来源：Systematic metabolic engineering of Escherichia coli for high-level production of trans-4-hydroxy-L-proline（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
反式-4-羟基-L-脯氨酸（T-4-Hyp）是胶原蛋白的关键结构单元，在医药、食品和化妆品行业具有广阔应用前景。本研究通过前体供给强化、碳流重定向和动态调控三大策略，系统改造大肠杆菌W3110，最终获得菌株QF-27，在5-L生物反应器中实现105.72 g/L的T-4-Hyp产量，碳得率0.364 g/g葡萄糖，为迄今报道的最高水平。研究还首次通过改造中心碳代谢来提升T-4-Hyp合成效率，为其他α-酮戊二酸依赖型高值氨基酸衍生物的微生物合成提供了可移植策略。
研究背景
T-4-Hyp是L-脯氨酸最重要的天然衍生物之一，广泛存在于动物胶原蛋白中，是维持胶原三螺旋结构稳定性的关键结构单元，在结缔组织、皮肤和软骨的力学完整性中发挥核心作用。该化合物还具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤和组织修复等多种生物活性。然而，传统蛋白水解法效率低且污染严重，化学合成法虽然转化率较高，但流程复杂、纯化成本高且使用有毒试剂，均无法满足绿色、经济、可持续的工业化要求。合成生物学和代谢工程的发展使微生物发酵成为T-4-Hyp生产的主流方向。当前微生物法生产T-4-Hyp的关键瓶颈在于前体L-脯氨酸供给不足，以及细胞生长与产物合成之间的失衡。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究所用菌株列于表2和补充表S1。大肠杆菌JM109用作克隆宿主，大肠杆菌W3110用于T-4-Hyp生物合成。大肠杆菌菌株常规在LB培养基中于37°C培养。为维持质粒稳定性和筛选阳性克隆，根据实验设计需要向培养基中添加氨苄青霉素（100 mg/L）。
【数据】菌株：E. coli JM109（克隆宿主）、E. coli W3110（合成宿主）；培养基：LB；温度：37°C；抗生素：氨苄青霉素 100 mg/L
2.2 重组质粒的构建
本研究所用质粒详细信息见表2和补充表S1，特异性引物序列列于补充表S2。所有引物由Genewiz生物技术有限公司（中国苏州）合成。重组质粒的构建按照Wang等人（2025）描述的方法进行。
【数据】引物合成：Genewiz Biotech Co., Ltd.；方法参照：Wang et al., 2025
2.3 重组菌株的构建
采用基于pCas/pTargetF双质粒系统的CRISPR-Cas9基因组编辑系统，对T-4-Hyp生物合成途径中的关键基因进行敲除和过表达。pCas和pTargetF质粒的详细信息及菌株构建所用引物分别见补充表S1和S2。重组菌株的构建按照Wang等人（2025）描述的方法进行。
【数据】编辑系统：CRISPR-Cas9（pCas/pTargetF双质粒系统）；方法参照：Wang et al., 2025
2.4 摇瓶发酵
从固体LB平板挑取单菌落，接种于10 mL液体LB培养基中，在37°C、100 rpm往复摇床上培养10–12 h制备一级种子液。随后，将0.2 mL一级种子液转接至30 mL二级种子培养基中，该培养基含5 g/L酵母提取物、10 g/L胰蛋白胨、10 g/L NaCl、2 g/L KH₂PO₄、1 g/L葡萄糖，pH 7.0。在33°C、100 rpm条件下培养9 h后，将3.6 mL二级种子液接种至30 mL发酵培养基中。发酵培养基组成如下：40 g/L葡萄糖、6 g/L酵母提取物、5 g/L KH₂PO₄、2 g/L柠檬酸、1.5 g/L MgSO₄、1.5 g/L (NH₄)₂SO₄、0.52 g/L葡萄糖酸亚铁二水合物、9 mg/L MnSO₄、12.8 mg/L ZnSO₄、9.8 mg/L Co(NO₃)₂、1.2 mg/L CuSO₄、0.3 mg/L维生素混合物（B1、B3、B5、B12）以及2 g/L维生素C。发酵在36°C、100 rpm往复摇床上进行36 h。整个发酵过程中，以酚红作为pH指示剂，通过流加氢氧化铵将pH维持在约7.0。
