来源：Use of Palmaria palmata and Fucus vesiculosus hydrolysates for Yarrowia lipolytica biomass and erythritol production（Algal Research）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
海洋大型藻类富含碳水化合物而蛋白质含量相对较低，是理想的生物炼制原料。本研究以掌状红皮藻（Palmaria palmata）和墨角藻（Fucus vesiculosus）为底物，经水热预处理和酶解获得水解液，用于解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）NCYC 2904在搅拌罐生物反应器中的培养。研究发现该酵母能高效同化木糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸等多种碳源，其中岩藻糖和葡萄糖醛酸的利用为首次报道。最高赤藓糖醇浓度达40 g·L⁻¹，酵母生物量蛋白含量达29%（w/w，干重），脂质含量最高达15%（w/w，干重），为蓝色生物炼制提供了新路径。
研究背景
全球大型藻类开发近年来迅速扩张，海藻养殖市场预计2025年达254亿美元，2029年前复合年增长率12.9%。海藻及其生物分子在食品、膳食补充剂、饲料添加剂、农业生物肥料等领域应用广泛。由于富含碳水化合物和/或脂质，大型藻类也被视为通过微生物发酵或物理化学转化生产生物燃料的潜力原料。此外，海藻养殖在综合多营养级水产养殖系统中通过吸收二氧化碳、代谢氮磷排泄物发挥关键的生态作用。高生物量产量、快速生长、环境要求低、碳平衡正效应以及不与陆生植物竞争淡水和耕地等优势，支撑了海藻的经济可持续利用。然而，海藻养殖的快速扩张和意外释放也导致入侵物种扩散，威胁沿海生态系统。海藻作为生物活性化合物的可再生来源与生态管理挑战的双重角色，凸显了开发可持续海藻生物炼制策略的紧迫性。
研究方法
2.1 海藻表征
海藻购自AlgaPlus（葡萄牙Ílhavo），该公司为IMTA海藻生产商。Fucus vesiculosus整株干燥供应，粉碎至小于5 mm；Palmaria palmata干燥粉碎供应（薄片<5 mm）。海藻储存于密封塑料袋中，室温避光保存直至使用。水分和灰分含量分别通过105 °C烘箱干燥和马弗炉575 °C煅烧至恒重测定。总碳和总氮含量使用UNICUBE®元素分析仪（Elementar，Langenselbold，德国）定量。蛋白质含量采用氮含量乘以转换因子5估算。总脂质按Ferreira等描述的方法，经氯仿和甲醇混合物提取后定量。碳水化合物组成通过NREL/TP-510-42618协议的两步定量酸水解评估：（i）72% H₂SO₄，30 °C，60 min；（ii）4% H₂SO₄，121 °C，60 min。定量酸水解释放的单体糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸浓度通过高效液相色谱（HPLC）定量，相应的聚合组分——葡聚糖、木聚糖、岩藻聚糖和糖醛酸——使用标准化化学计量校正因子计算（木聚糖0.88，葡聚糖和岩藻聚糖0.90，糖醛酸0.92）。水解释放的甘露醇也通过HPLC定量。获得的不溶相在105 °C烘箱干燥，表示为酸不溶性残渣。矿物元素（钠、钾、镁、钙、磷、铁、锰、铅、锌）通过电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES，PerkinElmer，Waltham，MA，USA）测定。分析前，海藻样品使用Berghof微波消解系统（Speedwave four DAP-60+，Berghof Products + Instruments GmbH，Eningen，德国）的特定藻类消解协议进行消解。消解样品用蒸馏水稀释，在以下ICP-OES操作条件下分析：射频功率1350 W；氩等离子体流量10 L·min⁻¹；辅助气体流量0.2 L·min⁻¹；雾化器气体流量0.6 L·min⁻¹。各元素发射波长（nm）为：Na，589.59；K，766.49；Mg，285.21；Ca，317.93；P，213.62；Fe，238.20；Mn，257.61；Pb，283.31；Zn，213.86。
