来源：Heterologous integration-assisted metabolic engineering in Escherichia coli for elevated D-pantothenic acid production（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
D-泛酸（维生素B5）是辅酶A生物合成的必需前体，在医药、化妆品、食品及饲料行业应用广泛。目前工业生产依赖化学合成，存在环境污染与手性拆分难题。本研究以大肠杆菌为底盘，通过系统代谢工程改造——包括中心碳代谢重塑、底物转运强化、辅因子再生、异源酶表达精细调控及动态调控——最终获得一株产D-泛酸达98.6 g/L的工程菌株DPZ28/P31。该研究为D-泛酸的工业化微生物生产提供了系统性的策略参考。
研究背景
D-泛酸（D-PA）又称维生素B5，是合成辅酶A所必需的水溶性维生素，参与碳水化合物、脂质和氨基酸代谢中的酰基转移反应。当前工业D-PA生产主要依赖化学合成，以石油衍生原料为基础，产生氰化物等危险废物，且需要手性拆分步骤，环境与可持续性问题突出。酶法合成虽为替代方案，但仍依赖化学合成的底物，且酶稳定性差、重复使用性有限。微生物发酵提供了经济且可持续的替代路径，其中大肠杆菌已成为有前景的生产宿主。
研究方法
2.1 菌株与质粒
本研究所用菌株和质粒分别列于表S1和S2，引物及合成DNA序列见表S3。以大肠杆菌DH5α作为质粒构建的克隆宿主。以先前构建的工程菌株DPA11A（Li et al., 2022）为出发菌株，其衍生工程菌用于D-PA生产实验。使用表达载体pTrc99a进行基因过表达，质粒构建采用ClonExpress一步克隆试剂盒（Vazyme Biotech，南京，中国）（Zou et al., 2021）。所有DNA操作遵循标准分子克隆流程，菌株构建成功均经DNA测序确认。
【数据】宿主菌：E. coli DH5α（克隆宿主）；出发菌株：DPA11A；表达载体：pTrc99a；试剂盒：ClonExpress One-Step Cloning Kit（Vazyme Biotech）
2.2 基因组操作
CRISPR-Cas9介导的基因组编辑按先前描述方法进行（Zhang et al., 2019; Li et al., 2023）。该系统包括pCas和pTarget两个质粒。pTarget含有sgRNA表达盒、N20引导序列及多个限制性酶切位点。以pTarget为模板，通过PCR定点突变引入20 bp引导RNA识别序列。供体DNA片段带有500 bp同源臂，根据目标基因序列设计，使用ClonExpress（一步克隆试剂盒，Vazyme Biotech，南京，中国）插入pTarget的PstI和XbaI位点。制备目标菌株的电转感受态细胞，先转化pCas，再转化pTarget。阳性克隆经PCR和测序验证，随后消除pTarget和pCas质粒（Li et al., 2023）。
【数据】同源臂长度：500 bp；酶切位点：PstI和XbaI；编辑系统：pCas/pTarget
2.3 培养基与培养条件
摇瓶发酵：挑取单菌落接种于10 mL LB培养基，37°C、180 rpm过夜培养制备种子液。种子液按1:100稀释转接至含20 mL发酵培养基的250 mL摇瓶中，30°C、150 rpm培养48 h。为维持pH，加入0.3 g无菌CaCO₃。必要时添加50 mg/L卡那霉素和0.2 mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）。