【数据】一级种子：10 mL LB，37°C，100 rpm，10–12 h；二级种子：30 mL，33°C，100 rpm，9 h；接种量：3.6 mL/30 mL；发酵培养基：40 g/L葡萄糖、6 g/L酵母提取物、5 g/L KH₂PO₄、2 g/L柠檬酸、1.5 g/L MgSO₄、1.5 g/L (NH₄)₂SO₄、0.52 g/L葡萄糖酸亚铁二水合物、9 mg/L MnSO₄、12.8 mg/L ZnSO₄、9.8 mg/L Co(NO₃)₂、1.2 mg/L CuSO₄、0.3 mg/L维生素混合物、2 g/L维生素C；发酵条件：36°C，100 rpm，36 h；pH：约7.0（氨氧化铵流加维持）
2.5 5-L生物反应器补料分批发酵
将菌株接种至含100 mL二级种子培养基的500 mL锥形瓶中，在33°C、100 rpm往复摇床上培养7–9 h获得种子液。随后将种子液转接至含2 L发酵培养基的5-L生物反应器中，培养基含10 g/L葡萄糖及其他与2.4节相同的组分。培养条件设置如下：温度36°C，溶解氧（DO）水平维持在30%–35%，通过自动流加NH₄·H₂O溶液将pH稳定在7.0。发酵进行至16 h时，以3.5 mg/(L·h)的速率流加葡萄糖酸亚铁二水合物溶液。初始10 g/L葡萄糖耗尽后（约7–8 h），根据测定的残余葡萄糖浓度，以每小时调整的速率流加650 g/L葡萄糖溶液，使葡萄糖浓度保持在0.2 g/L以下。
【数据】种子培养：100 mL/500 mL锥形瓶，33°C，100 rpm，7–9 h；反应器：5-L，装液量2 L；温度：36°C；DO：30%–35%；pH：7.0；葡萄糖酸亚铁流加速率：3.5 mg/(L·h)（16 h起）；补料葡萄糖浓度：650 g/L；残余葡萄糖控制：<0.2 g/L
2.6 实时荧光定量PCR
大肠杆菌菌株按2.4节所述摇瓶条件培养。在对数中期（8 h）和稳定期（20 h）通过离心（8000×g，5 min，4°C）收集细胞。总RNA提取和RT-qPCR按照Wang等人（2025）描述的方法进行。
【数据】取样时间点：8 h（对数中期）、20 h（稳定期）；离心：8000×g，5 min，4°C；方法参照：Wang et al., 2025
2.7 分析方法
使用紫外-可见分光光度计（SP-756P，上海）在600 nm处测定光密度（OD600）以衡量细胞密度。为建立光密度与生物量之间的关系，针对菌株QF-27建立了校准曲线。细胞干重（DCW）通过将5 mL发酵液经预称重的0.45 μm滤膜过滤，随后在80°C下干燥至恒重测定，得到换算系数为1 OD600 = 0.35 g DCW（补充图S1）。发酵液中葡萄糖浓度使用生物传感分析仪（SBA-40E，济南）测定。氨基酸衍生化与检测按照Li等人（2016）描述的方法进行。有机酸按照Zhang等人（2025）描述的方法检测。T-4-Hyp比生成速率（q_p，g/g DCW/h）按以下公式计算：
q_p = ΔC_Hyp / (Δt · X_avg)
其中ΔC_Hyp为时间间隔Δt（h）内T-4-Hyp浓度的增加量（g/L），X_avg为该时间间隔内的平均生物量浓度（g DCW）。
【数据】OD600测定：SP-756P分光光度计；换算系数：1 OD600 = 0.35 g DCW；葡萄糖测定：SBA-40E生物传感分析仪；方法参照：Li et al., 2016；Zhang et al., 2025
2.8 统计分析
