来源：Metabolic engineering of a plasmid-free, non-auxotrophic Escherichia coli for efficient glycolate production（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
乙醇酸是一种重要的α-羟基羧酸，广泛应用于可降解塑料、食品和制药行业。目前微生物法生产乙醇酸依赖质粒和化学诱导剂，限制了工业化应用。本研究从醋酸杆菌中筛选到高效乙醛酸还原酶AaGhrA，通过模块化代谢工程、辅因子工程和生长阶段依赖性分子开关等策略，最终构建了无质粒、无需外源营养 supplementation 的工程菌株E. coli GA26，在5 L生物反应器中实现乙醇酸产量81.5 g/L、产率0.49 g/g葡萄糖、生产强度1.9 g/L/h，为目前报道的最高水平。
研究背景
乙醇酸是化工和制药行业的大宗化学品，也是合成聚乙醇酸（PGA）和聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA）等可降解材料的关键单体，预计2026年全球市场规模将达7.66亿美元。当前工业生产主要依赖甲醛羰基化、氯乙酸水解等化学方法，存在环境污染严重、反应条件苛刻等缺陷。生物法因反应条件温和、原料成本低、环境友好等优势，成为乙醇酸工业化生产的理想替代方案。
乙醇酸的生物合成可通过整细胞催化或微生物发酵实现。整细胞催化以乙二醇为底物，如在氧化葡萄糖酸杆菌中过表达aldA基因，工程菌45小时内可合成113.8 g/L乙醇酸，产率达92.9%。然而，该菌株培养依赖昂贵的山梨醇，增加了生产成本。微生物发酵法以葡萄糖为底物，更具经济潜力。本研究以大肠杆菌为宿主，通过系统代谢工程策略实现乙醇酸的高效生产。
研究方法
2.1 菌株、质粒与培养基
以E. coli ATCC 8739为宿主菌株，用于乙醇酸生产改造。E. coli Top10用于重组质粒构建，E. coli BL21(DE3)用于GhrA蛋白表达。本研究所用质粒、菌株和引物分别列于补充表1-3。
LB培养基（10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl）用于基础菌株培养，TB培养基（24 g/L酵母提取物、12 g/L蛋白胨、4 g/L甘油、16.4 g/L K2HPO4、2.3 g/L KH2PO4）用于蛋白表达。种子培养使用LB培养基。乙醇酸发酵培养基含10 g/L葡萄糖、10 g/L酵母提取物、5.6 g/L K2HPO4、2.4 g/L KH2PO4、1.5 g/L谷氨酸、1 g/L MgSO4·7H2O，pH 7.0。对于icd基因敲除菌株，培养基需额外添加1.5 g/L谷氨酸以维持细胞正常生长。根据需要添加卡那霉素（50 mg/L）和壮观霉素（30 mg/L）。
【数据】LB培养基：10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl；TB培养基：24 g/L酵母提取物、12 g/L蛋白胨、4 g/L甘油、16.4 g/L K2HPO4、2.3 g/L KH2PO4；发酵培养基：10 g/L葡萄糖、10 g/L酵母提取物、5.6 g/L K2HPO4、2.4 g/L KH2PO4、1.5 g/L谷氨酸、1 g/L MgSO4·7H2O，pH 7.0；卡那霉素：50 mg/L；壮观霉素：30 mg/L
2.2 发酵条件
摇瓶和5 L生物反应器的种子培养。 用无菌接种环将甘油保存的菌液划线接种于斜面琼脂培养基，37°C培养16 h。用10 mL无菌水冲洗菌苔，按2%（v/v）接种量转接至100 mL一级种子培养基。有氧条件下（37°C，200 r/min）培养8 h。随后将2%（v/v）一级种子液接种至100 mL二级种子培养基，相同条件（37°C，200 r/min）培养6 h。