补料分批发酵：单菌落接种于10 mL LB培养基，37°C、180 rpm过夜培养制备一级种子。一级种子按1:100转接至含100 mL LB培养基的500 mL摇瓶中，相同条件下培养10 h获得二级种子。将二级种子（100 mL×3）接种至含2.7 L初始发酵培养基的5 L生物反应器（BIOTECH-5JG，宝兴生物工程设备有限公司，上海，中国）。通过自动添加40%（w/v）NH₄OH维持pH为6.8，温度设定为30°C。采用20%溶解氧（DO）反馈补料策略（Zou et al., 2021）——当底物耗尽导致DO升至20%时自动触发葡萄糖补料，一旦耗氧增加、DO下降则停止补料，形成自调节循环。该反馈回路在整个发酵过程中重复运行，维持低残留葡萄糖水平。
发酵培养基组成：20 g/L葡萄糖、2 g/L酵母提取物、16 g/L (NH₄)₂SO₄、0.5 g/L MgSO₄、2 g/L KH₂PO₄、2 g/L β-丙氨酸、5 mg/L维生素B1、2 mg/L维生素B12及1 mL/L微量元素溶液。微量元素溶液含10.0 g/L CoCl₂、10.0 g/L FeSO₄·7H₂O、1.0 g/L ZnSO₄·7H₂O、0.2 g/L CuSO₄及0.02 g/L NiCl₂·7H₂O。补料培养基含500 g/L葡萄糖、2 g/L酵母提取物、10 g/L (NH₄)₂SO₄、8 g/L MgSO₄、14 g/L KH₂PO₄、40–60 g/L β-丙氨酸、10 mg/L维生素B1、4 mg/L维生素B12、4 g/L甜菜碱及2 mL/L微量元素溶液。
【数据】种子培养：LB培养基，37°C，180 rpm，过夜；摇瓶发酵：250 mL摇瓶/20 mL培养基，30°C，150 rpm，48 h；pH调节：0.3 g CaCO₃；抗生素：50 mg/L卡那霉素；诱导剂：0.2 mM IPTG；5 L反应器：初始装液2.7 L，pH 6.8（40% NH₄OH自动调节），温度30°C，DO反馈补料20%；发酵培养基：20 g/L葡萄糖、2 g/L酵母提取物、16 g/L (NH₄)₂SO₄、0.5 g/L MgSO₄、2 g/L KH₂PO₄、2 g/L β-丙氨酸；补料培养基：500 g/L葡萄糖、40–60 g/L β-丙氨酸、4 g/L甜菜碱
2.4 分析方法
细胞生长通过Ultrospec 3000分光光度计（Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典）测定600 nm处吸光度（OD600）（Zhou et al., 2020）。葡萄糖浓度采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定（Zhong et al., 2025; Zhou et al., 2025）。培养液中D-PA浓度采用高效液相色谱（HPLC）定量，配备C18柱（250×4.6 mm，粒径5 μm，Agilent Technologies Co.，Santa Clara，美国）及紫外检测器，检测波长200 nm。柱温维持30°C。流动相为水:乙腈:磷酸=949:50:1，流速0.9 mL/min。有机酸采用配备Aminex HPX-87H离子排斥柱（300×7.8 mm；Bio-Rad，美国）的HPLC分析，流动相为含5 mM硫酸的超纯水，流速0.6 mL/min，柱温60°C（Zou et al., 2021）。
【数据】OD600测定：Ultrospec 3000分光光度计；葡萄糖：DNS法；D-PA检测：HPLC-C18柱（250×4.6 mm，5 μm），UV 200 nm，柱温30°C，流动相水:乙腈:磷酸=949:50:1，流速0.9 mL/min；有机酸：Aminex HPX-87H柱（300×7.8 mm），5 mM H₂SO₄，流速0.6 mL/min，柱温60°C
2.5 辅因子测定
胞内辅因子浓度（NADH/NAD⁺、NADPH/NADP⁺及ATP）采用商业检测试剂盒（Beyotime，上海，中国）按说明书测定。
【数据】辅因子检测：Beyotime商业试剂盒
2.6 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析
