cp^V193A和Pct^Cp^V193A-L-PhaC^Pre^DTGK片段经EcoR I/Sac I双酶切后连接至同样酶切的pTrc99A4载体，分别获得pT-PhaC^Pre^DTGK-Pct^Cp^V193A、pT-PhaC^Pre^DTGK-L-Pct^Cp^V193A和pT-Pct^Cp^V193A-L-PhaC^Pre^DTGK质粒。PhaA-PhaB片段经Xba I/Hind III酶切后插入pT-PhaC^Pre^DTGK-Pct^Cp^V193A和pT-PhaC^Pre^DTGK-L-Pct^Cp^V193A，生成pT-PhaC^Pre^DTGK-Pct^Cp^V193A-PhaA-PhaB和pT-PhaC^Pre^DTGK-L-Pct^Cp^V193A-PhaA-PhaB。大肠杆菌MG1655中的基因敲除（recA、adhE、ackA-pta、yjgB、atoB和dld）通过λ-Red同源重组实现。引物设计用于从pKD13扩增卡那霉素抗性 cassette，在FRT位点两侧引入约50 bp同源臂（表S1）。所得PCR片段（上游同源臂-FRT-KanR-FRT-下游同源臂）电转化至含pKD46的MG1655感受态细胞。阳性克隆在卡那霉素平板上筛选，随后利用pcp20表达的FLP重组酶切除抗生素标记。化学转化感受态细胞采用CaCl2法制备，质粒导入通过42°C热激45 s完成。
【数据】酶切位点：EcoR I/Sac I（融合片段）、Xba I/Hind III（PhaA-PhaB）；同源臂长度：约50 bp；热激转化：42°C、45 s
2.3 生物信息学分析
使用AlphaFold3（v3.0.0）预测两种融合酶PhaC^Pre^DTGK-L-Pct^Cp^V193A和Pct^Cp^V193A-L-PhaC^Pre^DTGK的三维结构（图S1）。所有预测均采用软件默认参数。预测使用融合酶全长蛋白序列，默认配对MSA模式和3次迭代模板搜索。每种融合酶生成5个模型，选择整体预测局部距离差异检验（pLDDT）得分最高的模型进行后续分析。所选模型的平均pLDDT得分分别为：PhaC-L-Pct为82.3，Pct-L-PhaC为79.6，所有催化残基区域的pLDDT得分均>90，表明预测结构具有高置信度。使用PyMOL 2.5.7分析活性口袋构象，量化PhaC（D130/T325/G477/K481）与Pct（A193/E324）催化中心间的极端距离（PhaC-L-Pct: 56.9–75.1 Å；Pct-L-PhaC: 31.1–52.5 Å）。该结构分析为后续分子对接提供基础。分子对接使用AutoDock Vina 1.2.3验证底物结合特性。配体包括：D-乳酸（PubChem CID: 61503，直接获取）、乙酰辅酶A和(R)-乳酰辅酶A（由PubChem 2D数据CID: 444493/440997经ChemDraw 3D 20.0能量最小化生成3D结构）。受体蛋白预处理包括去除水分子、添加极性氢和分配Kollman电荷。以催化残基为中心设置25 × 25 × 25 ų对接盒子。全局优化（exhaustiveness=32）获得最优结合构象（簇RMSD <2.0 Å）和结合能（ΔG）。最终配体结合模式使用PyMOL可视化。
【数据】AlphaFold3模型数：5个/酶；平均pLDDT：PhaC-L-Pct 82.3、Pct-L-PhaC 79.6；催化残基pLDDT：>90；催化中心距离：PhaC-L-Pct 56.9–75.1 Å、Pct-L-PhaC 31.1–52.5 Å；对接盒子：25 × 25 × 25 ų；exhaustiveness=32；簇RMSD <2.0 Å
2.4 分析方法
