来源：Dynamically metabolic engineering overflow metabolism for efficient production of l-alanine in Escherichia coli（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
L-丙氨酸是应用广泛的手性氨基酸，其工业生产的核心矛盾在于菌体生长与产物合成之间的碳流竞争。本研究以大肠杆菌B0016-060BC为底盘，通过优化热诱导时机、构建无痕基因组编辑系统、引入丙酮酸感知的糖酵解动态调控装置、以及减弱TCA循环通量等一系列策略，最终获得产195.2 g/L L-丙氨酸、产率88.6 g/100 g葡萄糖的工程菌株B0016-090BC。研究系统展示了"动态调控溢流代谢"这一理念在氨基酸工业发酵中的实践价值。
研究背景
L-丙氨酸是最小的手性氨基酸，广泛应用于食品、医药和兽药行业，可用作低热量甜味剂及化妆品中的皮肤调理剂。近年来，L-丙氨酸作为新型绿色螯合剂甲基甘氨酸二乙酸（MGDA）的关键原料，需求量显著增长。此外，其在可生物降解聚合物制造中亦具潜力。
工业上L-丙氨酸主要通过微生物发酵生产，已有报道最高产量可达275 g/L（谷氨酸棒杆菌GLY3/pCRD914）和217.5 g/L（乳酸片球菌BD16）。然而，这些菌株依赖质粒可能导致生产不稳定，高浓度有机氮源或乙酸盐/柠檬酸盐等额外碳源的需求增加生产成本，较低的光学纯度也影响产品质量。
本研究在前期构建的热调控发酵菌株B0016-060BC基础上，针对溢流代谢造成的副产物积累问题，系统开展了代谢工程改造。
研究方法
2.1 菌株与质粒
相关大肠杆菌菌株和质粒见补充材料，用于修饰重组菌株和质粒的引物亦见补充材料。大肠杆菌B0016-060BC为前期构建并保存于实验室。菌株B0016-070BC、B0016-080BC和B0016-090BC为本研究构建。重组质粒pGEX-J23100-SdPdhR-J23101-F9-sgrT、pGEX-J23101-SdPdhR-J23101-F9-sgrT、pGEX-J23101-SdPdhR-J23100-F9-sgrT和pGEX-J23100-SdPdhR-J23100-F9-sgrT为前期构建。质粒pBR322和pRE112保存于实验室。
【数据】菌株：E. coli B0016-060BC（前期构建）、B0016-070BC/080BC/090BC（本研究构建）；质粒：pGEX系列重组质粒（前期构建）、pBR322、pRE112（实验室保存）
2.2 培养基
LB（溶菌肉汤）培养基用于种子培养，改良M9培养基用于L-丙氨酸摇瓶发酵。改良M9培养基每升含：6 g Na₂HPO₄、3 g KH₂PO₄、1 g NH₄Cl、0.5 g NaCl、13.2 g (NH₄)₂SO₄。每升终培养基中添加1 mL过滤除菌的1 M MgSO₄和1 mL过滤除菌的微量元素溶液，微量元素溶液每升含：10 g FeSO₄·7H₂O、3 g CuSO₄·5H₂O、0.5 g MnSO₄·4H₂O、5.25 g ZnSO₄·7H₂O、0.1 g (NH₄)Mo₇O₂₄、0.2 g Na₂B₄O₇·10H₂O、2 g CaCl₂。根据需要向培养基中添加四环素（15 μg/mL）和氨苄青霉素（100 μg/mL）。
【数据】改良M9培养基组分：Na₂HPO₄ 6 g/L、KH₂PO₄ 3 g/L、NH₄Cl 1 g/L、NaCl 0.5 g/L、(NH₄)₂SO₄ 13.2 g/L；MgSO₄ 1 mM；四环素 15 μg/mL；氨苄青霉素 100 μg/mL
