来源：Tailoring Escherichia coli for high-yield production of O-acetyl-L-homoserine through multi-node metabolic regulation（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
O-乙酰-L-高丝氨酸（OAH）是L-甲硫氨酸及多种C4化合物的关键前体，工业价值显著。本研究通过模块化改造L-高丝氨酸与乙酰-CoA两条合成路径，结合sRNA筛选、启动子工程及动态调控等手段，最终构建出无质粒、非营养缺陷型大肠杆菌菌株OAH37。在5 L生物反应器中采用两阶段pH控制策略，OAH产量达到94.1 g/L，产率0.42 g/g葡萄糖，生产强度1.37 g/L/h，为目前报道的最高水平。
研究背景
OAH是L-高丝氨酸的乙酰化衍生物，可水解生成L-高丝氨酸，或经酶促转化生成L-甲硫氨酸。L-甲硫氨酸作为含硫必需氨基酸，在食品、饲料、医药和化妆品领域应用广泛，但其生产仍以化学合成为主。由于L-甲硫氨酸的微生物直接合成受复杂调控网络限制，业界转而采用"先发酵生产OAH前体、再酶法转化为L-甲硫氨酸"的策略——CJ CheilJedang-Arkema公司已于2014年将该工艺放大至年产8万吨规模。因此，优化微生物OAH生物合成路径，对降低生产成本、拓展工业应用具有直接价值。
研究方法
2.1 菌株与质粒
大肠杆菌DH5α用于质粒构建。L-高丝氨酸生产菌株HSY6（源自大肠杆菌W3110）被改造为OAH生产菌株。低拷贝质粒pAC-T（源自pACYC duet-1）用于评估异源基因性能。此外，使用pSEVA421衍生物，其携带基于MicC的sRNA表达盒，含24-mer靶标结合序列，受J23119启动子控制，用于靶点筛选。本研究所用菌株列于原文表1，菌株进化详细信息见原文表S1和图S1，所用质粒见原文表S2。
【数据】宿主菌：E. coli DH5α、HSY6（源自W3110）；质粒：pAC-T（低拷贝）、pSEVA421衍生物（MicC-sRNA，24-mer结合序列，J23119启动子）
2.2 基因操作与质粒构建
采用改良CRISPR-Cas9系统进行基因组编辑。将靶向敲除位点的20-bp gRNA通过引物引入pTarget质粒。使用Super-Fidelity DNA聚合酶（Vazyme，南京）扩增敲除位点上下游各500-bp片段作为同源臂。线性化pTarget与同源臂（如需基因插入则包含目标基因片段）通过Clon-Express Ultra One-step Cloning Kit（Vazyme，南京）连接，转化至E. coli DH5α构建pTarget-Donor质粒。将pEcCas与pTarget-Donor共转化至目标菌株进行基因编辑，通过菌落PCR确认编辑成功。质粒消除分别通过鼠李糖（pTarget-Donor）和蔗糖（pEcCas）实现。对于sRNA筛选质粒，通过引物设计和PCR引入与AUG互补的24-mer靶标结合序列。
【数据】gRNA长度：20-bp；同源臂：500-bp；质粒消除：鼠李糖（pTarget-Donor）、蔗糖（pEcCas）；sRNA结合序列：24-mer
2.3 摇瓶培养
工程菌株于−80°C保存，在琼脂平板上37°C过夜活化。挑取单菌落接种于含10 mL LB培养基（胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g/L）的试管中，37°C培养10 h制备种子液。随后以2%接种量转接至装有50 mL MS培养基的500 mL摇瓶中，MS培养基组成为：葡萄糖40 g、(NH4)2SO4 17 g、酵母提取物4 g、KH2PO4 1 g、CaCO3 0.02 g、MgSO4 1 g、FeSO4·7H2O 0.005 g、MnSO4·8H2O 0.0025 g、ZnSO4 0.005 g/L。30°C、200 rpm振荡培养48 h。根据需要向发酵培养基中补充L-赖氨酸、L-苏氨酸和L-甲硫氨酸。
【数据】活化温度：37°C；种子培养：10 mL LB、37°C、10 h；接种量：2%；培养基：MS（葡萄糖40 g/L、(NH4)2SO4 17 g/L、酵母提取物4 g/L、KH2PO4 1 g/L、CaCO3 0.02 g/L、MgSO4 1 g/L、FeSO4·7H2O 0.005 g/L、MnSO4·8H2O 0.0025 g/L、ZnSO4 0.005 g/L）；培养条件：30°C、200 rpm、48 h