【数据】干燥温度：105 °C；煅烧温度：575 °C；酸水解条件：72% H₂SO₄/30 °C/60 min + 4% H₂SO₄/121 °C/60 min；校正因子：木聚糖0.88、葡聚糖/岩藻聚糖0.90、糖醛酸0.92；ICP-OES功率：1350 W；氩气流量：10 L·min⁻¹；辅助气：0.2 L·min⁻¹；雾化气：0.6 L·min⁻¹
2.2 微生物
Yarrowia lipolytica NCYC 2904在YPD培养基（20 g·L⁻¹葡萄糖、20 g·L⁻¹蛋白胨、10 g·L⁻¹酵母提取物）中培养2天，储存于20%（v/v）甘油的−80 °C条件下直至预接种物制备。
【数据】YPD培养基：20 g·L⁻¹葡萄糖、20 g·L⁻¹蛋白胨、10 g·L⁻¹酵母提取物；培养时间：2天；储存温度：−80 °C
2.3 水热预处理与酶解
海藻在高压灭菌器中于121 °C、30 min条件下进行水热预处理，固形物负载量为15%（w/w），溶剂为50 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 4.8）。预处理在1000 mL锥形瓶中进行，工作体积200 mL。获得的浆料在50 °C、200 rpm搅拌条件下使用商业酶混合物Cellic CTec3（Novozymes，Bagsværd，丹麦）进行酶解，酶用量为每克干固体15滤纸单位（FPU）。P. palmata水解48 h，F. vesiculosus水解96 h。对P. palmata还评估了一个额外条件：预处理前将海藻用蒸馏水洗涤四次，60 °C烘箱干燥16 h。获得的水解液经过滤、离心，并通过HPLC定量单体和寡聚糖。
【数据】预处理：121 °C、30 min、15%（w/w）固形物、50 mM柠檬酸盐缓冲液（pH 4.8）；酶解：50 °C、200 rpm、15 FPU/g干固体；水解时间：P. palmata 48 h、F. vesiculosus 96 h；洗涤条件：蒸馏水4次、60 °C干燥16 h
2.4 生物反应器实验
使用2-L DASGIP平行生物反应器系统（Eppendorf，Hamburg，德国），工作体积400 mL，评估不同海藻水解液（PH——P. palmata水解液、WPH——洗涤P. palmata水解液、FH——F. vesiculosus水解液）作为Y. lipolytica生长、胞内化合物积累和代谢产物产生的底物。培养基补充2 g·L⁻¹玉米浆（CSL）和(NH₄)₂SO₄，C/N比为20（PH中2.2 g·L⁻¹，WPH中2.8 g·L⁻¹，FH中0.6 g·L⁻¹）。Yarrowia lipolytica NCYC 2904细胞在YPD中过夜培养后，离心并以初始浓度0.5 g·L⁻¹重悬于P. palmata或F. vesiculosus水解液培养基中。分批培养在27 °C、搅拌速率800 rpm、通气速率3 vvm条件下进行。pH通过4 M HCl或4 M NaOH自动维持在5.5 ± 0.5。
【数据】工作体积：400 mL；CSL：2 g·L⁻¹；C/N比：20；(NH₄)₂SO₄：PH 2.2 g·L⁻¹、WPH 2.8 g·L⁻¹、FH 0.6 g·L⁻¹；初始细胞浓度：0.5 g·L⁻¹；温度：27 °C；搅拌：800 rpm；通气：3 vvm；pH：5.5 ± 0.5
2.5 分析方法
