来源：13C Metabolic Flux Analysis of acetate conversion to lipids by Yarrowia lipolytica（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
挥发性脂肪酸（VFAs）是廉价的可再生碳源，可通过气体发酵和有机废弃物厌氧消化获得。解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）能将VFAs转化为三酰甘油（TAGs），但其代谢机制尚不清楚。本研究以乙酸盐为唯一碳源，运用平行13C标记示踪结合代谢通量分析（13C-MFA），系统解析了对照菌株与工程菌株在生长阶段和脂质生产阶段的碳代谢通量分布，揭示了乙醛酸支路和糖异生在脂质积累中的关键调控作用。
研究背景
全球气候变化推动了可再生能源研究。玉米和甘蔗糖发酵产生的乙醇虽已实现工业化生产，但柴油等燃料需求持续增长，促使研究者关注TAG衍生的脂肪酸甲酯（FAMEs）。近年提出的两步法工艺先将城市废弃物经厌氧发酵转化为VFAs，再由产油微生物将VFAs转化为TAGs。解脂耶氏酵母凭借出色的TAG超产能力成为有前景的生物催化剂，然而其在VFAs培养基质上的代谢认知仍十分有限。本研究采用乙酸盐作为模式底物，结合13C代谢通量分析，系统探究该酵母在乙酸碳源下的碳代谢重排机制。
研究方法
2.1 菌株与培养条件
本研究使用两株解脂耶氏酵母进行所有13C-MFA实验：对照菌株MTYL037和此前构建的脂质超产工程菌株MTYL065，后者过表达ACC1（乙酰辅酶A羧化酶1）和DGA1（二酰甘油酰基转移酶1）（Tai and Stephanopoulos, 2013）。在工程菌株中，这两个过表达基因编码的酶分别催化TAG合成的第一步和最后一步，从而大幅增强该途径的通量。因此，该菌株对胞质乙酰辅酶A和NADPH有更高的需求。
实验前，两株菌均在含20g/L葡萄糖、5g/L硫酸铵和1.7g/L酵母氮源基础培养基（不含氨基酸和硫酸铵，YNB-AA-AS）的平板上于4°C保存。为准备13C-MFA实验，从相应平板接种，为每株菌建立一个试管（总体积14mL）种子培养。培养基含2mL酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨和10g/L酵母提取物）以快速积累细胞密度。24小时后，将1mL试管培养物转接至40mL摇瓶（总体积250mL）培养基中，含50g/L乙酸钠、1.34g/L硫酸铵和1.7g/L YNB-AA-AS，使细胞适应并同步生长。摇瓶培养基的碳氮比（C/N）为60:1。所有试管和摇瓶培养均在30°C、250rpm条件下进行。
24小时后，每个摇瓶培养物用于接种三个批次小型生物反应器（Applikon Biotechnology MiniBio 250mL，Foster City, CA），初始OD600为0.05。所有生物反应器培养的工作体积为150mL，培养基组成与摇瓶相同。然而，三个生物反应器培养的乙酸钠底物各不相同：一个含100% 1-13C1乙酸钠（Cambridge Isotope Laboratories, Tewksbury, MA），另一个含天然丰度标记的100%乙酸钠，最后一个含40mol% U-13C2乙酸钠（Cambridge Isotope Laboratories, Tewksbury, MA）。所有生物反应器培养温度维持在30°C，通过添加10wt%硫酸将pH维持在7.0。通气速率为1vvm，通过搅拌维持溶解氧水平（DO）为20%。接种后6小时和24小时分别添加100μL 20vol% Antifoam 204（Sigma-Aldrich）以防止起泡。取样口位于生物反应器底部。