2.4 生物反应器补料分批发酵
单菌落接种于含10 mL LB培养基的50 mL摇瓶中，37°C培养12 h建立一级种子液。随后以1%接种量转接至含LB培养基的500 mL摇瓶中，37°C培养10 h制备二级种子液。将种子液接种至含2 L LMS培养基的5 L发酵罐中，LMS培养基组成为：葡萄糖15 g、(NH4)2SO4 17 g、酵母提取物4 g、KH2PO4 1 g、MgSO4 1 g、FeSO4·7H2O 0.005 g、MnSO4·8H2O 0.0025 g、ZnSO4 0.005 g/L，30°C进行OAH生产。通过添加25% NH3·H2O（v/v）自动维持pH，通过搅拌转速控制溶解氧。通过自动补加葡萄糖溶液（含葡萄糖600 g、KH2PO4 15 g、(NH4)2SO4 12.5 g/L）将葡萄糖浓度控制在5 g/L以下。根据需要添加苏氨酸。
【数据】一级种子：10 mL LB、37°C、12 h；二级种子：1%接种量、LB、37°C、10 h；发酵罐：5 L，装液量2 L LMS培养基（葡萄糖15 g/L、(NH4)2SO4 17 g/L、酵母提取物4 g/L、KH2PO4 1 g/L、MgSO4 1 g/L、FeSO4·7H2O 0.005 g/L、MnSO4·8H2O 0.0025 g/L、ZnSO4 0.005 g/L）；温度30°C；pH控制：25% NH3·H2O；补料：葡萄糖600 g/L、KH2PO4 15 g/L、(NH4)2SO4 12.5 g/L；残糖控制：<5 g/L
2.5 发酵液分析方法
细胞生长通过分光光度计（Mapada，上海）在600 nm处测定吸光度监测。残留葡萄糖浓度采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定。OAH及其他氨基酸的定量采用高效液相色谱（HPLC）（Agilent 1260系列，CA，USA），使用柱前衍生化邻苯二甲醛（OPA）法。有机酸采用Aminex HPX-87H色谱柱（300 mm × 7.8 mm，Bio-Rad，CA，USA）在HPLC上分析。
【数据】细胞生长：OD600；葡萄糖：DNS法；氨基酸：HPLC-OPA柱前衍生；有机酸：Aminex HPX-87H柱（300 mm × 7.8 mm）
2.6 胞内乙酰-CoA、ATP及NADH/NAD+测定
工程菌株在MS培养基中30°C培养12 h。12000 rpm离心1 min收集菌体。胞内乙酰-CoA浓度使用乙酰-CoA比色测定试剂盒（Elabscience，武汉）测定。ATP浓度使用增强型ATP检测试剂盒（Beyotime，上海）测定。NADH/NAD+使用NAD+/NADH检测试剂盒（WST-8）（Beyotime，上海）测定。
【数据】培养：MS培养基、30°C、12 h；离心：12000 rpm、1 min；试剂盒：乙酰-CoA比色试剂盒（Elabscience）、增强型ATP试剂盒（Beyotime）、NAD+/NADH试剂盒（WST-8，Beyotime）
2.7 荧光强度测定
含目标质粒的菌株接种于含10 mL LB（或MS）培养基的50 mL摇瓶中，37°C（或30°C）培养12 h。使用多功能酶标仪（BioTek Synergy H1，CA，USA）在96孔板中记录细胞培养物荧光，每孔含200 μL菌液。增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的激发和发射波长分别设为488 ± 5 nm和520 ± 5 nm。通过测定600 nm吸光度将所有荧光值归一化至细胞密度。
【数据】培养：10 mL LB/MS、37°C/30°C、12 h；检测：BioTek Synergy H1、96孔板、200 μL/孔；eGFP激发488 ± 5 nm、发射520 ± 5 nm；归一化：OD600
2.8 统计分析
数据为三次独立培养的平均值±标准差。组间显著性差异采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Dunnett多重比较检验。显著性标准设定为：0.01 < p < 0.05（∗）、p < 0.01（∗∗）、p < 0.001（∗∗∗）。