Yarrowia lipolytica生物量浓度通过Neubauer计数板在双目明场显微镜下细胞计数定量，并通过转换因子1.94 × 10¹⁰ cells·g⁻¹换算为细胞干重（g·L⁻¹）。葡萄糖、木糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、甲酸、甘露醇和赤藓糖醇浓度通过高效液相色谱（LC 2060C，Shimadzu，日本）定量，使用Aminex HPX-87H色谱柱（300 mm × 7.8 mm，8 μm粒径），配备示差折光（RI）和紫外（λ = 210 nm）检测器。柱温维持在60 °C，流动相为5 mM硫酸，流速0.7 mL·min⁻¹。使用比色皿测试试剂盒LCK 338（Hach-Lange GmbH，德国）对水解液中的总氮进行分光光度测定。胞内脂质使用磷钒素比色法在冻干细胞中定量，脂质组成在氯仿提取和硫酸–甲醇混合物（85:15，v/v）甲基化后测定，遵循Lopes等的协议。冻干酵母细胞的总蛋白通过氮含量乘以转换因子6.25估算，使用UNICUBE®元素分析仪（Elementar，Langenselbold，德国）测定。生物量氨基酸组成在细胞酸水解后通过超高效液相色谱（UHPLC，SCL-40，Shimadzu，日本）测定，配备自动化柱前衍生模块（RF-20AXS，Shimadzu）。冻干细胞用2 mL 6 N HCl在100 °C水解24 h。水解液用超纯水稀释（1:100，v/v）并与内标溶液高丝氨酸（5 mg·L⁻¹）按1:1（v/v）混合。柱前衍生化使用自动进样器集成预处理功能自动进行，试剂为巯基丙酸/邻苯二甲醛（MPA/OPA）、9-芴基甲基氯甲酸酯（FMOC）和磷酸水溶液的混合物，遵循Hakyakawa提供的协议。氨基酸在Shim-pack XR-ODS II色谱柱上分析，柱温40 °C。流动相由20 mmol·L⁻¹醋酸钠缓冲液（pH 6.0）、水:乙腈（1:9，v/v）和含0.5 mmol·L⁻¹ EDTA-2Na的20 mmol·L⁻¹醋酸钠缓冲液（pH 5.0）组成。洗脱采用梯度法，流速0.8 mL·min⁻¹。采用荧光检测，OPA和FMOC衍生物的激发/发射波长按制造商协议设置。制备多个浓度的0.1 M HCl氨基酸标准溶液，与样品经历相同的衍生化和分析程序以建立校准曲线。氨基酸通过比较与标准氨基酸混合物的保留时间进行鉴定。
【数据】细胞干重转换因子：1.94 × 10¹⁰ cells·g⁻¹；HPLC柱：Aminex HPX-87H（300 mm × 7.8 mm，8 μm）；柱温：60 °C；流动相：5 mM H₂SO₄；流速：0.7 mL·min⁻¹；蛋白转换因子：6.25；酸水解：2 mL 6 N HCl、100 °C、24 h；内标：高丝氨酸5 mg·L⁻¹；UHPLC柱温：40 °C；流速：0.8 mL·min⁻¹
2.6 统计分析
使用GraphPad Prism 7软件（Dotmatics，California，USA）进行单因素方差分析（ANOVA）和Tukey检验，以确定均值间的显著性差异（p < 0.05）。
【数据】显著性水平：p < 0.05
研究结果
3.1 海藻组成
灰分含量作为海藻矿物质浓度的指标，在F. vesiculosus和P. palmata中相近（表1）。红藻P. palmata的蛋白质含量比F. vesiculosus高1.9倍。海藻蛋白质定量的可靠性受氮-蛋白转换因子选择的显著影响，给结果解读带来较大不确定性。常用因子6.25假设蛋白质是氮的唯一来源，可能导致高估——海藻含有大量非蛋白氮源，如游离氨基酸、叶绿素、核酸和无机氮。Mæhre等提出海藻的平均因子为4.92，而Maribu等报道P. palmata样品的值在3.61至5.13之间。鉴于缺乏共识，本研究采用Angell等推荐的因子5作为海藻更可靠的通用转换因子。P. palmata的蛋白质含量最高可达干质量的42%，但随地理来源、季节和栽培条件显著变化，实际值可能远低于该最大值——本研究观察到的正是这种情况。如预期，两种海藻的脂质含量均较低，与海藻典型生化特征一致。碳水化合物组成方面，褐藻F. vesiculosus由葡聚糖（10%）、岩藻聚糖（10%）、甘露醇（8%）、糖醛酸（6%）和木聚糖（5%）组成。相比之下，红藻P. palmata富含木聚糖（47%），葡聚糖含量低（5%）。这些差异反映了与海藻分类学相关的多糖组成差异。