摇瓶培养的细胞在接种到生物反应器前需经洗涤。将适量培养液以18,000g离心5分钟，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于1mL用于13C-MFA实验的培养基中。进行第二次离心并弃去上清液。然后将细胞重悬于1mL用于13C-MFA实验的培养基中并转移至生物反应器。
【数据】菌株：MTYL037（对照）、MTYL065（工程菌）；培养基：YPD（20g/L葡萄糖、20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物）；驯化培养基：50g/L乙酸钠、1.34g/L硫酸铵、1.7g/L YNB-AA-AS；C/N比：60:1；温度：30°C；转速：250rpm；初始OD600：0.05；工作体积：150mL；pH：7.0；通气速率：1vvm；DO：20%；消泡剂：100μL 20vol% Antifoam 204（接种后6h和24h添加）；离心：18,000g × 5min；标记物：100% 1-13C1乙酸钠、天然丰度乙酸钠、40mol% U-13C2乙酸钠
2.2 胞外代谢物定量
胞外乙酸盐和柠檬酸盐浓度采用高效液相色谱（HPLC）定量。从每个生物反应器培养液中提取1mL样品，以18,000g离心10分钟。上清液经0.2µm尼龙针头过滤器（Denville Scientific Inc., Holliston, MA）过滤后，在配备G1362A示差折光检测器的Agilent 1200 HPLC系统上分析。分离采用Bio-Rad HPX-87H色谱柱，以14mM硫酸为流动相，流速0.7mL/min。进样体积为10μL。胞外硫酸铵浓度使用铵测定试剂盒（Sigma-Aldrich）测量。
【数据】仪器：Agilent 1200 HPLC + G1362A示差折光检测器；色谱柱：Bio-Rad HPX-87H；流动相：14mM硫酸；流速：0.7mL/min；进样量：10μL；离心：18,000g × 10min；过滤膜：0.2µm尼龙
2.3 干细胞重量测定
干细胞重量（DCW）通过从生物反应器培养液中提取1mL样品，并在预称重的0.2µm硝酸纤维素滤纸（Whatman, Pittsburg, PA）上真空过滤测定。用2倍体积的Milli-Q水洗涤后，样品在60°C下干燥，24小时后再次称重。每个时间点测量时，通过过滤1mL天然丰度乙酸钠培养基并洗涤制备对照滤纸，用于校正样品制备过程中滤纸质量的变化。
【数据】样品量：1mL；滤膜：0.2µm硝酸纤维素；洗涤：2倍体积Milli-Q水；干燥温度：60°C；干燥时间：24h
2.4 脂质定量
解脂耶氏酵母合成的脂肪酸包括棕榈酸（C16:0）、棕榈油酸（C16:1）、硬脂酸（C18:0）、油酸（C18:1）和亚油酸（C18:2），采用气相色谱-火焰离子化检测器（GC-FID）定量。从每个生物反应器中提取0.1–1mL细胞培养液，使样品含约1mg生物量。以18,000g离心10分钟并弃去上清液。细胞沉淀在−20°C下储存直至脂肪酸分析。
分析时，向每个样品中加入100μL内标溶液，含2mg/mL十三烷酸甲酯（Sigma-Aldrich）和2mg/mL三庚酸甘油酯（Sigma-Aldrich）溶于己烷。十三烷酸甲酯用于样品制备过程中的体积损失校正，三庚酸甘油酯用于转酯化效率校正。随后加入500μL 0.5N甲醇钠（20g/L氢氧化钠溶于无水甲醇），样品在1200rpm下涡旋60分钟，使脂质转酯化为脂肪酸甲酯（FAMEs）。之后加入40μL 98%硫酸中和pH。通过添加500μL己烷并在1200rpm下涡旋30分钟提取FAMEs。以6000g离心1分钟去除细胞碎片，提取上层己烷层进行分析。