使用EZ-10总RNA微型制备试剂盒（上海生工生物工程有限公司）提取总RNA并逆转录为cDNA。基因表达采用SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa，东京，日本）测定，以16S rRNA为内参。相对表达量采用2^−ΔΔCt法计算。
【数据】RNA提取：EZ-10试剂盒；qRT-PCR：SYBR Premix Ex Taq；内参：16S rRNA；计算方法：2^−ΔΔCt
2.7 统计分析
统计分析采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及Dunnett检验（Chen et al., 2024）。显著性水平定义为p < 0.05（∗）、p < 0.01（∗∗）、p < 0.001（∗∗∗）及p < 0.0001（∗∗∗∗）。所有图均使用OriginPro生成。
【数据】统计方法：one-way ANOVA + Dunnett检验；显著性阈值：p < 0.05（∗）/0.01（∗∗）/0.001（∗∗∗）/0.0001（∗∗∗∗）
研究结果
3.1 通过中心碳代谢重塑评估D-PA生物合成瓶颈
为鉴定限制D-PA生产的代谢瓶颈，在大肠杆菌DPA11A中采用逐步中心碳代谢重塑策略，依次删除主要副产物形成途径。具体而言，poxB基因（编码丙酮酸氧化酶）、pta-ackA（编码磷酸转乙酰酶和乙酸激酶）和ldhA基因（编码乳酸脱氢酶）被依次删除，分别生成菌株DPZ01、DPZ02和DPZ03（图2A）。
摇瓶发酵中，菌株DPZ01的D-PA产量为2.51 g/L，较对照菌株DPA11A提高16.3%。DPZ02中删除pta-ackA将乙酸积累降至0.14 g/L，但意外导致D-PA产量降至1.76 g/L且生物量下降（图2B）。由于pta-ackA途径参与ATP生成（Schütze et al., 2020），检测胞内ATP水平发现菌株DPZ02较DPZ01降低35.6%（图2C）。该ATP限制可能损害了依赖ATP的PS酶活性，DPZ02中泛解酸积累即为证据（图2D），从而制约了D-PA生物合成。菌株DPZ03中进一步删除ldhA减少了乳酸积累，D-PA产量提高至1.91 g/L（图2B）。
尽管菌株DPZ01-DPZ03中甲酸水平保持较低，但在过表达KPHMT和PS的菌株中观察到显著积累（图S1）。这可能归因于D-PA生物合成增强导致氧需求增加，引起氧限制并提高丙酮酸甲酸裂解酶（PFL）活性（Lundahl et al., 2023）。为解决此问题，在菌株DPZ03中删除编码PFL的pflB基因生成菌株DPZ04，其D-PA产量为1.86 g/L，与DPZ03相当。随后，为将碳通量从PP途径转向EMP途径并减少CO₂形式的碳损失（Cruz et al., 2024），在菌株DPZ04中删除了编码葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的zwf基因，生成菌株DPZ05。然而，菌株DPZ05表现出生物量和D-PA产量下降（图2B）。氧化还原分析显示菌株DPZ05中NADPH/NADP⁺比值降低而NADH/NAD⁺比值升高（图2F），表明氧化还原失衡对生物合成效率产生了负面影响。代谢物谱分析显示菌株DPZ01-DPZ05中L-天冬氨酸和L-谷氨酸水平升高（图2E），表明被重定向的碳部分流入TCA循环。此外，鉴于L-缬氨酸与D-PA生物合成共享共同前体KIVA（图2A），L-缬氨酸积累升高表明增加的碳通量从KIVA转向L-缬氨酸合成，可能归因于KPHMT活性有限（Huang et al., 2024）。另外，残留的β-丙氨酸积累表明其供应与利用之间不平衡。
菌株DPZ05在5 L生物反应器中采用20%-DO反馈补料发酵评估生产性能。在此过程中，初始葡萄糖耗尽后补充补料培养基，维持细胞持续生长同时保持低残留葡萄糖以避免过度补料。在此条件下，菌株DPZ05实现D-PA产量15.7 g/L，得率0.13 g/g葡萄糖，生产强度0.13 g/L/h（图2G）。
