来源：Metabolic model-guided strain design for improved succinic acid production in Yarrowia lipolytica（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
琥珀酸是重要的生物基平台化学品，传统细菌宿主在低pH工业条件下耐受性差。本研究以解脂耶氏酵母W29菌株为对象，构建了包含634个基因、1130个代谢物和1364个反应的基因组规模代谢模型iWT634，在18种碳源上预测准确率达88.9%。利用OptKnock和OptGene算法鉴定出SDH和ACH双敲除靶点，SA通量达4.36 mmol/gDW/h，过表达TCA/乙醛酸循环酶可再提升产量达186%。
研究背景
琥珀酸（SA）是一种四碳二羧酸，被美国能源部列为前12位生物基平台化合物之一。除用于可降解塑料、医药和食品添加剂外，SA还可转化为1,4-丁二醇、四氢呋喃和γ-丁内酯等高值衍生物。传统石油基SA生产能耗高且不可持续。生物基SA生产虽更环保，但典型细菌宿主如产琥珀酸放线杆菌和大肠杆菌在工业低pH条件下酸耐受性差、生产力下降，需要持续pH控制，推高了运营成本。
非常规酵母解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）凭借其固有酸耐受性、代谢多功能性以及利用粗甘油和木质纤维素水解物等低成本底物的能力，成为有前景的替代宿主。其中W29菌株及其衍生菌株尤其值得关注。构建可靠的基因组规模代谢模型（GEM）是实现理性菌株工程改造的基础工具。
研究方法
2.1 代谢模型重建
采用基于支架（scaffold）的方法重建Y. lipolytica W29菌株（Loira等，2012）的草稿GEM，利用为亲缘关系密切的CLIB122菌株建立的模型。该方法基于直系同源模型转移原理，以系统发育接近的生物体（支架）的精细GEM为模板，基于基因同源性和功能保守性生成目标生物的草稿模型。
具体操作中，对CLIB122（命名为YALI0，NCBI登录号GCA_000002525.2）和W29（命名为YALI1，NCBI登录号GCA_001761485.1）的基因组进行比较基因组分析，利用先前研究中概述的方法（Tang等，2021）鉴定具有保守代谢功能的直系同源基因。选择基于YALI0组装的两个已建立模型——iNL895（Loira等，2012）、iYL619（Pan和Hua，2012）和iYLI647（Mishra等，2018）作为支架，因为它们来自不同资源、采用不同方法构建。
对YALI0与YALI1之间每对直系同源基因，YALI0基因对应的反应被视为保守并转移至W29草稿模型，由此产生三个YALI1组装的初始草稿模型。随后比较三个草稿模型以鉴定共有和特有反应。三个草稿中均存在的反应被视为高置信度反应，直接保留在最终草稿模型中。特定草稿独有的反应则需进一步人工审查。该方法利用了YALI0模型的完善文档，同时使其适应YALI1的基因组背景。
草稿构建后，按照Thiele和Palsson（2010）建立的高质量GEM严格流程进行细致的人工校正。三个草稿模型之间的差异，包括反应存在性、方向性、化学计量和基因关联，均结合基因组证据、文献支持和通路背景进行人工核查。为确保网络连通性和功能完整性，人工校正并纳入必要的转运反应和交换反应，以正确模拟代谢物摄取和分泌——这对通量平衡分析（FBA）和菌株设计应用至关重要。
碳限制和氮限制条件下Y. lipolytica的生物量组成采用Mishra等（2018）的数据，他们基于多来源实验测量的大分子组分（蛋白质、碳水化合物、脂质、RNA和DNA）编制了条件特异性生物量方程。生长相关维持（GAM）和非生长相关维持（NGAM）ATP需求来自Papanikolaou和Aggelis（2002）的恒化培养数据子集。GAM代表与生物量合成相关的ATP需求，NGAM代表与生长无关的细胞过程（如维持膜电位和大分子周转）所需ATP。这些参数通过分析ATP需求与稀释速率之间的线性关系来估算，可从ATP需求对稀释速率的图中直接读取。
综合人工校正过程消除了基于支架的草稿中的重建伪影，使最终模型反映YALI1基因组的独特代谢特征。所得菌株特异性GEM是Y. lipolytica W29菌株首个经过详细构建和功能验证的代谢重建，为系统水平分析和理性菌株设计提供了平台。
2.2 模型验证
通过FBA验证校正后的GEM。FBA在稳态条件下模拟代谢网络行为，优化目标函数（通常为生物量生产），受化学计量、热力学和通量容量约束。数学上，FBA问题表述如下：
目标函数：max Z = Cᵀ ∗ v
约束条件：S ∗ v = 0；lb ≤ v ≤ ub