2.3 基因组编辑
染色体基因编辑采用改良方法，结合噬菌体λ Red重组、四环素筛选和蔗糖-NiCl₂反筛选。所有菌株通过PCR和DNA测序确认。
删除eutD基因时，使用引物sacB-SF-eutd和tet-r-eutd从pST质粒PCR扩增eutD-tetA-sacB基因盒，通过pKD46质粒过表达的λ Red重组酶将其整合到大肠杆菌B0016-060BC菌株的eutD基因位点。四环素平板上长出的菌落用引物eutDyz-f和eutDyz-r进行PCR验证，获得菌株B0016-060BC-sacB-tetA。将含有eutD基因上游45 nt和下游45 nt序列的90 nt ssDNA-eutD片段整合到菌株B0016-060BC-sacB-tetA基因组中以回收筛选标记，所得菌株在含10%（wt/vol）蔗糖和3 mmol/L NiCl₂的LB平板上进行反筛选，并用eutDyz-f和eutDyz-r引物PCR验证，获得菌株B0016-070BC。
为将mgsA基因替换为糖酵解控制装置，分别以sd-f和tet-r为引物，从pGEX-J23100-SdPdhR-J23101-F9-sgrT、pGEX-J23101-SdPdhR-J23101-F9-sgrT、pGEX-J23101-SdPdhR-J23100-F9-sgrT和pGEX-J23100-SdPdhR-J23100-F9-sgrT质粒扩增DNA片段，整合到菌株B0016-070BC染色体中。使用ssDNA-MgsA切除tetA-sacB片段，获得菌株B0016-080BC。所得菌株用引物mgsA-yz-f和mgsA-yz-R验证。
为在lpdA基因末端融合DAS+4蛋白降解标签，使用引物PDH-ST-r和PDH-ST-F从pST质粒扩增DNA片段，插入菌株B0016-080BC染色体中。使用ssDNA-pdh删除tetA-sacB片段，获得菌株B0016-090BC。菌株用引物pdh-yz-f和pdh-yz-r确认。本研究所用引物见补充材料。
【数据】蔗糖浓度：10%（wt/vol）；NiCl₂浓度：3 mmol/L；ssDNA-eutD长度：90 nt（45 nt上游+45 nt下游）；λ Red重组：pKD46质粒介导
2.4 摇瓶实验
L-丙氨酸发酵摇瓶实验按前期报道方法略作修改进行。菌株先在LB平板上于28°C培养24 h。将菌落接种到50 mL LB液体培养基中，于28°C、200 rpm培养10 h。种子培养物以2%（vol/vol）接种量接种到含5 g/L葡萄糖的50 mL改良M9培养基中，置于250 mL摇瓶。好氧生长阶段，摇瓶于33°C、200 rpm培养至OD₆₀₀值达3.6。此后，添加1.5 mL 500 g/L葡萄糖和2 g CaCO₃启动限氧发酵阶段，培养液于42°C培养。发酵于60 h终止。
【数据】LB平板培养：28°C、24 h；LB液体培养：28°C、200 rpm、10 h；接种量：2%（vol/vol）；改良M9培养基含葡萄糖 5 g/L；好氧生长：33°C、200 rpm至OD₆₀₀=3.6；限氧发酵：添加500 g/L葡萄糖 1.5 mL、CaCO₃ 2 g、42°C；发酵时长：60 h
2.5 生物反应器实验