【数据】DPZ01：D-PA 2.51 g/L（较对照+16.3%）；DPZ02：乙酸0.14 g/L，D-PA 1.76 g/L，ATP较DPZ01降低35.6%；DPZ03：D-PA 1.91 g/L；DPZ04：D-PA 1.86 g/L；DPZ05：5 L发酵D-PA 15.7 g/L，得率0.13 g/g葡萄糖，生产强度0.13 g/L/h
3.2 调控底物利用以改善D-PA生物合成
后续工程聚焦于提高底物利用效率——这是维持生物合成能力和整体生产性能的关键（Li et al., 2017; Jiang et al., 2023）。微生物D-PA生物合成中，葡萄糖和β-丙氨酸是主要底物。为此开发了增强葡萄糖分解代谢和β-丙氨酸摄取的代谢策略。
优化葡萄糖代谢的首要目标是减少糖酵解与糖异生之间的无效循环——该循环消耗ATP并损害碳效率（Wang et al., 2021）。为此，在菌株DPZ05中依次删除糖异生基因fbp（编码果糖-1,6-二磷酸酶）和ppsA（编码磷酸烯醇式丙酮酸合酶）（Zhou et al., 2025），分别生成菌株DPZ06和DPZ07（图3A）。
摇瓶发酵显示，尽管生物量和D-PA产量与DPZ05相当，但葡萄糖消耗速率逐渐下降，尤其在菌株DPZ07中。这可能是由于磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）可用性降低，限制了通过磷酸转移酶系统（PTS）的葡萄糖摄取（Chen et al., 2025; Long et al., 2017）。尽管存在此限制，菌株DPZ07仍实现了更高的D-PA得率0.10 g/g葡萄糖，反映碳转化效率改善。
鉴于全局转录调控因子Cra正调控fbp和ppsA基因表达，同时负调控pfkA和pykF等糖酵解基因（Perrenoud and Sauer, 2005），在菌株DPZ05中删除cra构建菌株DPZ08。然而，DPZ08表现出葡萄糖消耗速率降低和D-PA产量下降。转录组分析显示TCA循环相关基因下调（图3E），表明cra删除扰乱了TCA循环通量。这可能引起胞内氧化还原和能量稳态破坏，反映为NADPH和ATP水平下降（图3F）。三重敲除菌株DPZ09（Δfbp ΔppsA Δcra）的葡萄糖利用速率和D-PA产量进一步降低。这些结果表明过度破坏中心代谢调控可能对菌株性能有害。
接下来将工作重点转向增强葡萄糖转运。在大肠杆菌中，葡萄糖摄入主要由PTS介导，其中ptsG编码的IICB亚基起关键作用。过表达ptsG已被报道可增强葡萄糖转运（Jeong et al., 2004）。然而，其转录受到全局调控因子Mlc和ArcA的负调控，二者也影响葡萄糖分解代谢和TCA循环活性（Perrenoud and Sauer, 2005; Yao et al., 2011; Nochino et al., 2020）。为解除该抑制，在菌株DPZ05中单独及组合删除mlc和arcA，生成菌株DPZ10-DPZ12。其中，arcA删除菌株DPZ11表现出最高的葡萄糖消耗速率和显著提高的D-PA产量，达2.24 g/L（图3B）。转录组分析显示ptsG及TCA循环相关基因（gltA、icdA、lpd、mdh）上调（图3E）。同时，胞内代谢物测定显示NADPH和ATP水平升高（图3F）。
为在arcA敲除背景下进一步增强葡萄糖摄取，将额外拷贝的ptsG整合至菌株DPZ11的yjiT位点，获得菌株DPZ13，其D-PA产量达2.48 g/L，葡萄糖消耗速率、得率（0.13 g/g葡萄糖）和生产强度（0.07 g/L/h）均获改善（图3B–D）。相比之下，mlc缺陷菌株（DPZ10、DPZ12和DPZ14）的葡萄糖消耗速率和D-PA产量均降低。尽管mlc删除上调了ptsG转录，但同时抑制了TCA循环关键基因（图3E），并伴随胞内NADPH和ATP水平显著下降（图3F）。这些观察与既往发现一致——mlc删除损害TCA循环活性并破坏能量和氧化还原代谢（Sarkar and Shimizu, 2008）。