所有实验至少进行三次独立生物学重复。数据以平均值±标准差（SD）表示。采用单因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey事后检验进行多重比较，确定统计学显著性。P值<0.05被认为具有统计学显著性。所有统计分析使用GraphPad Prism 9.0（GraphPad Software，San Diego，CA，USA）完成。
【数据】生物学重复：≥3次；统计方法：单因素ANOVA + Tukey事后检验；显著性阈值：P < 0.05；软件：GraphPad Prism 9.0
研究结果
3.1 重构L-脯氨酸生物合成途径以促进L-脯氨酸生产
L-Pro是T-4-Hyp生物合成的关键前体，但大肠杆菌中L-Pro供给不足往往限制其生产性能。因此，提高胞内L-Pro积累是提升T-4-Hyp生物合成效率的重要途径。如图2a所示，大肠杆菌中L-Pro的生物合成起始于L-谷氨酸，依次由γ-谷氨酰激酶（ProB）、谷氨酸-γ-半醛脱氢酶（ProA）和吡咯啉-5-羧酸还原酶（ProC）催化。其中ProB是限速酶，且受L-Pro的反馈抑制。此前研究已报道了多种可缓解L-Pro终产物抑制的反馈抗性ProB变体，包括ProB74（即ProB^D107N）、ProB^E143A和ProB^I69E。
为筛选最优的反馈抗性ProB，将三种变体ProB^D107N、ProB^E143A和ProB^I69E分别在大肠杆菌W3110 ΔlacI（命名为菌株QF）基因组的yjiV位点过表达，获得菌株QF-2至QF-4（图2b）。作为对照，同时将大肠杆菌野生型ProB编码基因整合至W3110 ΔlacI基因组中，获得菌株QF-1。三种变体中，ProB^I69E在L-Pro生产中表现最佳（图2c）。相应菌株QF-4的L-脯氨酸产量为5.78 ± 0.27 g/L，较对照菌株QF-1（1.97 ± 0.21 g/L）提高约2.9倍。统计分析表明，菌株QF-4（过表达proB^I69E）的L-Pro产量显著高于菌株QF-3（过表达proB^E143A）（P < 0.05），而QF-4与QF-2（过表达proB^D107N）之间以及QF-2与QF-3之间均未检测到显著差异（图2c）。这证实反馈抗性ProB^I69E能有效缓解L-Pro的反馈抑制，与此前研究结果一致。
为进一步增强L-Pro生物合成途径的碳通量，在菌株QF-4的基础上优化了proB^I69E（编码ProB^I69E）的拷贝数，所得菌株分别命名为大肠杆菌QF-5（两个拷贝）和QF-6（三个拷贝）（图2b）。菌株QF-5和QF-6分别产生9.35 ± 0.50 g/L和9.17 ± 0.19 g/L的L-Pro（图2c），较菌株QF-4分别提高61.8%和58.7%。结果表明菌株QF-5在所测菌株中获得最高L-Pro产量，而进一步增加proB^I69E拷贝数未带来统计学显著的产量提升。
L-Pro生物合成途径中的其他酶也通过将编码基因导入菌株QF-5基因组实现过表达。首先将proA基因（编码ProA）整合至菌株QF-5的yghX位点，获得菌株QF-7（图2d）。如图2d所示，菌株QF-7的L-Pro产量达到11.56 ± 0.38 g/L。为考察增加proB^I69E拷贝数是否能增强proA的协同效应，构建了菌株QF-6A（三个拷贝）。如补充图S2所示，QF-6A的L-Pro产量（11.29 ± 0.53 g/L）与QF-7相比无显著差异，说明增加proB^I69E拷贝数不能进一步增强proA的协同效应。随后将proC基因（编码ProC）整合至菌株QF-7的gapC位点，获得菌株QF-8。菌株QF-8的L-Pro产量为12.87 ± 0.35 g/L，较菌株QF-5提高37.7%（图2d）。综上，在菌株QF-5中进一步疏通L-Pro生物合成途径显著提升了L-Pro产量（图2d）。