摇瓶乙醇酸生产。 发酵在500 mL摇瓶中进行，初始工作体积60 mL。将10%（v/v）二级种子液接种至摇瓶。摇床转速200 r/min，温度37°C，发酵过程中补加4 M NaOH维持pH约6.7-6.8，使用800 g/L葡萄糖溶液控制葡萄糖浓度在0-5 g/L。
5 L生物反应器乙醇酸生产。 发酵在5 L生物反应器（T&J Bioengineering，上海，中国）中进行，初始工作体积1.5 L。将10%（v/v）二级种子液接入反应器，初始搅拌转速200 r/min。发酵参数控制如下：温度37°C，pH通过氨水自动控制在6.7-6.8，补料阶段使用800 g/L葡萄糖溶液控制葡萄糖浓度在0-5 g/L，溶氧（DO）通过DO-转速级联控制模式稳定在约30%。
【数据】种子培养：37°C、200 r/min、一级8 h、二级6 h、接种量2%（v/v）；摇瓶发酵：500 mL摇瓶、工作体积60 mL、接种量10%（v/v）、200 r/min、37°C、pH 6.7-6.8（4 M NaOH维持）、葡萄糖0-5 g/L（800 g/L葡萄糖溶液控制）；5 L反应器：工作体积1.5 L、接种量10%（v/v）、200 r/min、37°C、pH 6.7-6.8（氨水自动控制）、葡萄糖0-5 g/L、DO约30%
2.3 DNA操作
质粒构建采用Gibson组装法。异源基因由上海生工生物技术有限公司合成。基因敲除和整合均使用CRISPR/Cas9系统。对于ackA、poxB、ldhA、icd、aldA和glcDEF基因的敲除，首先设计特异性pTargetF质粒，随后与相应敲除盒共同转化至含pCas9的菌株中。通过菌落PCR分析筛选并验证阳性转化子。
【数据】基因敲除：ackA、poxB、ldhA、icd、aldA、glcDEF；工具：CRISPR/Cas9系统（pTargetF质粒+敲除盒+pCas9菌株）；验证方法：菌落PCR
2.4 酶活测定
粗蛋白提取物和纯化酶按前述方法制备。酶活使用SpectraMax M3酶标仪在37°C下测定，通过监测340 nm处NAD(P)H氧化或NAD(P)+还原来实现。所有酶活以指定条件下每分钟每毫克蛋白产生的NAD(P)+或NAD(P)H微摩尔数表示。
异柠檬酸裂解酶（ICL）活性在粗提取物中测定，1 mL反应体系含5 mM异柠檬酸三钠、5 mM MgCl2、1 mM二硫苏糖醇（DTT）、0.2 mM NADPH、12.8 U乳酸脱氢酶（LDH）和100 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）。加入10 μL粗提取物启动反应。
乙醛酸还原酶（GhrA）活性在纯化形式下测定，1 mL反应体系含0.1-1.5 mM乙醛酸、0.1 mM NADPH或NADH和100 mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 7.0）。加入1 μg/mL纯化酶启动反应。动力学参数（KM和kcat）通过GraphPad Prism 9中非线性回归拟合Michaelis-Menten方程计算。
GhrA活性在粗提取物中测定，1 mL反应体系含1 mM乙醛酸、0.1 mM NADPH或NADH和100 mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 7.0），加入5 μL粗提取物启动反应。
异柠檬酸脱氢酶（IDH）活性在粗提取物中测定，1 mL反应体系含1 mM异柠檬酸三钠、10 mM MgCl2、0.25 mM NADP+和50 mM Tricine-KOH缓冲液（pH 8.0）。加入10 μL粗提取物启动反应。