褐藻通常含有海带多糖、甘露醇、藻酸盐（糖醛酸聚合物）和岩藻聚糖（富含岩藻糖的复杂多糖，也可能包含半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸）。而大多数红藻主要由红藻淀粉、纤维素、甘露聚糖和琼脂（由吡喃半乳糖和半乳糖组成）构成。然而，Palmariaceae科的进化创新导致木聚糖成为P. palmata等物种细胞壁的主要结构多糖。尽管已知海藻组成受季节性、环境条件、地理来源等因素影响而存在变异性，本研究的灰分、蛋白质、脂质和碳水化合物值与F. vesiculosus和P. palmata的报道范围一致。Nova等报道P. palmata的灰分27%、蛋白质42%、脂质0.3%，F. vesiculosus分别为30%、12%和3%。Dussan等报道的值更接近本研究，他们发现P. palmata的蛋白质含量为10%–16%，灰分为13%–27%。两种未洗涤海藻均富含关键常量元素，特别是钠和钾（表2）。Palmaria palmata的钠含量较高，而F. vesiculosus的钾和钙更丰富。微量元素中，铁和锰在F. vesiculosus中更丰富，而铅和锌在两种海藻中含量相当。Dussan等确定钾（49 g·kg⁻¹）和钠（33 g·kg⁻¹）是P. palmata中最丰富的两种常量元素。Lafeuille等报道P. palmata的矿物组成（I、K、Na、Ca、Mg、Fe）随收获期不同有1.6倍至12.6倍的变异，但钾（34–92 g·kg⁻¹）和钠（13–26 g·kg⁻¹）始终是主导元素。对于F. vesiculosus，Obluchinskaya等和Mæhre等的研究未定量钾和钠含量，但报道了相近浓度的钙（9.8–18 g·kg⁻¹）和镁（7.4–11.5 g·kg⁻¹）。据Obluchinskaya等报道，F. vesiculosus的元素浓度随地理位置和繁殖阶段表现出显著变异性。未洗涤海藻的高盐含量——源于海水盐度以及细胞壁对K⁺和Na⁺离子的优先吸收——可能干扰微生物发酵过程。渗透胁迫，特别是NaCl诱导的胁迫，已被证明影响Y. lipolytica形态，通常导致细胞更小更圆。Tzirita等报道培养基中添加NaCl对Y. lipolytica生物量产量、底物同化和脂质积累产生负面影响。考虑到NaCl对Y. lipolytica代谢的影响，P. palmata也被洗涤以降低钠含量，评估较低盐度海藻水解液对Y. lipolytica生物量和生物制品生产的影响。该洗涤步骤有效降低了灰分含量（表1）和常量及微量元素浓度（表2）。洗涤P. palmata中较高的蛋白质和碳含量反映了相对浓缩效应——灰分的去除增加了剩余成分的比例。Fernandes等洗涤Ulva rigida，实现了盐含量降低4.6倍、灰分降低1.2倍，以研究脱盐对Aspergillus ibericus生长和产酶的影响。此外，洗涤后蛋白质、碳和葡聚糖含量也增加。Novoa-Garrido等也报道洗涤后Porphyra umbilicalis的灰分含量降低1.4倍，而氮含量略有增加。P. palmata水解液的纳滤成功去除了64%–78%的K⁺和Na⁺以及44%–59%的Ca²⁺，减轻了对Clostridium beijerinckii发酵的抑制作用。
【数据】蛋白质倍数差异：1.9倍；F. vesiculosus组成：葡聚糖10%、岩藻聚糖10%、甘露醇8%、糖醛酸6%、木聚糖5%；P. palmata组成：木聚糖47%、葡聚糖5%；P. palmata蛋白范围（文献）：10%–16%；灰分（文献）：13%–27%；K（文献）：49 g·kg⁻¹；Na（文献）：33 g·kg⁻¹；Ca（文献）：9.8–18 g·kg⁻¹；Mg（文献）：7.4–11.5 g·kg⁻¹；纳滤去除率：K⁺/Na⁺ 64%–78%、Ca²⁺ 44%–59%
3.2 水热预处理与酶解