【数据】重复次数：3次独立培养；统计方法：one-way ANOVA + Dunnett检验；显著性阈值：∗ p<0.05、∗∗ p<0.01、∗∗∗ p<0.001
研究结果
3.1 增强L-高丝氨酸供应并筛选MetX实现OAH初始积累
大肠杆菌缺乏内源MetX，因此将谷氨酸棒杆菌来源的MetX通过低拷贝质粒pAC-T引入此前构建的L-高丝氨酸生产菌株HSY6，获得菌株OAH0X（图2A），摇瓶发酵OAH产量为5.29 g/L（图2B）。为防止氨基酸缺陷导致发酵过程难以控制，补全了L-赖氨酸（lysA）和L-甲硫氨酸途径（metA、metB、metJ、metL），OAH1X和OAH2X菌株的生长和生产均得到改善（图2B）。
作为OAH的前体，增强L-高丝氨酸合成可提高OAH产量。此外，高效的L-高丝氨酸生物合成异源基因已被鉴定。因此，在菌株OAH2X中依次整合了谷氨酸棒杆菌来源的天冬氨酸氨基转移酶（aspB cg 编码）、枯草芽孢杆菌来源的谷氨酸合酶（gltAB bs 编码）和铜绿假单胞菌来源的天冬氨酸激酶（lysC pa 编码），获得菌株OAH3X、OAH4X和OAH5-1。发酵48 h后，OAH5-1的产量和单位OD生产率显著提高，OAH产量达8.34 g/L，较OAH2X提高37.6%（图2B）。上述结果证明了补充氨基酸合成途径和增强前体L-高丝氨酸生物合成对工程菌高效生产OAH的重要性。
来自Cyclobacterium marinum、Sulfurimonas autotrophic、Trichlorobacter lovleyi和Deinococcus geothermalis的MetX已被证明在体外能高效催化OAH生物合成的最后关键步骤（图2A）。特别是，Leptospira meyeri来源的MetX（MetX lm ）经蛋白质工程改造后提升了E. coli中OAH的产量。为筛选更有前景的OAH生物合成候选酶，将来自L. meyeri、C. marinum、S. autotrophic、T. lovleyi和D. geothermalis的MetX克隆至pAC-T质粒，替换菌株OAH5-1中的metX cg 。令人意外的是，尽管MetX cm 并非酶活最高者，但其产量显著提升，达到8.85 g/L（图2C）。T. lovleyi来源的metX表现出更高的乙酰转移酶活性，但同时也具有丙酰转移酶和丁酰转移酶活性。较低的胞内特异性阻碍了乙酰-CoA的结合，这可能是其在体内OAH产量低于MetX cm 的原因。这表明酶活性的增加并不一定与代谢途径中的更大作用相关。
为进一步增强菌株的稳健性，将metX cm 整合至假基因位点ycjV，构建了无质粒菌株OAH6。OAH6的OAH产量达8.30 g/L，略低于携带质粒的菌株OAH5-3。这一差异可能归因于OAH6中metX基因的单拷贝整合（图2D）。值得注意的是，无质粒菌株OAH6在发酵早期表现出更快的OAH合成速率和更短的延滞期，但在后期被含质粒菌株超越（图2E）。这一差异可能由质粒负担和OAH5-3中metX的更高拷贝数所致。
【数据】OAH0X产量：5.29 g/L；OAH5-1产量：8.34 g/L（较OAH2X提高37.6%）；OAH5-3（MetX cm ）产量：8.85 g/L；OAH6（无质粒）产量：8.30 g/L；发酵时间：48 h
3.2 多管齐下增强乙酰-CoA合成以提升OAH产量
乙酰-CoA来源的乙酰基是OAH生物合成的另一重要模块。乙酰-CoA在多种生物合成反应中充当乙酰供体，其胞内通量和浓度受多个代谢检查点的严格调控。因此，优化乙酰-CoA的可利用性需要广泛的工程努力，包括途径增强、引入新合成路线、扩充CoA库及抑制竞争途径。本研究在菌株OAH6中系统探索了四种策略以提升其可利用性（图3A）：（i）分别敲除丙酮酸脱氢酶（PDH）负调控因子pdhR和过表达乙酰-CoA合成酶编码基因acs，以增强天然合成途径；（ii）过表达来自青春双歧杆菌的fxpK 引入异源非氧化糖酵解途径（NOG）；（iii）过表达恶臭假单胞菌来源的泛酸激酶编码基因coaA 以增加CoA可利用性（乙酰-CoA的限制因素）；（iv）分别敲除乙酸激酶编码基因ackA 和乙醇脱氢酶编码基因adhE 以减少竞争途径。