【数据】测定温度：37°C；波长：340 nm；ICL体系：5 mM异柠檬酸三钠、5 mM MgCl2、1 mM DTT、0.2 mM NADPH、12.8 U LDH、100 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）、10 μL粗酶；GhrA纯酶体系：0.1-1.5 mM乙醛酸、0.1 mM NADPH/NADH、100 mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 7.0）、1 μg/mL纯酶；GhrA粗酶体系：1 mM乙醛酸、0.1 mM NADPH/NADH、100 mM柠檬酸-磷酸盐缓冲液（pH 7.0）、5 μL粗酶；IDH体系：1 mM异柠檬酸三钠、10 mM MgCl2、0.25 mM NADP+、50 mM Tricine-KOH缓冲液（pH 8.0）、10 μL粗酶
2.5 基因转录水平qPCR分析
使用FreeZol试剂（Vazyme，中国）按制造商方案提取总RNA。RNA纯度和浓度通过NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）测定，260/280比值在1.8-2.0之间。使用PrimeScript™ RT Master Mix（Takara，日本）从总RNA合成cDNA。qPCR扩增使用SYBR® Premix Ex Taq™ II（Takara，日本）在QuantStudio 5实时荧光定量PCR系统（Applied Biosystems，美国）上进行。所有样品三次重复，以16S rRNA（rrsA）为内参。阴性对照包括无模板对照（NTC）和无逆转录酶对照（NRT）。相对基因表达量采用2−ΔΔCt方法计算，数据归一化至对照组。
【数据】RNA纯度：260/280比值1.8-2.0；内参基因：16S rRNA（rrsA）；计算方法：2−ΔΔCt；重复次数：三次
2.6 胞内辅因子水平测定
菌株胞内辅因子浓度按前述方法测定。使用增强型NAD+/NADH检测试剂盒（WST-8法）和增强型NADP+/NADPH检测试剂盒（WST-8法）（碧云天生物技术，上海，中国）提取并测定胞内辅因子。
【数据】检测试剂盒：增强型NAD+/NADH检测试剂盒（WST-8法）、增强型NADP+/NADPH检测试剂盒（WST-8法）（碧云天生物技术）
2.7 分析方法
发酵过程参数监测如下：葡萄糖浓度使用SBA-40E生物传感分析仪测定。细胞密度通过适当稀释发酵液使光密度（OD600）在0.2-0.8之间，随后使用紫外-可见分光光度计在600 nm处测定。
乙醇酸定量：发酵液样品12,000×g离心10 min。上清液适当稀释至乙醇酸浓度在0-1 g/L范围内，经0.22 μm滤膜过滤后进行高效液相色谱（HPLC）分析。HPLC分离使用Aminex HPX-87H色谱柱（300 mm × 7.8 mm），柱温55°C，流动相为5 mmol/L H2SO4，流速0.6 mL/min。紫外检测器在210 nm处检测，进样量20 μL。丙酮酸、乙酸和乳酸等副产物的定量使用与乙醇酸分析相同的HPLC方法。所有测定均进行三次重复，并使用各分析物的标准品建立标准曲线以确保定量准确性。
【数据】葡萄糖测定：SBA-40E生物传感分析仪；OD600范围：0.2-0.8；离心：12,000×g、10 min；HPLC条件：Aminex HPX-87H柱（300 mm × 7.8 mm）、55°C、5 mmol/L H2SO4、0.6 mL/min、210 nm、进样量20 μL；重复次数：三次
研究结果
3.1 大肠杆菌高效乙醇酸生物合成途径的构建
在乙醛酸还原途径中，异柠檬酸裂解酶（AceA；由aceA编码）和乙醛酸还原酶（GhrA；由ghrA编码）是微生物乙醇酸生产的两个关键限速酶。AceA催化异柠檬酸裂解为乙醛酸（乙醇酸的直接前体）和琥珀酸，GhrA则将乙醛酸还原为乙醇酸。前期研究表明，来自嗜热脂肪地芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）的GsAceA具有优异的酶学特性，因此广泛用于乙醇酸途径工程。
为筛选与GsAceA配对的最优GhrA候选酶，基于文献综述和数据库（如UniProt和KEGG）分析，从五个不同细菌物种中选取了ghrA基因——大肠杆菌（EcghrA）、枯草芽孢杆菌（BsghrA）、阪崎克罗诺杆菌（CsghrA）、肺炎克雷伯菌（KpghrA）和醋酸杆菌（AaghrA）。所有重组GhrA酶均在大肠杆菌中成功可溶性表达（补充图2）。