由于不含木质素，海藻生物质可以在比木质纤维素材料更温和的条件下预处理，能耗更低。F. vesiculosus（未洗涤）和P. palmata（未洗涤和洗涤）的高压灭菌器水热预处理在121 °C、30 min下进行，对应严重度因子2.26。用Cellic CTec3对预处理海藻进行酶解后，P. palmata水解液（PH）由83 g·L⁻¹总糖（木糖和葡萄糖分别占84%和16%）和甲酸组成（表3）。该组成对应葡聚糖糖化率100%、木聚糖糖化率76%。预处理洗涤P. palmata的酶解产生的水解液（WPH）具有相似的葡萄糖和木糖浓度，但甲酸浓度低（表3）。PH和WPH中未检测到葡寡糖和木寡糖。由于F. vesiculosus的碳水化合物组成更复杂，其水解液（FH）的组分多样性更高：28 g·L⁻¹糖和糖醇（除葡萄糖和木糖外，还有0.8 g·L⁻¹岩藻糖和15 g·L⁻¹甘露醇）、13 g·L⁻¹糖醛酸（葡萄糖醛酸）和2 g·L⁻¹有机酸（甲酸和0.5 g·L⁻¹乙酸）（表3）。如预期，FH的总糖浓度低于PH，这是因为F. vesiculosus的碳水化合物含量较低。尽管F. vesiculosus的酶解时间（96 h）比P. palmata（48 h）更长——因其碳水化合物组成更复杂——FH的寡糖浓度仍高于PH（2 g·L⁻¹葡寡糖、4 g·L⁻¹木寡糖和14 g·L⁻¹岩藻寡糖），表明预处理F. vesiculosus的水解不完全。粗F. vesiculosus中所有甘露醇和葡萄糖醛酸均在水解液中回收。然而，葡聚糖、木聚糖和岩藻聚糖的糖化不完全，转化率未达到完全水解。
【数据】预处理严重度因子：2.26；PH总糖：83 g·L⁻¹（木糖84%、葡萄糖16%）；糖化率：葡聚糖100%、木聚糖76%；FH组成：糖/糖醇28 g·L⁻¹（岩藻糖0.8 g·L⁻¹、甘露醇15 g·L⁻¹）、糖醛酸13 g·L⁻¹、有机酸2 g·L⁻¹（乙酸0.5 g·L⁻¹）；FH寡糖：葡寡糖2 g·L⁻¹、木寡糖4 g·L⁻¹、岩藻寡糖14 g·L⁻¹
讨论与解读
3.5 综合讨论
结果表明，P. palmata和F. vesiculosus水解液是Y. lipolytica NCYC 2904生物量生产的合适底物。这是首次报道野生型Y. lipolytica菌株消耗葡萄糖醛酸和岩藻糖。此外，研究发现Y. lipolytica NCYC 2904具有消耗大量木糖（约60 g·L⁻¹）的显著能力，且摄取速率高于葡萄糖——此特性此前从未报道。这些发现标志着对Y. lipolytica代谢多功能性及其利用海藻来源底物的生物技术应用潜力的认识取得了重要进展。每种水解液的组成显著影响了Y. lipolytica产生的代谢产物。P. palmata水解液有利于赤藓糖醇生产。Y. lipolytica生产赤藓糖醇的常用底物包括葡萄糖、果糖和甘油，木糖的利用仍未被探索。然而，Y. lipolytica基因组包含编码木糖代谢所需三种关键酶的基因：木糖还原酶（利用NADPH将D-木糖转化为木糖醇）、木糖醇脱氢酶（将木糖醇转化为D-木酮糖，产生NADH）和木酮糖激酶（利用ATP将D-木酮糖转化为D-木酮糖-5-磷酸）。D-木酮糖-5-磷酸是磷酸戊糖途径（PPP）的关键中间体，而PPP是赤藓糖醇生物合成的中心代谢途径。
编译者解读
本研究在合成生物学应用层面有两点突出价值：一是首次报道野生型解脂耶氏酵母可同化岩藻糖和葡萄糖醛酸，拓展了该工业菌株的底物谱系认知；二是发现木糖摄取速率高于葡萄糖这一反直觉现象，为利用海藻来源混合糖发酵产赤藓糖醇提供了全新代谢基础。方法上采用温和水热预处理与商业酶解组合，规避了木质纤维素预处理的高能耗瓶颈，贴合海藻生物质特性。局限在于未对木糖高摄取与赤藓糖醇合成的代谢调控机制进行分子层面解析，且赤藓糖醇产量（40 g·L⁻¹）与纯糖发酵相比仍有提升空间。未来若结合代谢工程强化PPP通量，有望进一步提高海藻水解液的转化效率。
参考来源
Dias B. Use of Palmaria palmata and Fucus vesiculosus hydrolysates for Yarrowia lipolytica biomass and erythritol production. Algal Research, 2026. DOI: 10.1016/j.algal.2026.104610
DOI: 10.1016/j.algal.2026.104610