来源：Dynamic coenzyme regulation drives high-efficiency D-tagatose biosynthesis in engineered Escherichia coli（Food Bioscience）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
D-塔格糖是一种具有明确健康功效的功能性稀有糖，在食品与医药领域应用前景广阔。本研究在E. coli BL21(DE3)中构建了由木糖还原酶（XR）和半乳糖醇-2-脱氢酶（GDH）介导的氧化还原驱动型生物合成途径，并通过双辅酶调控策略实现NADPH与NAD⁺的协同供给和动态平衡。最终在40 g/L D-半乳糖底物条件下，D-塔格糖产量达34.92 g/L，时空产率0.55 g/(L·h)，为目前文献报道的氧化还原型D-塔格糖合成体系最高值。
研究背景
过量摄入传统糖类与肥胖、糖尿病及心血管疾病等代谢紊乱密切相关。稀有糖因其独特的代谢特性和生理功能成为理想替代品。D-塔格糖被普遍认为是安全的，甜度为蔗糖的90%，热量仅为蔗糖的三分之一，人体吸收率仅20%，被视为下一代低热量甜味剂。传统D-塔格糖合成路线以D-半乳糖或乳糖为原料，但热力学平衡限制导致反应效率低下。氧化还原驱动型生物合成可克服这一限制，但反应效率仍是关键瓶颈。本研究通过辅酶工程调控NADPH与NAD⁺的平衡，系统优化了D-塔格糖的生物合成效率。
研究方法
2.1 菌株与试剂
本研究所用质粒和菌株均列于表1。E. coli DH5α作为基因克隆宿主，E. coli BL21(DE3)作为D-塔格糖生物合成的工程生产宿主。酵母提取物、蛋白胨、NaCl、琼脂粉、琼脂糖、异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）、D-半乳糖、D-葡萄糖、果糖、半乳糖醇、D-塔格糖标准品、抗生素、无缝克隆试剂盒、KH₂PO₄、K₂HPO₄·3H₂O、胰蛋白胨、烟酸和PBS缓冲液均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。辅酶Ⅰ NAD(H)含量检测试剂盒（50T/48S）、辅酶Ⅱ NADP(H)含量检测试剂盒（50T/48S）和Tris-HCl缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司。PrimeSTAR® Max DNA聚合酶和限制性内切酶购自TaKaRa（北京）。2 × Rapid Taq Master Mix（用于PCR）及DNA提取/纯化试剂盒购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
【数据】试剂来源：生工生物、索莱宝、TaKaRa、诺唯赞；检测试剂盒规格：50T/48S
2.2 质粒构建
编码Rlgdh（来源于Rhizobium leguminosarum，TBX90163.1）、Afgdh（来源于Agrobacterium fabrum，WP_010972809.1）、Pdgdh突变体（来源于Paracoccus denitrificans，WP_011751060）和SgXR（D-木糖还原酶，来源于Spathaspora gorwiae，KU668556.1）的基因均经过密码子优化，以增强在E. coli BL21(DE3)中的表达。用于质粒构建的所有引物列于表2。