动力学表征显示，AaGhrA具有最高的催化效率，kcat/KM为1047.82 s⁻¹ mM⁻¹。该值相比EcGhrA、BsGhrA、CsGhrA和KpGhrA分别提高了72.95%、199.66%、28.72%和321.42%（表1）。因此，AaGhrA被选为最优乙醛酸还原酶用于后续途径工程。
为构建初始乙醇酸生产菌株，将携带不同启动子和核糖体结合位点（RBS）组合的关键乙醇酸生物合成基因GsaceA和AaghrA分别整合至E. coli ATCC 8739染色体的yghx和yahj位点，生成工程菌E. coli GA0至GA0-8。这些位点对细胞生长非必需，且已在前期代谢工程研究中被验证为稳定整合位点（补充表4）。
然而，菌株GA0至GA0-8在摇瓶培养中均未观察到乙醇酸积累。这一结果与前期发现一致——在TCA循环完整的情况下，仅共表达乙醛酸循环酶不足以驱动乙醇酸生产。原因在于TCA循环在能量生产和生物质合成方面具有更高通量优先级，与乙醛酸途径竞争共同底物异柠檬酸。
为将代谢流转向乙醛酸途径，从菌株GA0至GA0-8中敲除了icd基因（编码异柠檬酸脱氢酶，将异柠檬酸导入TCA循环），获得菌株GA1至GA1-8。其中GA1表现出最高的乙醇酸产量（补充图3）。因此，后续实验采用Ptac启动子和RBS34组合表达途径基因。
摇瓶发酵分析显示，GA1在48 h后乙醇酸产量为4.3 g/L，生产强度为0.09 g/L/h（图2）。
上述结果证实，通过靶向基因整合和代谢重编程，在GA1中成功构建了功能性乙醇酸生物合成途径。然而，大量副产物积累（8.3 g/L乙酸、3.9 g/L丙酮酸和1.0 g/L乳酸）表明需要进一步优化途径。
体外催化效率高对酶在体内发挥功能至关重要，但不一定与优异的生产性能相关——微生物发酵受底物可用性、辅因子平衡、蛋白表达和胞内通量等因素影响。为验证这一假设，我们将GA1中的AaghrA分别替换为EcghrA、BsghrA、CsghrA和KpghrA，构建了一系列同源菌株GA1-Ec、GA1-Bs、GA1-Cs和GA1-Kp，并在摇瓶发酵中评估乙醇酸产量和细胞生长（OD600）。值得注意的是，AaGhrA在乙醇酸产量方面优于其他来源（补充表5）。
【数据】AaGhrA kcat/KM：1047.82 s⁻¹ mM⁻¹；相对EcGhrA提高72.95%、BsGhrA提高199.66%、CsGhrA提高28.72%、KpGhrA提高321.42%；GA1摇瓶乙醇酸产量：4.3 g/L（48 h）；生产强度：0.09 g/L/h；副产物：8.3 g/L乙酸、3.9 g/L丙酮酸、1.0 g/L乳酸；整合位点：yghx、yahj；启动子/RBS：Ptac/RBS34
3.2 系统代谢工程强化大肠杆菌乙醇酸生物合成
大肠杆菌中乙醇酸的生产受多个代谢瓶颈制约。为应对这些挑战，本研究实施了系统代谢工程改造以强化乙醇酸合成，包括：（i）增强前体供应，（ii）阻断副产物形成，（iii）阻断乙醇酸消耗，（iv）强化主合成途径。
前体合成方面。 柠檬酸和草酰乙酸是调控碳流入TCA循环的关键代谢节点，也是乙醇酸生物合成的重要前体。前期研究表明，过表达gltA可增强碳流入TCA循环。为验证这一点，将内源gltA整合至菌株GA1的rpnD位点，构建菌株GA2。摇瓶发酵显示，乙醇酸产量较GA1提高14.0%（4.9 g/L）（图3A）。
随后将gltA进一步整合至其他基因组位点（yeeL和alx），构建了具有双拷贝和三拷贝gltA的菌株GA2-2和GA2-3。摇瓶发酵结果显示，GA2-2和GA2-3的乙醇酸产量分别为5.2 g/L（提高20.9%）和4.6 g/L（提高7.0%）。这些结果表明GA2-2为最优菌株——进一步过表达gltA并未显著提高乙醇酸产量（图3A）。