L-丙氨酸生产的生物反应器实验按前期方法略作修改进行。种子培养物以5%（vol/vol）接种量接种到含30 g/L葡萄糖的改良M9培养基的5-L生物反应器（Winpact FS-02, Major Science, Saratoga, CA, USA）中，发酵液初始体积为3 L。好氧细胞生长阶段通过向反应器通入空气（3至10 L/min）启动，通过200至1000 rpm搅拌使溶解氧浓度维持在30%饱和度以上。发酵温度控制在33°C。当细胞浓度分别达到OD₆₀₀值40、50和60时，温度设为42°C。42°C好氧培养45 min后，关闭通气、将搅拌降至100 rpm、维持温度42°C，启动限氧发酵阶段。向反应器补加600 g/L葡萄糖溶液，维持残糖高于10 g/L。所有葡萄糖消耗完毕时发酵结束。整个过程使用浓NH₄OH维持pH为7。
【数据】生物反应器：5-L（Winpact FS-02）；接种量：5%（vol/vol）；初始葡萄糖：30 g/L；初始体积：3 L；通气量：3-10 L/min；搅拌：200-1000 rpm；溶解氧：>30%饱和度；生长温度：33°C；热诱导OD₆₀₀：40/50/60；42°C好氧培养：45 min；限氧阶段：关闭通气、100 rpm、42°C；补料葡萄糖：600 g/L；残糖维持：>10 g/L；pH：7（NH₄OH维持）
2.6 分析方法
细胞量和葡萄糖浓度按前期报道方法测定。为测定有机酸浓度，样品用H₂SO₄预处理（为样品体积的5%（vol/vol）），以释放发酵过程中与CaCO₃共沉淀的有机酸。有机酸用配备UV检测器（210 nm）的高效液相色谱（HPLC）测定，使用XSelect HSS T3色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）（Waters Technology，美国），以25 mM KH₂PO₄（pH 2.5）为流动相（1 mL/min；40°C）。细胞培养上清液中的丙氨酸按前期报道方法测定。
【数据】HPLC条件：UV 210 nm；色谱柱：XSelect HSS T3（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相：25 mM KH₂PO₄（pH 2.5）；流速：1 mL/min；柱温：40°C；H₂SO₄预处理：样品体积的5%（vol/vol）
2.7 统计分析
每个实验设三个平行组，偏差用偏差线表示。P值<0.05视为具有统计学显著性，显著性表示为P<0.05、P<0.01和P<0.001。
【数据】平行组数：3；显著性阈值：P<0.05；标注方式：P<0.05、P<0.01、P<0.001
研究结果
3.1 优化L-丙氨酸发酵中热诱导的时机
菌株B0016-060BC可在好氧-限氧两阶段发酵中生产L-丙氨酸。好氧生长阶段提高细胞密度有利于在后续限氧阶段获得更高的L-丙氨酸滴度和生产率。然而，获得更高细胞密度会导致碳源浪费和L-丙氨酸产率下降。因此，优化热诱导时机对于平衡L-丙氨酸的滴度、生产率和产率至关重要。
本研究在5-L生物反应器中优化了菌株B0016-060BC的L-丙氨酸发酵。当好氧生长阶段OD₆₀₀值分别达到40、50和60时，启动42°C热诱导。当细胞密度为OD₆₀₀=50时启动热诱导，获得最高L-丙氨酸滴度和生产率，分别为167.7 g/L和2.96 g/L/h（图2a和b）。该滴度较前期报道的OD₆₀₀=30时热诱导显著提高了38.9%。L-丙氨酸产率在较高细胞密度下呈下降趋势，在OD₆₀₀=50时达到中等水平85.6 g/100 g葡萄糖。由于细胞量积累较少，前期研究中菌株B0016-060BC在OD₆₀₀=30时热诱导可获得较高的88.3 g/100 g葡萄糖的L-丙氨酸产率。然而，本研究中OD₆₀₀=50时热诱导的L-丙氨酸滴度显著更高。进一步将热诱导OD₆₀₀值提高至60导致L-丙氨酸产量下降，这可归因于代谢降低的细胞群体过度生长。