FAME种类的分离在配备Agilent J&W HP-INNOWax毛细管柱的Bruker 450-GC系统上完成。进样体积为1μL，分流比为10，进样口温度为260°C。色谱柱恒温200°C，以氦气为载气，流速1.5mL/min。FID检测器温度为260°C，氦气尾吹气、氢气和空气流速分别为25mL/min、30mL/min和300mL/min。
【数据】脂肪酸种类：C16:0、C16:1、C18:0、C18:1、C18:2；样品量：0.1–1mL（含约1mg生物量）；离心：18,000g × 10min；储存温度：−20°C；内标：2mg/mL十三烷酸甲酯 + 2mg/mL三庚酸甘油酯（己烷溶解）；转酯化：500μL 0.5N甲醇钠，1200rpm × 60min；中和：40μL 98%硫酸；提取：500μL己烷，1200rpm × 30min；离心：6000g × 1min；进样量：1μL；分流比：10；进样口温度：260°C；柱温：200°C；载气：氦气，1.5mL/min；FID温度：260°C；气体流速：He 25mL/min、H2 30mL/min、空气300mL/min
2.5 胞外通量估算
TAG合成的胞外通量分解为TAG的两个组成成分：AcCoA和甘油-3-磷酸（Glyc3P）。通过测量各阶段TAG的脂肪酸分布来确定每种脂肪酸合成的相对量。然后假设每2mol碳掺入脂肪酸消耗1mol AcCoA，每3mol脂肪酸掺入TAG消耗1mol Glyc3P，计算所需的AcCoA和Glyc3P总量。生脂NADPH需求量也通过假设每次脂肪酸延长步骤消耗2个NADPH、每次去饱和步骤消耗1个NADPH来计算。
需要指出的是，代谢通量估算中未使用生脂NADPH消耗与产生的总平衡。因此，模型中没有纳入NADPH的质量平衡约束，以避免因酶辅因子偏好性假设以及NADPH其他未知来源和汇而引入误差（Schmidt et al. 1998; Ahn and Antoniewicz, 2011）。所有胞外通量均归一化至乙酸摄取速率为100。
对DCW、柠檬酸盐、生脂AcCoA、Glyc3P和NADPH相对于乙酸盐的曲线进行线性回归，确定最佳拟合线的斜率。由于该斜率代表这些代谢物在乙酸盐上的得率，其值乘以100即得到基于任意固定的乙酸消耗速率的归一化胞外通量。每株菌三个生物反应器培养的结果取平均值，标准偏差视为所获通量的不确定性。
【数据】计算假设：1mol AcCoA/2mol碳、1mol Glyc3P/3mol脂肪酸、2 NADPH/脂肪酸延长步骤、1 NADPH/去饱和步骤；归一化基准：乙酸摄取率=100；统计方法：线性回归，平均值±标准偏差
研究结果
3.1 发酵曲线与代谢稳态的确立
解脂耶氏酵母在乙酸盐上的代谢与葡萄糖显著不同，因此培养条件也必须区别对待。以葡萄糖为碳源时，培养基pH逐渐降低——这对摇瓶培养不构成问题，因为解脂耶氏酵母能耐受相对酸性的环境。然而，当以乙酸盐为碳底物时，培养基pH在48小时后迅速升高至10，此时细胞无法存活（数据未显示）。生长速率也受此pH效应阻碍，导致可达到的细胞密度低，胞内代谢物无法以可观量提取，在GC-MS和LC-MS/MS分析中产生低信噪比。
为解决这些问题，MFA实验使用250mL小型生物反应器以提供pH控制并维持恒定值7。在低氮培养基（初始C/N=60）中以乙酸钠为唯一碳源培养工程脂质超产菌株MTYL065和对照菌株MTYL037，评估并比较其性能。每株菌进行三次重复培养，其中一次在1-13C1乙酸钠中，一次在天然丰度乙酸钠中，另一次在40% U-13C2乙酸钠中。图2和图3显示了这六次培养的时程发酵曲线。
pH控制的加入显著延长了发酵时间至48小时以上，积累的细胞密度足以进行代谢物提取。铵消耗的时程（图2b）显示，接种后44至56小时之间氮已从培养基中耗尽，从而将整个发酵期分为两个阶段：G阶段——氮存在允许生物量积累（24–44小时）；LP阶段——氮耗尽导致细胞将过量碳转化为脂质（56–76小时）。