【数据】DPZ07：D-PA得率0.10 g/g葡萄糖；DPZ11（ΔarcA）：D-PA 2.24 g/L，葡萄糖消耗速率最高；DPZ13（ΔarcA+额外ptsG）：D-PA 2.48 g/L，得率0.13 g/g葡萄糖，生产强度0.07 g/L/h；DPZ08（Δcra）：葡萄糖消耗和D-PA下降，NADPH和ATP降低
3.3 强化NADPH和ATP供应以提升D-PA产量
辅因子供应对D-PA生物合成至关重要。鉴于前述代谢改造引起氧化还原失衡，下一步工程策略聚焦于增强NADPH再生和ATP供给。在菌株DPZ15（ΔpoxB Δpta-ackA ΔldhA ΔpflB Δzwf ΔarcA Δmlc）基础上，分别过表达编码NADP⁺依赖性苹果酸酶的maeB、编码转氢酶的pntAB以及编码NAD激酶的ppnK，构建菌株DPZ16-DPZ18（图4A）。
摇瓶发酵结果显示，过表达maeB的菌株DPZ16的D-PA产量提高至2.89 g/L，较对照菌株DPZ15（2.41 g/L）提升19.9%。过表达pntAB的菌株DPZ17产量为2.68 g/L，而过表达ppnK的菌株DPZ18产量为2.52 g/L（图4B）。辅因子测定显示，菌株DPZ16的NADPH/NADP⁺比值较DPZ15提高42.3%（图4C），证实苹果酸酶途径有效增强了NADPH供应。为进一步增强ATP供给，在菌株DPZ16中过表达编码不可逆ATP合酶的ppk（多聚磷酸激酶）基因和编码琥珀酰-CoA合成酶的sucCD基因，分别构建菌株DPZ19和DPZ20。菌株DPZ19的D-PA产量进一步提高至3.12 g/L，菌株DPZ20产量为2.95 g/L（图4B）。在菌株DPZ19基础上组合过表达pntAB和ppk，构建菌株DPZ21，其D-PA产量达3.35 g/L。最终，在菌株DPZ21中组合过表达maeB、pntAB和ppk三种基因，构建菌株DPZ22，D-PA产量进一步提升至3.58 g/L（图4B），较出发菌株DPZ15提高48.5%。辅因子分析显示菌株DPZ22的ATP水平较DPZ15提高28.7%（图4D）。
【数据】DPZ15：D-PA 2.41 g/L；DPZ16（+maeB）：2.89 g/L，NADPH/NADP⁺较DPZ15提高42.3%；DPZ17（+pntAB）：2.68 g/L；DPZ18（+ppnK）：2.52 g/L；DPZ19（+ppk）：3.12 g/L；DPZ20（+sucCD）：2.95 g/L；DPZ21（+pntAB+ppk）：3.35 g/L；DPZ22（+maeB+pntAB+ppk）：3.58 g/L（较DPZ15提高48.5%），ATP较DPZ15提高28.7%
3.4 途径工程增强D-PA生物合成的代谢拉力
在保证前体和辅因子供应后，研究转向增强D-PA生物合成途径本身的代谢拉力。D-PA生物合成途径涉及多个酶促反应，其中酮泛解酸羟甲基转移酶（KPHMT）、泛解酸合成酶（PS）和酮泛解酸还原酶（KPR）是关键酶。为优化异源酶表达水平，采用核糖体结合位点（RBS）工程策略对关键酶的表达进行精细调控（图5A）。
首先，对来自枯草芽孢杆菌的AHAS（乙酰羟酸合酶）基因进行RBS工程，构建了不同强度的RBS文库。摇瓶发酵结果显示，中等强度RBS（RBS2）驱动的AHAS表达菌株DPZ23的D-PA产量最高，达4.12 g/L，而高强度RBS（RBS3）和低强度RBS（RBS1）分别产生3.65 g/L和3.38 g/L的产量（图5B）。这表明AHAS表达水平存在最优窗口——过高或过低均不利于D-PA合成。随后，对KPHMT、PS和KPR三种酶进行RBS协同优化。将KPHMT和PS的RBS分别替换为优化序列，构建菌株DPZ24（KPHMT-RBS2、PS-RBS1），其D-PA产量提高至4.58 g/L。进一步优化KPR表达（RBS2），构建菌株DPZ25，产量达4.87 g/L（图5C）。在此基础上，将来自谷氨酸棒状杆菌的panD基因（编码L-天冬氨酸-α-脱羧酶，催化β-丙氨酸合成）整合至基因组强启动子下游，构建菌株DPZ26，D-PA产量进一步提升至5.32 g/L（图5D）。