其中Z为目标函数，Cᵀ为目标函数系数向量，v为每个代谢反应的通量值，S为化学计量矩阵，lb和ub为每个反应通量的上下界。
FBA使用MATLAB中的COBRA Toolbox v3.0执行（Heirendt等，2017），默认目标函数为生物量形成。FBA预测的通量分布使用Escher map可视化（King等，2015）。
评估模型预测准确性时，通过FBA在不同碳源上进行生长模拟，并与已发表实验数据对比。计算每个碳源的布尔值（生长为true，不生长为false）进行定性验证。进一步定量验证将预测比生长速率与以甘油为碳源的恒化培养实验稀释速率（Papanikolaou和Aggelis，2002；Rywińska等，2011）进行比较。由于Papanikolaou和Aggelis（2002）数据集的一部分用于估算GAM和NGAM，采用Rywińska等（2011）和Papanikolaou和Aggelis（2002）剩余恒化数据独立验证，避免过拟合。
2.3 基因敲除靶点鉴定
使用两种计算机菌株设计工具OptKnock（Burgard等，2003）和OptGene（Patil等，2005），在YALI1组装GEM中系统鉴定基因敲除策略。OptKnock采用双层优化框架，内层目标为最大化生物量生长，外层目标为最大化SA通量，通过混合整数线性规划求解。OptGene采用基于遗传原理的进化算法，迭代进化敲除组合群体以直接优化SA产量。
两种方法均使用COBRA Toolbox v3.0执行，假设甘油为唯一碳源，好氧条件下固定摄取速率为10 mmol/gDW/h。敲除候选仅限于中心碳代谢相关基因，删除数量受限。
研究结果
3.1 模型重建与验证
采用基于支架的方法重建Y. lipolytica W29菌株GEM，经严格人工校正后，所得模型命名为iWT634，包含634个代谢基因、1130个代谢物和1364个反应，分布于八个区室：胞质（c0）、胞外（e0）、高尔基体（g0）、线粒体（m0）、细胞核（n0）、内质网（r0）、液泡（v0）和过氧化物酶体（x0）。
基于W29 YALI1组装的iWT634与基于CLIB122 YALI0组装的先前模型（包括iNL895、iYL619、iMK735和iYLI647）的比较分析见补充材料。iWT634在反应覆盖度、代谢物多样性、基因含量和区室组织方面与iMK735和iYLI647模型相似度更高。
为评估模型预测准确性，通过FBA模拟18种不同碳源上的细胞生长。模型预测与多项研究的实验验证生长数据对比。模型准确预测了18种底物中16种的正向（真阳性，TP）或负向（真阴性，TN）生长结果，总体预测准确率为88.9%（图1A）。预测与实验数据的高度一致性凸显了模型捕获Y. lipolytica代谢能力的能力。
定量验证方面，以甘油为唯一碳源、氮限制恒化条件下模拟比生长速率，并与实验报道的稀释速率比较。通过将甘油摄取和柠檬酸分泌限制在文献值，FBA预测的比生长速率与实验观察紧密匹配，相关性达R² = 0.98，p < 0.001（图1B）。
【数据】碳源数：18；预测准确率：88.9%；R²：0.98；p < 0.001；甘油摄取：10 mmol/gDW/h
利用验证后的GEM，以葡萄糖为碳源、氮限制条件下模拟中心碳和能量通量分布（图2）。模型预测线粒体苹果酸酶（基因YALI1_E22303g；反应ME1m和ME2m）通量可忽略不计——该酶传统上被认为是产油微生物脂肪酸生物合成的主要NADPH来源。这一预测与Zhang等（2016）的¹³C代谢通量分析一致，提示存在替代性NADPH来源。模拟结果显示胞质NADP⁺依赖性异柠檬酸脱氢酶（YALI1_F06197g；反应ICDHyr）是主要NADPH供应者，支持Ratledge（2014）关于产油酵母NADPH再生的假说。额外NADPH供应来自氧化性磷酸戊糖途径（PPP）酶，包括葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（YALI1_E26811g；反应G6PDH2r）和6-磷酸葡糖酸脱氢酶（YALI1_B20462g；反应GND），与PPP在Y. lipolytica脂质过量产生中作用的先前发现一致。
模型还预测了胞质ATP-柠檬酸裂解酶（YALI1_D32268g和YALI1_E41315g，反应CS）的条件依赖性作用——该酶在氮限制下活跃（图2中反应CS），但在碳限制条件下失活。这一调控行为与同位素标记数据和基因敲除研究一致，强调该酶在氮限制下为Y. lipolytica脂质积累提供乙酰-CoA的关键作用。
【数据】氮限制碳源：葡萄糖；NADPH主要来源：ICDHyr；苹果酸酶通量：可忽略；ATP-柠檬酸裂解酶：氮限制活跃/碳限制失活
以乙酸盐为碳源的FBA模拟显示，线粒体TCA循环高通量提供NADH用于ATP合成，乙醛酸支路和糖异生途径中等通量产生生物量合成前体，与先前¹³C代谢通量分析一致。