LP阶段期间，MTYL065菌株消耗乙酸盐和产生脂质的速率远快于MTYL037菌株（图2a和3a）。这些差异在G阶段不那么明显。三个MTYL065培养物的最终脂质含量（g脂质/g干细胞重）为53–60%，远高于三个MTYL037培养物可达到的含量（23–28%）。
图4显示的脂肪酸分布在两株菌和两个发酵阶段之间相似，油酸是主要脂肪酸种类，约占总脂肪酸的55%。
通过HPLC确定的唯一副产物是柠檬酸盐。G阶段期间，两株菌均未产生可检测量的柠檬酸盐（图2c）。然而，柠檬酸盐在LP阶段开始积累，MTYL037菌株产生的量几乎是MTYL065菌株的四倍。
进行稳态13C-MFA时，胞内代谢物的同位素标记模式必须处于稳态。为满足这一要求，细胞在研究期间必须维持在代谢稳态，即所有胞内和胞外通量随时间保持不变。如果该条件维持足够长时间，胞内代谢物的标记模式将最终达到同位素稳态，之后可收获并分析代谢物（Wiechert, 2001）。本研究使用中心碳代谢物的标记模式进行13C-MFA。由于这些代谢物具有非常快的周转速率，如果培养物维持在代谢稳态，可以预期它们相对较快地达到同位素稳态（Canelas et al. 2008）。
发酵曲线可用于判断是否达到代谢稳态。G阶段期间，细胞利用培养基中的氮源并活跃分裂。在这些条件下，通常认为批次培养中细胞的指数生长行为近似代谢稳态。本研究中使用的生物反应器批次培养确实观察到指数生长，如干细胞重时程所示（见补充图S1），因此G阶段达到了代谢稳态。LP阶段期间，细胞不再能获得氮且无法再分裂，导致细胞数恒定并失去指数生长行为。由于培养物中总细胞数保持恒定，如果细胞处于代谢稳态，则预期整个培养物以恒定速率消耗乙酸盐并产生柠檬酸盐和脂质。事实上，图2和图3中的发酵曲线在LP阶段（56–76h）几乎呈线性，表明消耗和产生速率恒定。因此，该阶段也达到了代谢稳态。G和LP阶段均跨越20小时的时间框架，使得代谢稳态维持足够长的时间，使中心碳代谢物在每次发酵阶段结束附近收获时已达到同位素标记稳态。
【数据】pH：7.0（生物反应器控制）；C/N比：60:1；G阶段：24–44h；LP阶段：56–76h；MTYL065脂质含量：53–60%；MTYL037脂质含量：23–28%；油酸占比：~55%；柠檬酸盐产生：MTYL037约为MTYL065的4倍；标记物：1-13C1乙酸钠、天然丰度乙酸钠、40% U-13C2乙酸钠
3.2 胞外通量
基于图2和图3所示结果，确定了MTYL037和MTYL065两株菌的胞外通量。此外，每株菌的两个发酵阶段均进行了分析。在全部四种情况下，乙酸摄取速率被任意固定为100，以比较跨阶段和跨菌株的胞内代谢通量分布。干细胞重、柠檬酸盐、生脂AcCoA、Glyc3P和NADPH的胞外通量基于乙酸摄取速率归一化。这些胞外通量值及其不确定性列于表1中，直接用于代谢通量分析。
这些结果表明，G阶段期间，对照菌株MTYL037利用碳源产生的生物量比工程菌株MTYL065多20%。另一方面，MTYL065菌株在同一阶段产生的TAG比MTYL037多50%。至于LP阶段，MTYL065菌株明显优于MTYL037菌株，产生的TAG几乎是后者的两倍。此外，对照菌株产生了显著更高量的副产物柠檬酸盐，导致其脂质得率偏低。
【数据】乙酸摄取速率：固定为100（归一化基准）；G阶段生物量：MTYL037比MTYL065多20%；G阶段TAG：MTYL065比MTYL037多50%；LP阶段TAG：MTYL065约为MTYL037的2倍
3.3 生物量组成
从（Pan and Hua 2012）获得的生物量方程经轻微修改以反映对照菌株和工程菌株之间脂质含量的差异。G阶段结束时达到的最终脂质含量为MTYL037菌株17.2%，MTYL065菌株32.2%。每克干细胞重中氨基酸、碳水化合物、核苷酸、磷脂和甾醇的量列于补充表S1中，两株菌均列出。该生物量公式用于13C-MFA中，估算TAG以外的生物量大分子合成通量。