构建质粒pRSFDuet-1-AfGDH-SgXR时，将SgXR基因片段插入pRSFDuet-1-AfGDH的Bgl II和Kpn I限制性酶切位点。对于质粒pCDFDuet-1-mdh、pCDFDuet-1-maeB和pACYCDuet-1-pntAB，分别从E. coli BL21(DE3)基因组中扩增mdh、maeB和pntAB基因，然后插入pCDFDuet-1和pACYCDuet-1的BamH I和Hind III限制性酶切位点。构建pCDFDuet-1-maeB-mdh时，将mdh基因片段进一步插入pCDFDuet-1-maeB的Bgl II和Kpn I限制性酶切位点。构建质粒pCDFDuet-1-pncB-nadE时，从E. coli BL21基因组中扩增nadE和pncB基因，将pncB基因片段插入pCDFDuet-1的BamH I和Hind III限制性位点，将nadE基因片段插入同一载体的Bgl II和Kpn I限制性位点。本研究所用质粒携带不同的复制子和选择标记，使其能够在大肠杆菌中稳定共存。
【数据】限制性内切酶：Bgl II、Kpn I、BamH I、Hind III；基因来源：E. coli BL21(DE3)基因组
2.3 菌株培养与反应条件
#### 2.3.1 工程菌株的活化与培养条件
摇瓶培养和平板筛选使用LB培养基，而本研究构建的工程菌株BL_XG_PN和BL_XG_3_PN的摇瓶培养专门使用TB培养基。BL_XG_PN通过将质粒pCDFDuet-1-pncB-nadE转化入起始菌株BL_XG构建而成。BL_XG_3_PN以BL_XG为起始菌株，依次转化质粒pACYCDuet-1-pntAB和质粒pCDFDuet-1-pncB-nadE构建。冻存菌株在37°C、200 rpm条件下过夜培养进行预培养。需要时，向培养体系中加入相应抗生素至终浓度50 μg/mL。
【数据】预培养温度：37°C；转速：200 rpm；抗生素浓度：50 μg/mL
#### 2.3.2 全细胞催化生产D-塔格糖的反应条件
对于全细胞D-塔格糖生产，将工程菌株的种子培养物接种到含50 mL LB培养基的摇瓶中。对于含单一质粒的菌株，加入相应抗生素至终浓度100 mg/L；对于含多个不同质粒的菌株，分别加入各自相应的抗生素，每种终浓度均为100 mg/L。随后在37°C振荡培养至OD₆₀₀达到0.6-0.8。达到该密度后，加入IPTG作为诱导剂至终浓度0.1 mmol/L，并在16°C下继续培养24 h。工程菌株的生物量通过在上述条件下总共培养28 h进行测定，期间间隔取样测量OD₆₀₀。
诱导后，将工程细胞重悬于PBS中，离心弃上清。随后将0.6 g湿细胞转移至含10 mL反应混合物的100 mL摇瓶中，用透气封口膜密封。反应混合物由50 mM Tris-HCl、半乳糖、葡萄糖或果糖（浓度与半乳糖相同）以及烟酸组成，使用前配制至所需浓度。初始pH用NaOH调至8.0。根据反应需要每8 h监测一次pH。若pH偏离8.0，添加固体NaOH维持pH为8.0。反应在35°C、200 rpm水浴摇床中进行。
【数据】培养基体积：50 mL；抗生素终浓度：100 mg/L；诱导OD₆₀₀：0.6-0.8；IPTG浓度：0.1 mmol/L；诱导温度：16°C；诱导时间：24h；总培养时间：28h；湿细胞量：0.6 g；反应体系：10 mL；Tris-HCl浓度：50 mM；初始pH：8.0；pH监测间隔：8h；反应温度：35°C；转速：200 rpm
#### 2.3.3 GDH全细胞催化活性筛选
GDH筛选在LB培养基中于35°C进行摇瓶发酵。通过催化5 g/L半乳糖醇在24 h内转化为D-塔格糖来评估半乳糖醇的全细胞催化活性。
【数据】半乳糖醇浓度：5 g/L；转化时间：24h；温度：35°C
2.4 分析方法
反应混合物中的半乳糖、半乳糖醇和D-塔格糖通过配备示差折光检测器的HPLC系统（型号G1362A，安捷伦科技，美国）在80°C下进行分析。色谱分离使用Xtimate Sugar-Ca色谱柱（7.8 × 300 mm），超纯水作为流动相，流速0.6 mL/min，进样量20 μL。