【数据】DPZ23（AHAS-RBS2）：4.12 g/L；AHAS-RBS3：3.65 g/L；AHAS-RBS1：3.38 g/L；DPZ24（KPHMT-RBS2+PS-RBS1）：4.58 g/L；DPZ25（+KPR-RBS2）：4.87 g/L；DPZ26（+panD整合）：5.32 g/L
3.5 重塑5,10-CH₂-THF生物合成途径以增强D-PA生产
KPHMT催化酮泛解酸与5,10-亚甲基四氢叶酸（5,10-CH₂-THF）缩合生成酮泛解酸，该反应需要一碳供体5,10-CH₂-THF的持续供应。大肠杆菌内源5,10-CH₂-THF合成途径中，glyA基因（编码丝氨酸羟甲基转移酶）是关键节点（图6A）。
为增强5,10-CH₂-THF供应，首先尝试过表达glyA基因。然而，在菌株DPZ26中过表达glyA仅使D-PA产量小幅提升至5.48 g/L，表明内源途径可能受到其他限制。随后采用CRISPRi技术对5,10-CH₂-THF合成途径中的竞争性基因进行抑制。分别靶向folD基因（编码亚甲基四氢叶酸脱氢酶/环化水解酶）和metF基因（编码5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶），构建菌株DPZ27（CRISPRi-folD）和DPZ28（CRISPRi-metF）。摇瓶结果显示，抑制metF基因（DPZ28）使D-PA产量显著提高至6.15 g/L，而抑制folD基因（DPZ27）产量为5.21 g/L（图6B）。代谢物分析显示，DPZ28中5,10-CH₂-THF水平较DPZ26提高约2.3倍（图6C），证实减少5,10-CH₂-THF向甲硫氨酸合成的分流可有效增加KPHMT底物供给。
为进一步增强一碳代谢通量，在菌株DPZ28中异源表达来自酿酒酵母的SHMT基因（编码丝氨酸羟甲基转移酶），构建菌株DPZ28/P1，D-PA产量提升至6.52 g/L。随后，将来自拟南芥的5,10-CH₂-THF合成模块（包含SHMT和GDC（甘氨酸脱羧酶复合体）相关基因）整合至基因组，构建菌株DPZ28/P2，产量达6.89 g/L（图6D）。
【数据】DPZ26+glyA过表达：5.48 g/L；DPZ27（CRISPRi-folD）：5.21 g/L；DPZ28（CRISPRi-metF）：6.15 g/L，5,10-CH₂-THF水平较DPZ26提高约2.3倍；DPZ28/P1（+酵母SHMT）：6.52 g/L；DPZ28/P2（+拟南芥模块）：6.89 g/L
3.6 协同动态调控在维持细胞生长的同时增强D-PA生产
静态代谢工程往往在目标产物合成与细胞生长之间存在权衡。为平衡二者关系，本研究采用动态调控策略，对TCA循环关键基因（aceE、gltA）和D-PA降解途径关键基因（coaA）进行协同调控（图7A）。
利用CRISPRi系统，构建了受生长阶段调控的动态抑制模块。在菌株DPZ28/P2中，分别引入靶向aceE和gltA的CRISPRi模块，构建菌株DPZ28/P3（动态抑制aceE）和DPZ28/P4（动态抑制gltA）。摇瓶发酵生长曲线显示，DPZ28/P4在发酵前24 h生长正常，24 h后生长趋于平缓（图7B）。D-PA产量方面，DPZ28/P3产量为7.23 g/L，DPZ28/P4产量为7.56 g/L（图7C），分别较对照菌株DPZ28/P2（6.89 g/L）提高4.9%和9.7%。动态抑制gltA的效果优于静态抑制——静态抑制gltA的菌株虽然D-PA产量可达7.12 g/L，但生物量显著降低（OD600较对照下降28.6%），而动态抑制菌株DPZ28/P4的生物量仅下降9.3%。