因此，OD₆₀₀=50时的热诱导被确定为5-L生物反应器好氧-限氧L-丙氨酸发酵的最佳时机。在OD₆₀₀=50时热诱导条件下，细胞生长阶段丙酮酸过度积累至10.4 g/L，导致溢流代谢，整个发酵过程中乙酸盐积累至9.6 g/L，最终柠檬酸盐积累为0.41 g/L（图2c）。有机酸的过量合成会限制L-丙氨酸产率，化学纯度低至89.4%，不利于商业应用。因此，我们进一步敲除或弱化副产物合成途径，并动态调控糖酵解途径，以提高L-丙氨酸滴度和产率。
【数据】最高L-丙氨酸滴度：167.7 g/L；最高生产率：2.96 g/L/h；较OD₆₀₀=30热诱导滴度提高：38.9%；OD₆₀₀=50时产率：85.6 g/100 g葡萄糖；OD₆₀₀=30时产率：88.3 g/100 g葡萄糖；丙酮酸积累：10.4 g/L；乙酸盐积累：9.6 g/L；柠檬酸盐积累：0.41 g/L；化学纯度：89.4%
3.2 利用蔗糖-NiCl₂筛选的改良基因组编辑方法敲除磷酸转乙酰酶以减少乙酸盐合成
本研究对大肠杆菌基因组编辑方法进行了改良，利用PCR产物和化学合成的ssDNA分别实现基因敲除和插入，无需构建特定质粒，也不在染色体上残留抗生素基因或疤痕。TetA是一种双功能蛋白，可将四环素排出细胞获得四环素抗性，同时改变细胞膜通透性以提高对重金属离子（如NiCl₂）和有毒化合物夫西地酸的敏感性。此外，sacB基因编码的半乳糖蔗糖酶在大肠杆菌中过表达可将蔗糖转化为果糖，果糖的过度积累在蔗糖存在时对细胞具有致死性。然而，sacB和tetA的单拷贝染色体表达在单独存在蔗糖或NiCl₂时未能对细胞生长产生显著抑制作用。
Donald L. Court等人基于夫西地酸和蔗糖联合添加可抑制携带sacB和tetA基因的大肠杆菌细胞生长这一发现，开发了一种无痕编辑方法。然而，阳性菌落比例仅为56%，且夫西地酸不易保存、价格较高。本研究首次采用蔗糖与NiCl₂联合作为反筛选方法回收四环素筛选标记。
通过将sacB和tetA基因整合到大肠杆菌B0016-060BC菌株染色体上构建菌株B0016-060BC-sacB-tetA，并研究了这些菌株在蔗糖和NiCl₂存在下的生长特性（图3a）。较高浓度的蔗糖和NiCl₂可增强对两种菌株的抑制。从两菌株细胞密度比来看，蔗糖存在下的抑制效率高于NiCl₂。当添加10%（vol/vol）蔗糖和90 μmol/L NiCl₂时，最大抑制比率为80.2%。这些条件用于后续研究的反筛选（图3a）。
按照图3b所示方法，在四环素压力下，sacB-tetA基因盒在染色体eutD位点的整合筛选率达100%（图3c）。在优化反筛选条件下，用靶向滞后链的ssDNA切除sacB-tetA盒，获得菌株B0016-070BC，筛选率可达100%（图3c），表明本研究所用改良基因组编辑方法效率高，该方法用于后续研究。
菌株B0016-060BC中敲除编码磷酸转乙酰酶的eutD基因获得菌株B0016-070BC后，摇瓶实验中乙酸盐合成降低26.3%，L-丙氨酸产率提高7.1%（图3d）。因此，抑制乙酸盐积累可有效增强L-丙氨酸合成。大肠杆菌来源的eutD编码含磷酸-乙酰转移酶结构域的蛋白质。EutD的磷酸转乙酰酶活性可能比大肠杆菌Pta更高效。敲低eutD可提高丙酮酸可用性，但尚无研究报道其对乙酸盐合成的影响。本研究在体内验证了eutD的作用，其失活可减少乙酸盐合成。同时，丙酮酸节点衍生产物L-丙氨酸的产率同步提高，与前期发现一致。
【数据】最大抑制比率：80.2%（10%蔗糖+90 μmol/L NiCl₂）；sacB-tetA整合筛选率：100%；ssDNA切除筛选率：100%；乙酸盐合成降低：26.3%；L-丙氨酸产率提高：7.1%