为增强草酰乙酸可用性，评估了两种策略：（i）过表达内源ppc基因（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶）和（ii）引入来自谷氨酸棒杆菌的异源pyc基因（丙酮酸羧化酶）。两个靶基因均整合至菌株GA2-2的yeep位点，分别获得菌株GA3（ppc过表达）和GA4（pyc过表达）。
摇瓶发酵分析表明，菌株GA3产4.6 g/L乙醇酸，较GA2-2降低11.5%。相比之下，菌株GA4乙醇酸产量较GA2-2提高9.6%（5.7 g/L），且不影响细胞生长（图3A）。此外，GA4中丙酮酸浓度降低了53.8%（从3.9 g/L降至1.8 g/L）（图3D）。PEP和丙酮酸节点相关基因的转录分析也显示，pyc基因过表达导致该基因转录水平升高，同时乙醇酸产量也增加（补充表6），表明更多碳流向TCA循环。
副产物阻断方面。 菌株GA4表现出较高的副产物积累（7.0 g/L乙酸和1.1 g/L乳酸），对细胞代谢产生负面影响。为缓解这一问题，敲除了关键副产物形成基因：（1）poxB（编码丙酮酸氧化酶）和ackA（编码乙酸合成）以及（2）ldhA（编码乳酸脱氢酶），构建菌株GA5。摇瓶发酵证实乙醇酸产量提高19.3%（6.8 g/L）（图3B），乙酸降低67.1%（2.3 g/L）。乳酸生产完全消除（图3D）。
乙醇酸消耗阻断方面。 乙醇酸可通过两条途径被代谢：（i）由glcDEF（编码乙醇酸氧化酶）氧化为乙醛酸，或（ii）由aldA（编码乙醛脱氢酶）转化为乙醇醛。为阻止乙醇酸消耗，在菌株GA5中分别单基因敲除glcDEF和aldA，构建菌株GA6和GA7。摇瓶实验显示，乙醇酸产量分别为7.4 g/L（GA6）和7.7 g/L（GA7），较GA5分别提高8.8%和13.2%（原文节选至此）。
【数据】GA2（gltA单拷贝）：4.9 g/L，较GA1提高14.0%；GA2-2（gltA双拷贝）：5.2 g/L，提高20.9%；GA2-3（gltA三拷贝）：4.6 g/L，提高7.0%；GA3（ppc过表达）：4.6 g/L，较GA2-2降低11.5%；GA4（pyc过表达）：5.7 g/L，提高9.6%；GA4丙酮酸：1.8 g/L（降低53.8%）；GA5（敲除poxB+ackA+ldhA）：6.8 g/L，提高19.3%；乙酸2.3 g/L（降低67.1%）；乳酸完全消除；GA6（敲除glcDEF）：7.4 g/L，提高8.8%；GA7（敲除aldA）：7.7 g/L，提高13.2%
讨论与解读
本研究系统解决了大肠杆菌工业化生产乙醇酸的三大瓶颈：质粒和化学诱导剂依赖（增加成本并复杂化下游纯化）、合成途径辅因子失衡（限制途径效率）以及菌株营养缺陷型特征（需要外源营养 supplementation）。
研究策略层层递进：首先筛选高活性AaGhrA酶并通过模块化优化构建无质粒菌株；其次通过辅因子工程将AaGhrA的辅因子偏好从NADPH改造为NADH以平衡胞内辅因子；最后整合生长偶联启动子与蛋白降解标签，使E. coli GA26无需L-谷氨酸 supplementation即可高效生产乙醇酸。最终工程菌GA26在5 L生物反应器中实现乙醇酸产量81.5 g/L、产率0.49 g/g葡萄糖、生产强度1.9 g/L/h，为目前报道的以葡萄糖为底物的最高乙醇酸产量。
编译者解读： 该研究展示了合成生物学系统代谢工程的经典范式——从关键酶筛选（跨物种比较基因组挖掘）、途径模块化优化（启动子/RBS组合、拷贝数精细调控）、辅因子工程（NADPH→NADH偏好切换）到动态调控（生长阶段依赖性分子开关）的全链条整合。其突出价值在于"无质粒、无诱导剂、无营养缺陷"的设计理念，大幅降低了工业化生产的下游纯化成本与质粒不稳定性风险。局限在于多轮基因组编辑耗时较长，且5 L反应器规模仍需进一步放大验证。该策略对其它有机酸的绿色生物制造具有借鉴意义。
参考来源
期刊：Metabolic Engineering, 2026
DOI: 10.1016/j.ymben.2025.12.006
DOI: 10.1016/j.ymben.2025.12.006