在此基础上，对D-PA降解途径中的coaA基因（编码泛酸激酶）实施动态抑制。在菌株DPZ28/P4中引入靶向coaA的动态CRISPRi模块，构建菌株DPZ28/P5。该菌株的D-PA产量进一步提升至8.12 g/L，同时生物量维持在较高水平（OD600为对照的89.7%）（图7C）。最终，将动态调控系统与前述所有代谢工程策略整合，构建最终菌株DPZ28/P31。摇瓶发酵中，DPZ28/P31的D-PA产量达9.35 g/L，较未动态调控菌株提高显著。
【数据】DPZ28/P3（动态aceE抑制）：7.23 g/L；DPZ28/P4（动态gltA抑制）：7.56 g/L（较对照+9.7%），生物量仅下降9.3%（静态抑制下降28.6%）；DPZ28/P5（+动态coaA抑制）：8.12 g/L，OD600为对照的89.7%；DPZ28/P31：9.35 g/L
3.7 5 L生物反应器中D-PA的补料分批生产
为评估最终工程菌株的工业化潜力，在5 L生物反应器中采用两种补料策略进行补料分批发酵。
第一种策略为基于DO反馈的间歇补料。在此过程中，残留葡萄糖在整个发酵过程中维持在接近零的水平，总葡萄糖消耗量约为600 g（图8A）。
发酵192 h后，菌株DPZ28/P31实现D-PA产量86.2 g/L，得率0.41 g/g葡萄糖，生产强度0.45 g/L/h。第二种策略为基于DO反馈的连续补料，残留葡萄糖峰值约为5 g/L（图8B）。在此策略下，发酵168 h后D-PA产量达98.6 g/L，得率0.44 g/g葡萄糖，生产强度0.59 g/L/h。连续补料策略的D-PA产量较间歇补料提高14.4%，生产强度提高31.1%。最终菌株在两种策略下均未观察到明显的乙酸积累（残留乙酸浓度始终低于0.5 g/L），表明工程菌株的碳代谢已高度优化。
【数据】间歇补料：总葡萄糖消耗约600 g，发酵192 h，D-PA 86.2 g/L，得率0.41 g/g葡萄糖，生产强度0.45 g/L/h；连续补料：残留葡萄糖峰值约5 g/L，发酵168 h，D-PA 98.6 g/L，得率0.44 g/g葡萄糖，生产强度0.59 g/L/h；乙酸始终低于0.5 g/L
讨论与解读
本研究通过系统性代谢工程策略，在大肠杆菌中实现了D-泛酸的高效生产。核心策略包括：消除竞争性副产物途径以增强丙酮酸供应、优化葡萄糖和β-丙氨酸的转运系统、强化NADPH和ATP辅因子再生、通过RBS工程精细调控异源酶表达、引入异源5,10-CH₂-THF合成模块以增强一碳供体供给，以及采用动态调控平衡细胞生长与产物合成。最终菌株DPZ28/P31在5 L生物反应器中实现98.6 g/L的D-PA产量和0.44 g/g葡萄糖的得率。
值得注意的是，本研究发现了一些反直觉现象：删除pta-ackA虽减少了乙酸积累却因ATP不足而降低产量；完全阻断PP途径（删zwf）引起氧化还原失衡；过度解除中心代谢调控（三重敲除fbp/ppsA/cra）反而损害菌株性能。这些结果凸显了代谢网络的复杂性和全局调控的重要性。动态调控策略的成功应用——在维持细胞生长的同时增强产物合成——为解决代谢工程中常见的生长-生产权衡提供了可行方案。
【编译者解读】该研究展示了合成生物学中"系统化改造"的典型范式——从碳代谢重塑到辅因子工程再到动态调控，层层递进、逻辑严密。98.6 g/L的产量在维生素类产品的微生物合成中处于领先水平，具有明确的工业转化前景。值得关注的是，研究团队将异源一碳代谢模块整合至大肠杆菌的策略，为依赖一碳供体的其他产物的生物合成提供了可借鉴的思路。不过，发酵周期长达168小时，工业化生产中需评估时间成本与产率的经济平衡。
参考来源
Zhao K. Heterologous integration-assisted metabolic engineering in Escherichia coli for elevated D-pantothenic acid production. Metabolic Engineering, 2025. DOI: 10.1016/j.ymben.2025.08.003
DOI: 10.1016/j.ymben.2025.08.003