3.3 动态协调糖酵解以控制溢流代谢
菌株B0016-070BC尽管删除了ackA、pta和eutD主要乙酸盐合成途径，仍以乙酸盐为初级副产物。这归因于溢流机制。此后，采用基于丙酮酸感知的糖酵解控制装置动态管理葡萄糖同化速率，同时减少溢流代谢。
丙酮酸脱氢酶调节因子（PdhR）结合丙酮酸后，竞争性抑制其与F9区域（pdhR操纵子的突变体）的相互作用，从而调节下游基因表达。在丙酮酸过度积累条件下，下游基因sgrT被转录激活。SgrT是一种小型调控蛋白，直接抑制大肠杆菌的磷酸转移酶系统（PTS）。这种丙酮酸感知机制触发反馈回路——升高的丙酮酸浓度诱导PTS依赖性葡萄糖摄取的抑制，动态平衡胞内丙酮酸和葡萄糖水平。该调控回路通过协调糖酵解碳通量减轻溢流代谢，为优化微生物发酵代谢效率提供了稳健策略（图4a）。
将四种含糖酵解控制装置的不同重组质粒（图4a）分别转化到菌株B0016-070BC中，考察其对L-丙氨酸合成的影响。表达pGEX-J23100-SdPdhR-J23101-F9-sgrT质粒可增加L-丙氨酸产量。
【数据】丙酮酸感知调控：PdhR-F9系统；下游基因：sgrT（抑制PTS）；质粒：pGEX-J23100-SdPdhR-J23101-F9-sgrT等4种
（以下结果内容原文节选未完整提供，涉及B0016-080BC和B0016-090BC的构建与发酵验证，以及图5、图6、图7对应的结果数据——包括动态调控对副产物积累的抑制效果、TCA循环减弱对氧需求的影响、最终菌株B0016-090BC在5-L反应器中的发酵表现等——原文节选在此处截断。）
讨论与解读
本研究建立了蔗糖-NiCl₂反筛选的无质粒/无疤痕基因组编辑方法。通过三种协调策略对大肠杆菌进行系统代谢工程改造，实现了优异的L-丙氨酸生产：（1）eutD缺失将碳流从乙酸盐合成重新导向；（2）丙酮酸感知的糖酵解控制缓解溢流代谢；（3）通过降解标签融合减弱PDHc，减少TCA循环副产物和氧需求。工程菌株以葡萄糖为唯一碳源生产195.2 g/L L-丙氨酸（化学纯度97.7%），代表了报道的最高滴度和纯度。这些策略展示了减少代谢副产物和优化工业生物生产微生物细胞工厂的有效解决方案。
编译者解读
该研究的技术亮点在于将"动态调控"理念贯穿全程——从诱导时机优化到基因编辑工具创新，再到代谢通路的动态控制，层层递进、逻辑严密。蔗糖-NiCl₂反筛选系统规避了夫西地酸的成本与稳定性问题，为无痕编辑提供了新工具。丙酮酸感知的糖酵解调控装置则体现了合成生物学中"感知-响应"回路在工业发酵中的实用价值。最终菌株以葡萄糖为唯一碳源即达195.2 g/L，纯度97.7%，在工业放大中具有显著优势。值得关注的是，该研究将溢流代谢视为可调控的靶点而非单纯敲除对象，这一思路对其它氨基酸及有机酸的发酵优化具有借鉴意义。后续研究可进一步考察该调控策略在更大规模反应器中的稳健性及非葡萄糖碳源的适配性。
参考来源
Li J. Dynamically metabolic engineering overflow metabolism for efficient production of l-alanine in Escherichia coli. Bioresource Technology, 2025. DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132446
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.132446