【数据】碳源：乙酸盐；TCA循环：高通量；乙醛酸支路/糖异生：中等通量
3.2 基因敲除策略鉴定
将OptKnock和OptGene两种算法应用于W29菌株GEM。两种算法均鉴定出琥珀酸脱氢酶（SDH）为首要敲除靶点。SDH由与反应SUCD2_u6m和FRDm相关的基因编码（YALI1_D30256g、YALI1_D14260g、YALI1_E35082g和YALI1_A14721g），催化TCA循环中琥珀酸氧化为延胡索酸。敲除SDH可阻止琥珀酸消耗，将碳通量导向其分泌。
实验研究支持这一策略：Yuzbashev等（2010）敲除SDH2亚基，在pH控制分批发酵中实现45.5 g/L SA产量，无pH控制时为17.4 g/L。Gao等（2016）靶向SDH5亚基，从粗甘油中分批发酵获得43 g/L，补料分批发酵获得160.2 g/L。
对ΔSDH突变株进行FBA模拟，预测SA通量仅为0.034 mmol/gDW/h，远低于预期，伴随高乙酸通量8.42 mmol/gDW/h（图3A）。为探究这一差异，进行通量变异分析（FVA）以探索替代最优解。FVA鉴定出通过激活乙醛酸支路的高琥珀酸替代方案（3.96 mmol/gDW/h），乙酸产生完全抑制（0 mmol/gDW/h）（图3A）。此外，Gao等（2016）的实验数据提示第三种方案——乙酸和琥珀酸平衡共生产。将此实验约束纳入模型后，产生精炼通量分布，琥珀酸和乙酸分泌通量分别为2.17和4.34 mmol/gDW/h。
在三种方案中，SDH缺失均破坏TCA循环，损害NADH等还原当量再生，降低通过氧化磷酸化的ATP合成，使生长速率从0.40 h⁻¹降至约0.23 h⁻¹。低琥珀酸高乙酸、高琥珀酸无乙酸、平衡共生产三种方案反映了ΔSDH突变株的代谢灵活性，由乙醛酸支路（反应ICL和MALS）等途径的差异激活驱动。
【数据】ΔSDH预测SA通量：0.034 mmol/gDW/h；乙酸通量：8.42 mmol/gDW/h；FVA高琥珀酸方案：3.96 mmol/gDW/h；平衡方案SA/乙酸：2.17/4.34 mmol/gDW/h；生长速率：0.40→0.23 h⁻¹
进一步敲除乙酰-CoA水解酶（ACH）以抑制乙酸生成。ΔSDHΔACH双敲除株的FBA模拟显示SA通量达4.36 mmol/gDW/h（0.56 g/g甘油），乙酸通量降至0.21 mmol/gDW/h。与单敲除SDH相比，SA产量大幅提升。双敲除株的通量变异分析显示单一最优解，消除了ΔSDH单敲除株的代谢灵活性。
【数据】ΔSDHΔACH SA通量：4.36 mmol/gDW/h；SA产率：0.56 g/g甘油；乙酸通量：0.21 mmol/gDW/h
3.3 过表达靶点鉴定与SA生产策略
利用OptForce工具鉴定ΔSDH突变株中可增强SA产量的过表达靶点（图4）。预测结果显示，过表达丙酮酸羧化酶和TCA/乙醛酸循环酶可进一步提升SA产量达186%。非生长偶联靶点中，异柠檬酸裂解酶（ICL）的过表达虽能提升SA产量，但会显著损害生长速率。
综合敲除与过表达策略，研究提出了模型驱动的代谢工程路线图（图5），从野生型出发，依次引入SDH缺失、ACH缺失，再叠加关键酶过表达，实现SA产量的梯次提升。
【数据】过表达提升幅度：最高186%；SA通量：4.36 mmol/gDW/h；产率：0.56 g/g甘油
讨论与解读
本研究构建的iWT634模型在定性预测（88.9%准确率）和定量预测（R²=0.98）两个层面均表现优异。模型揭示了氮限制下NADPH供应的重新分配——胞质异柠檬酸脱氢酶而非传统认为的苹果酸酶是主要NADPH来源，这一发现与¹³C代谢通量分析一致。SDH和ACH双敲除策略在计算机模拟中实现4.36 mmol/gDW/h的SA通量，与实验数据吻合。过表达TCA/乙醛酸循环酶的理论增益达186%。
编译者解读：该研究的核心价值在于建立了从模型构建到菌株设计的完整计算工作流。与常规的"敲除-筛选"试错法不同，模型预测的SDH敲除后代谢灵活性（三种可能方案）提示了单一基因操作可能导致的代谢分流风险，而双敲除策略正是基于这一洞察——这是计算驱动设计的典型案例。局限在于过表达靶点尚停留在计算机预测层面，未经过实验验证；此外，模型预测的186%理论增益是否能在实际发酵中实现，取决于酶动力学和调控网络的复杂性。对合成生物学而言，这种"先计算、后实验"的模式正成为菌株工程的标准范式。
参考来源
期刊：Bioresource Technology, 2026
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.133508
DOI: 10.1016/j.biortech.2025.133508