出乎意料的是，PDH上调的OAH7并未积累OAH（图3B）和L-高丝氨酸，反而积累了3.30 g/L乙酸。乙酰-CoA碳通量的溢出——通过pta-ackA途径驱动乙酸产生并抑制OAH合成——可通过acs与PDH的协同作用得到缓解，从而同时增强乙酰-CoA和OAH的产量。因此，在菌株OAH7的假基因fliK位点过表达acs，将乙酸浓度降至1.15 g/L，但仍未观察到OAH积累（图S2A）。值得注意的是，在菌株OAH6中补充5 g/L外源乙酸并未抑制OAH生物合成，反而使OAH产量增加1.12 g/L（图S2B），表明乙酸并非抑制OAH合成的主要因素。据报道，PDH催化丙酮酸转化为乙酰-CoA，伴随产生一分子NADH。我们测定了OAH7的氧化还原状态，发现其NADH/NAD+比值较OAH6高2.9倍（图S2C），表明PDH有效竞争丙酮酸用于合成乙酰-CoA，导致天冬氨酸分支缺乏前体。因此，在发酵过程中补充5 g/L天冬氨酸后，OAH7菌株成功产生2.10 g/L OAH（图S2D）。这些结果表明，不受控制的乙酰-CoA产生导致碳通量分布失衡，留给天冬氨酸衍生途径的通量不足。
此外，增强乙酰-CoA合成酶提高了菌株OAH8的OAH产量和细胞生产率（图3B）。各菌株的乙酰-CoA含量均有不同程度的增加（图3C）。特别是菌株OAH8的乙酰-CoA含量较对照高7.8倍，达到0.69 nmol/g湿重（图3C）。此外，经转录水平强度优化并由PJ23102驱动的fxpK ba 基因（图S3），使菌株OAH9的OAH产量显著提高13.7%，达到9.44 g/L（图3B）。这证实了适配的NOG强度可改善胞内乙酰-CoA浓度。然而，在OAH10中过表达泛酸激酶编码基因coaA pp 以增强CoA库，导致生物量增加但OAH产量下降。可能原因是CoA是多个代谢途径的辅因子，其增强导致碳代谢流重新分布。此外，我们注意到CoA和OAH的生物合成均需要丙酮酸和天冬氨酸作为前体。进一步在发酵培养基中分别补充5 g/L丙酮酸和天冬氨酸，发现外源补充天冬氨酸导致生物量积累显著降低，而OAH产量增加81.4%（图S4）。这些结果表明，OAH10中OAH产量降低主要是由天冬氨酸供应不足引起的。
【数据】OAH7乙酸积累：3.30 g/L；OAH7+acs过表达后乙酸：1.15 g/L；OAH6+5 g/L外源乙酸：OAH增加1.12 g/L；OAH7 NADH/NAD+比值：OAH6的2.9倍；OAH7+5 g/L天冬氨酸：OAH产量2.10 g/L；OAH8乙酰-CoA：0.69 nmol/g湿重（对照的7.8倍）；OAH9产量：9.44 g/L（提高13.7%）；OAH10+5 g/L天冬氨酸：OAH产量增加81.4%
讨论与解读
本研究通过系统代谢工程策略，成功构建了无诱导剂、无质粒、非营养缺陷型的OAH高产菌株OAH37。关键策略包括：将合成途径模块化为L-高丝氨酸和乙酰-CoA两个模块并分别强化；利用sRNA进行基因组规模靶点筛选和代谢状态分析；基于筛选结果识别代谢瓶颈，通过启动子工程、PUTR工程和优化衰减子精细调控代谢通量并动态调节苏氨酸途径；破坏ATP合酶并改善糖酵解底物水平磷酸化以增强ATP周转；采用两阶段pH控制发酵策略。最终菌株OAH37在5 L生物反应器中实现94.1 g/L OAH产量、1.37 g/L/h生产强度和0.42 g/g葡萄糖产率，为目前无质粒非营养缺陷型大肠杆菌OAH生产的最高报道值。
【数据】OAH37产量：94.1 g/L；产率：0.42 g/g葡萄糖；生产强度：1.37 g/L/h；发酵规模：5 L生物反应器；pH策略：两阶段控制（对数期6.5，后调至5.5）
编译者解读
该研究最值得借鉴之处在于"模块化+系统筛选+精细调控"的方法论闭环——先分模块强化前体供应，再用sRNA工具全局扫描代谢瓶颈，最后以启动子工程和动态调控精调通量。这种从粗放到精细的渐进策略，对同类氨基酸衍生物的菌株开发具有直接参考价值。值得注意的是，研究揭示的"酶活高不等于体内效果好"（MetX筛选）和"乙酰-CoA过量反而抑制合成"（PDH过表达实验）两个反直觉现象，提醒合成生物学工作者：体外酶学数据与胞内代谢环境的适配性，往往比绝对活性更决定成败。无质粒、非营养缺陷型的设计也显著降低了工业放大的成本和合规风险。局限在于，部分代谢中间产物的动态变化及酶动力学参数原文未详述，机制解释仍以生理表征为主。
参考来源
期刊：Metabolic Engineering, 2025
DOI: 10.1016/j.ymben.2025.06.010
DOI: 10.1016/j.ymben.2025.06.010