PLA及其共聚物P(3HB-co-LA)按以下方案定量。发酵液8000 rpm离心15 min（4°C）。上清液用去离子水稀释10倍，经0.22 μm水相滤膜过滤用于残余底物分析。细胞沉淀用去离子水洗涤两次，冻干48 h后研磨成粉末。聚合物提取：1 g干细胞重（DCW）与5 mL氯仿在通风橱中90°C回流4 h。提取液经0.22 μm PTFE滤膜过滤，加入20倍体积冰甲醇沉淀聚合物，真空抽滤并干燥。为精确量化干燥细胞中的PLA含量，提取的聚合物经碱水解后进行高效液相色谱（HPLC）分析。PLA定量采用碱水解法：干燥聚合物或标准品的四分之一用800 μL 1 M NaOH于100°C水解30 min，用800 μL 0.5 M H2SO4中和，过滤（0.22 μm水相滤膜），HPLC分析采用阳离子交换柱（KPSH1008–3078，7.8 × 300 mm，10 μm）。流动相为2.5 mM H2SO4（取136 μL 98% H2SO4稀释至1 L，过滤脱气），流速0.6 mL/min（柱温30°C）。检测使用示差折光检测器，进样量10 μL，运行时间40 min。为测定合成的P(3HB-co-LA)共聚物中LA和3HB单元的摩尔分数，聚合物经甲醇解后进行气相色谱（GC）分析。P(3HB-co-LA)组成分析：30 mg干燥聚合物或标准品（(R)-3-羟基丁酸甲酯、D-乳酸甲酯）经甲醇解处理……
【数据】离心：8000 rpm、15 min、4°C；冻干：48 h；提取：1 g DCW + 5 mL氯仿、90°C、4 h；沉淀：20倍体积冰甲醇；碱水解：800 μL 1 M NaOH、100°C、30 min；中和：800 μL 0.5 M H2SO4；HPLC条件：KPSH1008–3078柱、2.5 mM H2SO4、0.6 mL/min、柱温30°C、进样10 μL、运行40 min；GC分析：30 mg样品
研究结果
3.1 融合酶设计、结构分析与PLA合成验证
为克服PHA合酶PhaC对LA-CoA底物亲和力低的瓶颈，本研究基于天然PHA合酶的协同机制构建了两种新型融合酶：PhaC-L-Pct（PhaC^Pre^DTGK-L-Pct^Cp^V193A）和Pct-L-PhaC（Pct^Cp^V193A-L-PhaC^Pre^DTGK）。两种融合酶通过10个氨基酸的柔性连接肽（GGGGSGGGGS）连接，旨在优化LA-CoA生成与聚合的效率。AlphaFold3结构预测揭示了融合酶的独特空间构象。Pct-L-PhaC呈嵌套式排列，PhaC^Pre^DTGK（关键残基D130、T325、G477、K481）与Pct^Cp^V193A（关键残基A193、E324）的催化中心间距为31.1–52.5 Å（图2A和表2）。相比之下，PhaC-L-Pct呈背靠背式排列，催化中心距离为56.9–75.1 Å（图2B）。尽管Pct-L-PhaC在静态结构中催化中心距离更短，分子对接结果（AutoDock Vina 1.2.3）进一步证实PhaC-L-Pct对(R)-乳酰辅酶A具有更好的亲和力，结合能为−8.45 kcal/mol，结合距离更近（7.3–23.9 Å）。Pct-L-PhaC的结合能为−2.05 kcal/mol，结合距离为22.1–46.0 Å（表S2）。尽管Pct-L-PhaC在静态结构中表现出更短的活性位点间距，分子对接显示PhaC-L-Pct对(R)-乳酰辅酶A具有更优的亲和力。我们推测，PhaC-L-Pct的"背靠背"取向尽管距离更长，但可能形成了更有利的两个催化中心共定位，或诱导了增强结合口袋可及性的构象变化，从而超过了"嵌套式"Pct-L-PhaC构象中邻近性的优势。这表明催化效率不仅受静态距离支配，还受动态构象柔性和底物转运的影响——尽管这些结构观察本身并不能明确建立底物通道样机制，后者还需要中间体隔离的动力学证据。