大肠杆菌中同时存在L-Pro生物合成和分解代谢途径（图2a）。多项研究表明，大肠杆菌中的脯氨酸脱氢酶（PutA）可将L-Pro降解为L-谷氨酸。为避免L-Pro向L-谷氨酸的转化并增加T-4-Hyp生物合成的L-Pro供给，在菌株QF-8中敲除了putA基因（编码PutA），获得菌株QF-9（图2d）。如图2d所示，菌株QF-9的L-Pro产量达到15.75 ± 0.56 g/L，较菌株QF-8提高22.4%（图2d）。这一结果与此前报道一致，即敲除putA阻断了L-Pro的降解并促进其积累。总体而言，这些结果表明通过过表达关键酶基因和破坏L-Pro降解途径可以实现高效的L-Pro积累。产L-Pro菌株QF-9随后被用作下一步T-4-Hyp生物合成的底盘细胞。
【数据】菌株QF-4 L-Pro产量：5.78 ± 0.27 g/L；对照QF-1：1.97 ± 0.21 g/L（提高约2.9倍）；QF-5：9.35 ± 0.50 g/L（较QF-4提高61.8%）；QF-6：9.17 ± 0.19 g/L（较QF-4提高58.7%）；QF-7：11.56 ± 0.38 g/L；QF-8：12.87 ± 0.35 g/L（较QF-5提高37.7%）；QF-9：15.75 ± 0.56 g/L（较QF-8提高22.4%）；统计：QF-4 vs QF-3 P < 0.05
3.2 优化脯氨酸-4-羟化酶表达水平以实现大肠杆菌中T-4-Hyp的生物合成
脯氨酸-4-羟化酶（P4H）是催化L-Pro转化为T-4-Hyp的关键酶。由于大肠杆菌缺乏具有足够活性的内源P4H来高效生产T-4-Hyp，需要异源引入P4H以在大肠杆菌中建立T-4-Hyp生物合成途径。近年来，已从多种微生物中鉴定出P4H。其中，来源于Dactylosporangium sp. RH1的P4H（DaP4H）因其高催化活性而被广泛用于T-4-Hyp的微生物生产。
本研究根据大肠杆菌密码子偏好性对编码DaP4H的基因进行了密码子优化，并将其插入表达质粒pTrc99a中。随后将重组质粒pTrc99a-DaP4H转化至产L-Pro菌株QF-9（图3a），所得菌株QF-10在4 h时经1 mmol/L异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后产生5.26 ± 0.32 g/L的T-4-Hyp（图3b）。值得注意的是，菌株QF-10积累了8.92 ± 0.46 g/L的L-Pro（图3c），表明L-Pro向T-4-Hyp的转化不完全。这可能归因于DaP4H活性不足或共底物α-KG供给不充分。此外，IPTG的使用增加了T-4-Hyp生产的总体成本。
作为转录调控的核心元件，启动子通过上调目标基因的转录为调节基因表达提供了直接而有效的策略。为优化DaP4H的表达水平并消除对IPTG的需求，将pTrc99a上原有的trc启动子替换为四个组成型启动子，即P_J23116、P_J23107、P_J23102和P_J23119。根据此前报道，这些启动子的转录强度按P_J23116 < P_J23107 < P_J23102 < P_J23119的顺序递增。随后将所得重组质粒分别导入产L-Pro菌株QF-9，获得菌株QF-11至QF-14（图3a）。如图3d所示，从菌株QF-11到QF-14，DaP4H编码基因的转录水平逐渐升高。SDS-PAGE分析证实菌株QF-14表现出更高的P4H蛋白水平，而菌株QF-11和QF-12水平较低，其中QF-11最低（补充图S3）。这些结果与T-4-Hyp产量趋势一致，产量随表达强度的增加而逐步提高（图3b）。在所测菌株中，菌株QF-14的T-4-Hyp产量最高（5.32 ± 0.26 g/L），其次为菌株QF-13（5.13 ± 0.21 g/L）和菌株QF-12（3.74 ± 0.34 g/L）。然而，未检测到统计学显著差异——原文此处截断。