NADP(H)和NAD(H)的浓度分别按照制造商提供的方案进行测定。简要步骤如下：约0.1 g样品与0.5 mL相应提取液混合，超声处理1 min（200 W，超声2 s/间隔1 s），沸水浴加热5 min，然后冰浴快速冷却。离心（10,000×g，10 min，4°C）后，取200 μL上清液与等体积相应提取液混合中和，在相同条件下再次离心，所得上清液置于冰上保存。随后按照试剂盒说明书依次加入试剂和样品；在570 nm处测定吸光度（保持在0.1-1之间以确保准确性），并使用提供的公式计算浓度。
全细胞催化活性定义为每单位质量干细胞每分钟生成的D-塔格糖量（1 μmol）。检测到的最高生物催化活性定义为100%相对酶活性。干细胞重（DCW，g/L）使用公式计算：0.4442 × OD₆₀₀ - 0.021（Song et al., 2015）。
【数据】HPLC柱温：80°C；流速：0.6 mL/min；进样量：20 μL；超声功率：200W；离心条件：10,000×g、10min、4°C；检测波长：570nm；DCW公式：0.4442 × OD₆₀₀ - 0.021
2.5 统计分析
实验数据的统计分析使用Origin 2024软件进行。所有数据以平均值±标准差（SD）表示，统计学显著性通过软件内置的配对比较图插件评估。使用Tukey检验进行均值比较，显著性差异标准设为P ≤ 0.05、P ≤ 0.01和P ≤ 0.001。
【数据】统计分析软件：Origin 2024；显著性标准：P ≤ 0.05，P ≤ 0.01，P ≤ 0.001
研究结果
3.1 大肠杆菌中D-塔格糖生物合成途径的构建
#### 3.1.1 途径设计与关键酶筛选
氧化还原驱动途径已成为稀有糖合成的一般路线，为传统异构化方法提供了灵活高效的替代方案。筛选和比较评估具有良好催化特性的GDH变体对于提高D-塔格糖生物合成效率至关重要。基于文献报道的酶学特性，本研究选取了三种具有代表性的半乳糖醇脱氢酶进行研究。
PdGDH是来源于Paracoccus denitrificans的D36A/I37R双突变体，经理性设计成为NADP⁺依赖性酶。该突变体对底物半乳糖醇具有高亲和力，适合构建自维持的辅酶循环系统（Ma et al., 2024）。AfGDH来源于Agrobacterium fabrum C58，已被鉴定为参与半乳糖醇分解代谢途径的关键酶，具有极强的底物特异性（Wichelecki et al., 2015）。RlGDH来源于Rhizobium leguminosarum，先前研究已确认其在氧化还原介导的生物转化系统中具有优异的催化活性（J.-J. Liu et al., 2019）。
比较分析显示，AfGDH表现出最高的催化效率。其比活力为0.502 ± 0.001 U/g，约为PdGDH（0.211 ± 0.01 U/g）的3倍，为RlGDH（0.167 ± 0.04 U/g）的2.4倍。因此，选择AfGDH因其高催化性能，并与XR（来源于Spathaspora gorwiae）在E. coli BL21(DE3)中共表达，构建重组菌株BL_XG。该菌株实现了将D-半乳糖转化为D-塔格糖的生物转化途径（图1）。
【数据】AfGDH比活力：0.502 ± 0.001 U/g；PdGDH比活力：0.211 ± 0.01 U/g；RlGDH比活力：0.167 ± 0.04 U/g；AfGDH为PdGDH的3倍、RlGDH的2.4倍
#### 3.1.2 外源碳源对辅酶平衡和途径效率的调控
氧化还原辅酶NAD(H)和NADP(H)是细胞代谢中的关键电子载体。它们的平衡循环对于维持酶催化活性和目标产物产量至关重要（J. Liu et al., 2018）。本研究中由SgXR和AfGDH组成的D-塔格糖生产途径正是由这些氧化还原辅酶驱动的。先前研究表明，通过外源碳源补充调节辅因子稳态可以提高反应效率（Yu et al., 2020）。基于此，我们假设通过外源碳源补充调节NAD(H)/NADP(H)的平衡可以提高D-塔格糖生物合成途径的效率。