随后，我们评估了这两种融合酶在大肠杆菌中的发酵性能。在含2%碳源和0.5 mM IPTG的条件下，发酵结果表明融合酶的效率受碳源类型显著影响（图3A）。以葡萄糖为碳源时，细胞生长显著增强，OD600在24–30 h达到峰值6.20–6.36。而以甘油为碳源时，细胞表现出代谢迟滞，OD600在30–36 h达到峰值5.83–6.16。值得注意的是，在相同发酵条件（2%葡萄糖，30°C）下，野生型大肠杆菌MG1655在遗传干预前经HPLC检测不到内源D-乳酸。发酵30 h（稳定期产量高峰阶段），PhaC-L-Pct融合菌株（MGPLA1）在葡萄糖培养基中PLA产量达到0.45 ± 0.03 wt% DCW。该产量显著高于Pct-L-PhaC融合菌株（MGPLA2，0.15 ± 0.01 wt% DCW；p < 0.01）和独立表达系统（MGPLA1(Ind)，0.35 ± 0.02 wt% DCW；p < 0.05）（图3A）。这表明即使微量的内源乳酸，在阻断分解代谢泄漏（Δdld）和融合酶介导的双酶共定位放大下，也足以驱动聚合物合成。然而在甘油发酵条件下，两种融合酶的PLA产量都极低（<0.06 wt% DCW），与葡萄糖发酵相比无显著差异（p > 0.05）。这进一步强调了碳源对聚合物合成效率的关键影响。尽管Pct-L-PhaC在催化中心间表现出更短的静态距离，其PLA合成性能却不如PhaC-L-Pct。这种性能差异可能主要源于两个关键因素的综合效应：Pct-L-PhaC中Pct的N端融合对PhaC底物进入口袋引入空间位阻，降低了底物可及性，而PhaC-L-Pct的C端融合避免了这种干扰；PhaC-L-Pct的背靠背结构域取向优化了两个催化结构域的共定位，可能改善了中间体转移效率。PhaC-L-Pct融合酶利用内源D-乳酸途径构建，无需额外遗传修饰来提供乳酸。这一结果支持后续通过融合酶优化两个催化结构域共定位来实现可控乳酸掺入的发酵策略。
【数据】融合酶连接肽：(GGGGSGGGGS)10 aa；催化中心距离：Pct-L-PhaC 31.1–52.5 Å、PhaC-L-Pct 56.9–75.1 Å；结合能：(R)-乳酰辅酶A — PhaC-L-Pct −8.45 kcal/mol、Pct-L-PhaC −2.05 kcal/mol；结合距离：PhaC-L-Pct 7.3–23.9 Å、Pct-L-PhaC 22.1–46.0 Å；OD600峰值：葡萄糖6.20–6.36（24–30 h）、甘油5.83–6.16（30–36 h）；PLA产量（30 h）：MGPLA1 0.45 ± 0.03 wt% DCW、MGPLA2 0.15 ± 0.01 wt% DCW（p < 0.01）、MGPLA1(Ind) 0.35 ± 0.02 wt% DCW（p < 0.05）；甘油条件PLA产量：<0.06 wt% DCW
3.2 融合酶在P(3HB-co-LA)合成中的扩展应用与代谢工程优化
在PhaC-L-Pct融合酶在PLA合成中的有效性得到验证后，我们进一步将其应用于P(3HB-co-LA)共聚物的生物合成。为平衡前体通量，引入了来自贪铜菌的PhaA（β-酮硫解酶）和PhaB（乙酰乙酰辅酶A还原酶）基因，旨在大肠杆菌中构建完整的3HB和LA单体供应途径（图3B、C）。MGPHBLA菌株合成的P(3HB-co-LA)共聚物的^13C NMR谱图（图S2）显示了LA和3HB重复单元的所有特征峰。具体而言，LA单元的核心诊断峰在δ 69.02 ppm清晰可见，相应的羰基峰在δ 169.98 ppm，甲基峰在δ 17.29 ppm；同时，3HB单元的所有四个特征峰也均被检测到，与PHB标准谱图匹配。这些结果为LA单元成功共价掺入PHA聚合物主链以及目标P(3HB-co-LA)共聚物的成功生物合成提供了结构证据。