【数据】QF-10 T-4-Hyp产量：5.26 ± 0.32 g/L（1 mmol/L IPTG，4 h诱导），残留L-Pro：8.92 ± 0.46 g/L；启动子强度顺序：P_J23116 < P_J23107 < P_J23102 < P_J23119；QF-14 T-4-Hyp产量：5.32 ± 0.26 g/L；QF-13：5.13 ± 0.21 g/L；QF-12：3.74 ± 0.34 g/L
3.3 α-KG供给的多模块协同优化以增强T-4-Hyp生物合成
（原文此节内容未在提供的节选中完整呈现，以下根据摘要和结论中的相关信息进行忠实编译——原文未提供的具体实验数据不进行推测性补充。）
为应对α-酮戊二酸（α-KG）供给不足的问题，研究采用了多模块协同策略，包括阻断副产物途径、增强α-KG通量以及解除全局转录抑制。该策略将T-4-Hyp产量提升至11.02 ± 0.27 g/L。此外，研究设计了一种结合P_rpsT启动子和DAS+4降解标签的动态开关，在稳定期抑制α-酮戊二酸脱氢酶复合物的表达并促进其降解，从而平衡细胞生长与T-4-Hyp生产。经此动态调控后，T-4-Hyp产量达到14.37 ± 0.46 g/L，残留L-Pro降至0.38 ± 0.17 g/L。
【数据】多模块协同策略后T-4-Hyp产量：11.02 ± 0.27 g/L；动态调控后T-4-Hyp产量：14.37 ± 0.46 g/L；残留L-Pro：0.38 ± 0.17 g/L
3.4 5-L生物反应器补料分批发酵
在补料分批发酵中，最终菌株QF-27在5-L生物反应器中产生105.72 ± 0.84 g/L的T-4-Hyp，生产强度为2.20 g/L/h，碳得率为0.364 g/g葡萄糖。据作者所知，这是目前微生物发酵生产T-4-Hyp的最佳性能报道，也是首项通过系统改造中心碳代谢来提升T-4-Hyp产量的研究。
【数据】T-4-Hyp产量：105.72 ± 0.84 g/L；生产强度：2.20 g/L/h；碳得率：0.364 g/g葡萄糖
讨论与解读
本研究通过前体供给增强、碳流重定向和动态调控三大策略，成功构建了高效生产T-4-Hyp的系统工程菌株大肠杆菌QF-27。该菌株在5-L生物反应器中产量达105.72 ± 0.84 g/L，碳得率0.364 g/g葡萄糖，为目前已知的最高水平，具备工业化应用潜力。值得注意的是，QF-27的碳得率约为理论最大值（0.607 g/g）的60%，仍有显著的优化空间。P4H催化L-Pro转化为T-4-Hyp时，α-KG作为共底物按等摩尔比（1:1）参与反应。谷氨酸脱氢酶（GdhA）催化α-KG与L-谷氨酸之间的可逆转化，该酶占据连接两种必需底物供给的关键代谢节点：α-KG是羟化反应的直接共底物，而L-谷氨酸是L-Pro合成的直接前体。
编译者解读： 该研究的核心亮点在于将动态调控策略引入T-4-Hyp生产——通过P_rpsT启动子与DAS+4降解标签的组合，在稳定期同时抑制α-KG脱氢酶复合物的表达并加速其降解，巧妙化解了细胞生长与产物合成之间的矛盾。这种"生长前期保生物量、生长后期保产量"的时序调控思路，对α-KG依赖型产品的微生物合成具有普适参考价值。从合成生物学应用角度看，0.364 g/g葡萄糖的碳得率虽已达报道最高水平，但距离理论值仍有40%的提升空间，未来可在α-KG再生循环、P4H酶活改造以及发酵工艺优化等方向继续突破。此外，该策略的模块化设计使其易于移植到其他高值氨基酸衍生物的生产体系中。
参考来源
Wang K. Systematic metabolic engineering of Escherichia coli for high-level production of trans-4-hydroxy-L-proline. Metabolic Engineering, 2026. DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102521
DOI: 10.1016/j.ymben.2026.102521