实验结果显示了补充碳源组与未补充组之间产物积累的显著差异。添加葡萄糖使BL_XG菌株的D-塔格糖产量达到15.49 g/L，比未补充组的4.83 g/L提高了3.2倍。半乳糖醇产量增加到7.25 g/L，与未补充组的0.26 g/L相比增加了27.9倍。这些结果是在40 g/L D-半乳糖作为底物、反应时间48 h的条件下获得的（图2a）。
这种生物转化效率的提升是因为E. coli BL21(DE3)天然缺乏GalK（半乳糖激酶）和TagK（塔格糖激酶），这两种酶是半乳糖/塔格糖分解代谢所必需的，导致半乳糖不能作为碳源被利用（W. Liu et al., 2023）。因此，在没有额外碳源的情况下，有限的代谢活性限制了辅酶再生和生物转化效率。相比之下，葡萄糖激活了中心代谢途径。其代谢过程中产生的ATP和还原当量驱动辅酶循环（Park et al., 2019），这对于维持SgXR和AfGDH的催化活性至关重要。
【数据】D-塔格糖产量（加葡萄糖）：15.49 g/L；D-塔格糖产量（未加碳源）：4.83 g/L；提升倍数：3.2倍；半乳糖醇产量（加葡萄糖）：7.25 g/L；半乳糖醇产量（未加碳源）：0.26 g/L；增加倍数：27.9倍；底物浓度：40 g/L D-半乳糖；反应时间：48h
#### 3.1.3 辅酶代谢谱分析
为进一步研究BL_XG菌株的辅酶代谢特征，我们在两种条件下分析了D-塔格糖产量和辅酶水平：一种补充碳源，一种不补充。两组细胞内辅酶原始浓度如图2b所示，计算得到的比值如图S1所示以便直接比较。
结果显示，实验组的NAD⁺/NADH比值（3.80）显著高于对照组（0.67）。这一差异源于不同碳源供应引起的细胞内代谢通量和电子传递链（ETC）运行效率的变化。在实验组中，充足的葡萄糖通过糖酵解和三羧酸（TCA）循环转化为大量NADH。在有氧条件下，ETC有效氧化NADH并再生NAD⁺（Cai et al., 2023; Xie et al., 2020），从而维持相对较高的NAD⁺/NADH比值。相比之下，对照组由于缺乏外源碳源，细胞内碳代谢通量较低。ATP供应不足进一步抑制了NAD⁺的合成（Xiao et al., 2018），最终导致NAD⁺/NADH比值相对较低。
NADP⁺/NADPH比值与NAD⁺/NADH比值相反。对照组显示出显著高于实验组的NADP⁺/NADPH比值（3.42 vs 0.38）。这一差异归因于葡萄糖对磷酸戊糖途径（PPP）的调节。在实验组中，葡萄糖添加激活了PPP。PPP是微生物细胞中NADPH的主要来源（Stincone et al., 2014）。PPP通量的增加产生了大量NADPH，导致实验组的NADP⁺/NADPH比值较低。相比之下，对照组缺乏葡萄糖，PPP未被激活，NADPH再生受限，导致NADP⁺积累，因此对照组表现出较高的NADP⁺/NADPH比值。这种辅酶的动态平衡证实了D-葡萄糖驱动辅酶循环，更重要的是为D-塔格糖合成提供了有利基础。
【数据】实验组NAD⁺/NADH比值：3.80；对照组NAD⁺/NADH比值：0.67；对照组NADP⁺/NADPH比值：3.42；实验组NADP⁺/NADPH比值：0.38
#### 3.1.4 反应条件优化
鉴于碳源类型显著调节辅酶平衡和D-塔格糖合成，我们进一步优化了全细胞催化条件。使用D-果糖替代D-葡萄糖作为碳源，D-塔格糖产量提高了1.68倍（图S2）。我们先前已确认葡萄糖和果糖作为底物时均不能转化为D-塔格糖（图S3）。两种糖均被代谢消耗，因此在辅酶再生过程中可能发挥类似作用。观察到的D-塔格糖产量差异可能源于它们各自代谢途径对合成过程的不同调节作用。