在相同发酵条件下（2%碳源，30 h），融合系统MGPHBLA在葡萄糖培养基中的共聚物产量达到8.11 ± 0.53 wt% DCW，与独立表达系统MGPHBLA(Ind)的3.75 ± 0.31 wt% DCW相比，显著提高了116%（p < 0.01）（图3B）。此外，碳源类型对共聚物组成有决定性影响：以葡萄糖为碳源时，LA含量从甘油培养基中的7.6 ± 0.91 mol%显著增加至17.8 ± 1.53 mol%，增幅高达134%（p < 0.01）（图3C）。在24–30 h的生产阶段，融合系统的生产效率是独立系统的1.8倍。虽然在甘油培养基中MGPHBLA的产量为6.35 ± 0.44 wt% DCW，LA含量为7.6 ± 0.91 mol%，高于独立系统（2.25 ± 0.20 wt% DCW），但其LA比例仍不到葡萄糖培养基中的50%。这些结果共同表明，PhaC-L-Pct融合酶在提高LA掺入和聚合物产量方面具有显著优势，且碳源类型对聚合物的产量和组成有强烈影响。葡萄糖作为碳源优于甘油，可能归因于其代谢通量更直接地流向丙酮酸并随后生成乙酰辅酶A——乙酰辅酶A是3HB-CoA和经内源途径合成LA-CoA的关键前体。
【数据】MGPHBLA产量（葡萄糖）：8.11 ± 0.53 wt% DCW；MGPHBLA(Ind)产量：3.75 ± 0.31 wt% DCW；产量提升：116%（p < 0.01）；LA含量：葡萄糖17.8 ± 1.53 mol%、甘油7.6 ± 0.91 mol%；LA含量增幅：134%（p < 0.01）；生产效率比：1.8倍（24–30 h）；MGPHBLA甘油产量：6.35 ± 0.44 wt% DCW；MGPHBLA(Ind)甘油产量：2.25 ± 0.20 wt% DCW；NMR特征峰：LA δ 69.02 ppm（核心诊断峰）、δ 169.98 ppm（羰基）、δ 17.29 ppm（甲基）
3.3 基因敲除对PLA和P(3HB-co-LA)合成及组成的影响
为系统优化聚羟基脂肪酸酯（PHA）合成的前体通量，我们在E. coli MG1655宿主菌株中针对recA、adhE、ackA-pta、yjgB、atoB和dld基因进行了敲除（表1）。所有实验均在受控条件下进行：2%葡萄糖、0.5 mM IPTG、30°C、培养30 h。D-乳酸脱氢酶基因（dld）的敲除显著增强了……
【数据】培养条件：2%葡萄糖、0.5 mM IPTG、30°C、30 h；敲除基因：recA、adhE、ackA-pta、yjgB、atoB、dld
3.4 细胞循环发酵与有机酸盐补料对聚合物流合成的优化
【数据】原文未详述（该部分原文在提供的节选之外）
讨论与解读
本研究建立了一个整合的代谢/生物过程平台，在大肠杆菌中利用内源D-乳酸途径合成PLA及其共聚物。关键成果包括：(1)理性设计的PhaC-L-Pct融合酶实现了乳酰辅酶A生成与聚合的共定位；(2)靶向基因敲除优化了前体供应；(3)细胞循环发酵策略实现了组成宽幅调控和高产合成。一个关键发现是同聚物和共聚物生产需要不同的代谢配置：纯PLA合成要求不存在3HB-CoA供应途径（PhaA-PhaB），而该途径的存在则实现了可调节P(3HB-co-LA)共聚物的生产。然而，本工作存在若干局限性：所达到的聚合物滴度和产率仍处于概念验证水平，距产业化要求还有较大提升空间；乳酰辅酶A的代谢通量虽被重新定向但未定量测定，胞内精确瓶颈尚不明确；此外，工程菌株的长期遗传和表型稳定性尚未表征，这是实际应用的关键参数，将在后续实验中系统评估。最后，对合成聚合物材料性能（如分子量等）的综合表征也需进一步开展。
编译者解读：这项工作的核心亮点在于"集成"二字——将酶融合的空间邻近效应、代谢节点的精准敲除和细胞循环发酵的工艺创新拧成一股绳，实现了乳酸基聚酯组成从17.3到70.0 mol%的宽幅可调。从合成生物学应用角度看，利用内源D-乳酸途径而非外源过表达LDH的策略显著降低了代谢负担，这一设计思路对其他依赖辅酶A中间体的聚合物合成具有借鉴价值。不过，概念验证水平的产量距离工业化仍有距离，LA-CoA通量的定量示踪和菌株长期稳定性将是后续商业化道路上的关键关卡。
DOI: 10.1016/j.bej.2026.110292