【数据】G阶段终脂质含量：MTYL037为17.2%，MTYL065为32.2%
3.4 胞内通量
对全部四种情况进行了13C-MFA。所有场景中，使用通过HPLC和GC-FID获得的实测胞外通量以及通过GC-MS和LC-MS/MS获得的代谢物标记模式作为输入。中心碳代谢的最佳拟合通量值如图5所示，若干重要代谢反应的通量置信区间如图6和图7所示。
G阶段，MTYL037和MTYL065 MFA模型的残差平方和分别为196.1和191.0。两个值均落在170.0–235.6范围内，这是模型准确描述数据所需的范围。类似地，MTYL037和MTYL065 LP阶段模型的残差平方和分别为189.3和160.2，均落在134.0–199.1的所需范围内（Antoniewicz et al. 2006）。实验测量与模型模拟的标记模式之间的一致性表明模型有效。
【数据】G阶段残差平方和：MTYL037为196.1、MTYL065为191.0（接受范围170.0–235.6）；LP阶段残差平方和：MTYL037为189.3、MTYL065为160.2（接受范围134.0–199.1）
讨论与解读
本研究对以乙酸盐为唯一碳源培养的对照菌株和工程菌株解脂耶氏酵母进行了13C-MFA。对每株菌分别分析了G阶段（氮耗尽前）和LP阶段（氮耗尽后），共获得四张代谢通量分布图。通过使用1-13C1乙酸钠和40% U-13C2乙酸钠作为平行示踪剂，获得了TCA循环和乙醛酸支路的高分辨率通量，以及糖异生和磷酸戊糖途径的良好分辨率通量。
结果表明，两株菌在两个阶段的乙醛酸支路通量均较高，且四种情况下的通量值无显著差异。如前所述，当乙酸盐作为主要碳源时，乙醛酸支路因提供回补反应途径而被激活。糖异生通量在解脂耶氏酵母的两个发酵阶段均至关重要。G阶段，糖异生补充不断被抽离用于生成生物量大分子的上部糖酵解和PPP代谢物池。LP阶段，由糖异生支持的氧化PPP通量产生脂质合成所需的NADPH。然而，糖异生中的某些步骤消耗ATP或NADH，因此细胞维持大通量通过该途径代价高昂。
通量分布证明乙醛酸支路持续活跃，糖异生通量随菌株和阶段而变化。通过调控苹果酸转运和丙酮酸激酶的活性，细胞仅分流部分乙醛酸支路通量，以满足回补反应和通过糖异生及氧化磷酸戊糖途径产生NADPH的需求。多余通量回流至TCA循环用于能量产生。与葡萄糖为底物的情况一样，生脂NADPH的主要来源来自氧化PPP。
编译者解读
本研究展示了13C-MFA在非模式产油酵母代谢解析中的强大能力。方法亮点在于平行双示踪策略——1-13C1和U-13C2乙酸钠的组合使用，使研究者能够同时解析TCA循环、乙醛酸支路和糖异生的通量分配，这是单一示踪剂难以实现的。从合成生物学应用角度看，该研究明确了乙醛酸支路作为乙酸代谢枢纽的地位，并揭示了苹果酸转运和丙酮酸激酶作为通量分流调控点的潜力——这为未来通过代谢工程精细调控碳流向、提高脂质得率提供了明确的基因操作靶点。值得注意的是，工程菌MTYL065在LP阶段脂质产量翻倍但柠檬酸副产物显著减少，提示ACC1和DGA1的过表达不仅增强了TAG合成能力，还可能通过改变胞内代谢物平衡间接影响了副产物形成。局限在于NADPH平衡未纳入模型约束，氧化PPP通量的估算仍依赖假设，后续研究可结合13C标记的NADPH示踪进一步精化。
参考来源
Liu N. 13C Metabolic Flux Analysis of acetate conversion to lipids by Yarrowia lipolytica. Metabolic Engineering, 2016. DOI: 10.1016/j.ymben.2016.06.006
DOI: 10.1016/j.ymben.2016.06.006