具体而言，D-葡萄糖通过其磷酸转移酶系统（PTS）触发强烈的碳分解代谢物阻遏（CCR），抑制异源酶的活性（Balderas-Hernandez et al., 2020）。相比之下，D-果糖通过其PTS依赖途径诱导较弱的CCR（Fox & Prather, 2020; Zheng et al., 2024），有助于维持大肠杆菌中D-半乳糖转化途径的代谢活性。由于这些差异，果糖可以在提供辅酶再生的同时，为异源途径创造更有利的代谢环境。
此外，将反应pH稳定控制在8.0使产量提高了1.65倍。这种调控中和了反应过程中产生的酸性代谢物，防止SgXR和AfGDH因pH快速下降而失活，同时维持高效转化（图S4）。所有后续实验均在这些优化条件下进行，具体为使用果糖作为碳源并维持pH 8.0。
【数据】果糖替代葡萄糖产量提升：1.68倍；pH 8.0控制产量提升：1.65倍
3.2 辅酶再生对D-塔格糖生物合成的影响
在确认碳源调节辅酶平衡的基础上，我们进一步探究了辅酶再生对D-塔格糖生物合成的影响（图3）。通过共表达mdh（苹果酸脱氢酶）和maeB（苹果酸酶），构建了NAD⁺和NADPH再生循环。结果显示，辅酶再生策略显著影响了D-塔格糖的合成效率。
【数据】原文未详述具体数值
3.3 靶向调控NAD⁺生物合成对D-塔格糖合成的影响
通过烟酸补充和Preiss-Handler途径强化，我们靶向调控了NAD⁺的生物合成。图4展示了NAD⁺水平调控对D-塔格糖合成的影响。通过增强NAD⁺合成途径，D-塔格糖产量得到进一步提升。
【数据】原文未详述具体数值
3.4 烟酸浓度优化下的D-塔格糖生产能力评估
在优化的烟酸浓度条件下，对菌株BL_XG_3_PN的D-塔格糖生产能力进行了系统评估。图5展示了烟酸作为关键发酵参数的优化结果，以及全细胞催化过程中D-半乳糖消耗、D-塔格糖生产和半乳糖醇积累的时间进程。
【数据】原文未详述具体数值
讨论与解读
本研究通过构建和优化E. coli BL21(DE3)中的氧化还原途径，开发了一种高效的D-塔格糖生产细胞工厂。通过引入双辅酶调控策略，实现了大肠杆菌细胞中NADPH和NAD⁺的协同供给与动态平衡，显著提升了SgXR和AfGDH的催化性能。在40 g/L D-半乳糖作为底物的全细胞催化反应中，D-塔格糖产量达到34.92 g/L，产率0.87 g/g D-半乳糖，时空产率0.55 g/(L·h)。该研究实现了现有文献报道的氧化还原型D-塔格糖合成体系中最高时空产率。这项工作确立了辅酶平衡在氧化还原途径中的关键调控作用，为高效稀有糖生物合成提供了创新策略。未来仍需进一步缩小实验室催化与工业化应用之间的差距。
编译者解读：该研究的核心价值在于将辅酶工程从"单一辅酶补充"升级为"NADPH-NAD⁺双辅酶动态平衡"的系统策略，这种全局调控思维对依赖氧化还原辅酶的多种生物转化具有普适借鉴意义。值得注意的是，研究通过外源碳源筛选（果糖优于葡萄糖）巧妙规避了CCR对异源酶的抑制，这一细节对工业放大极具参考价值。然而，34.92 g/L的产量虽创下该类体系纪录，但底物浓度高达40 g/L，转化率仍有提升空间。后续若能将辅酶调控策略与底物谱拓展、连续流反应器结合，有望进一步推动D-塔格糖的工业化进程。
参考来源
Li, Y. (2026). Dynamic coenzyme regulation drives high-efficiency D-tagatose biosynthesis in engineered Escherichia coli. Food Bioscience, 108424. DOI: 10.1016/j.fbio.2026.108424
DOI: 10.1016/j.fbio.2026.108424