来源：Pretreated sugarcane bagasse matches performance of synthetic media for lipid production with Yarrowia lipolytica（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
微生物油脂生产是替代化石来源油脂的重要途径，但工程菌株的性能通常在实验室合成培养基中评估，与工业化可扩展的木质纤维素原料之间存在转化鸿沟。本研究以甘蔗渣经两步酸催化甘油预处理获得的三种分级组分（富葡萄糖、富木糖、富甘油）为培养基，系统比较了解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）野生型及木糖利用工程菌株的生长与油脂积累性能。结果显示，甘蔗渣来源培养基在不添加额外碳源、维生素或金属元素的条件下，其发酵表现等同或优于合成培养基，为合成生物学成果从实验室向工业放大提供了低成本、高保真的培养基方案。
研究背景
微生物油脂生产相比化石资源具有更低的环境影响，且不与传统农业油脂产生资源竞争。解脂耶氏酵母因其高细胞密度生长、宽泛pH和温度适应性、可利用低成本底物以及美国FDA授予的GRAS（一般认为安全）地位，成为发酵产油的首选微生物。该菌可积累超过细胞干重30%的脂质，工程菌株甚至可达60–80%。脂肪生成受氮限制调控：氮饥饿触发AMP分解代谢，抑制异柠檬酸脱氢酶（IDH）的别构激活，导致柠檬酸过量积累，进而支持乙酰-CoA合成和脂肪生成（图1）。然而，绝大多数工程菌株的性能评估局限于实验室级合成培养基，其在实际木质纤维素水解液中的表现尚不清楚。
研究方法
2.1 化学品与培养基
本研究所用化学品除另有说明外均购自Merck公司。富培养基采用常规酵母-蛋白胨-葡萄糖培养基（YPD：10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L D-葡萄糖），并设置以等质量木糖（YPX）或甘油（YPG）替代葡萄糖的变体。氮限制合成培养基由1.7 g/L酵母氮源基础（不含氨基酸和硫酸铵）、20 g/L指定碳源（葡萄糖，YNB-D；木糖，YNB-X；甘油，YNB-G）及氯化铵组成，通过调节氯化铵添加量实现文中所述的目标摩尔碳氮比（C/N比，即主要碳源中碳原子摩尔数与氮原子摩尔数之比）。三种甘蔗渣预处理分级组分经稀释以将主要碳源浓度归一化至20 g/L（葡萄糖，BP-D；木糖，BP-X；甘油，BP-G）。所有培养基均含0.1 M磷酸盐缓冲液（pH按文中所述调节），并添加氯化铵以达到目标C/N比。富培养基和合成培养基在添加碳源前经高压灭菌，糖和甘油储备液及甘蔗渣水解液分级组分经0.22 μm滤膜过滤灭菌。
【数据】YPD配方：10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L D-葡萄糖；YNB基础：1.7 g/L；碳源浓度：20 g/L；磷酸盐缓冲液：0.1 M；灭菌方式：高压灭菌（富/合成培养基）或0.22 μm过滤（糖/甘油储备液及水解液）
2.2 微生物菌株与遗传材料
本研究使用野生型解脂耶氏酵母W29菌株（ATCC 20460）。木糖代谢菌株（W29Xyl）通过将编码天然木糖利用途径的整合型质粒（受强生长相关天然启动子控制）转化至W29菌株获得（质粒SZ_EC_02，Jens Nielsen惠赠，Addgene质粒#155,341）。CRISPR-Cas9介导的SZ_EC_02质粒整合采用EasyCloneYALI工具箱，按试剂盒附带方案操作（EasyCloneYALI-CRISPR/Cas9套装，Irina Borodina惠赠，Addgene Kit #1000000141）。简要流程如下：首先将Cas9整合至KU70位点以最大限度降低非同源末端连接介导的双链断裂修复频率，从而促进同源重组事件的成功筛选。该菌株（W29 KU70::Cas9-DsdA）随后与SZ_EC_02质粒及靶向Cas9核酸酶至IntC_3位点的单向导RNA表达载体（pCfB6630）共转化。pCfB6630为Irina Borodina惠赠（Addgene质粒#106,160）。新菌株W29Xyl在含350 mg/L诺尔丝菌素的YPD平板上筛选。挑取24个菌落接种至24孔板中1 mL无氮限制的YNB-X培养基中，到达指数期后转接至1 mL新鲜YNB-X培养基，重复传代七次以筛选能以木糖为唯一碳源稳定可重复生长的最佳克隆。基因组整合通过菌落PCR确认，DNA预先用Zymolyase提取：细胞在PBS缓冲液中用200 U Zymolyase于37°C消化1小时，随后95°C热激5分钟变性。消化产物用100 μl无核酸酶水稀释，取1 μl混合物作为PCR扩增模板。所用DNA构建体和引物详见补充材料。
【数据】诺尔丝菌素筛选浓度：350 mg/L；Zymolyase用量：200 U；消化条件：37°C、1 h；热激：95°C、5 min；传代次数：7次
2.3 甘蔗渣水解与分级
甘蔗渣（40 kg）采自澳大利亚昆士兰州Mackay的Racecourse糖厂，采用两步酸催化甘油法进行预处理。第一步稀酸预处理在130°C下进行15 min，硫酸浓度为基于干生物量的2.4 wt%，液固比为1:5。随后混合物通过原位压滤分离为液体和固体组分。收集富木糖预处理组分，固体残渣在第二步酸催化甘油预处理前经两次130°C、每次5 min的水洗。第二步AG预处理中，取湿固体残渣第三组分（6.6 kg）与甘油和硫酸混合，考虑水分后保持固液比1:5，硫酸浓度基于甘蔗渣初始重量维持在2.4 wt%。混合物在水平反应器中于130°C孵育15 min。反应后液体和固体再次通过原位压滤分离，收集富甘油水解液滤液组分，富纤维素固体残渣收集用于后续酶解糖化。酶解使用Accellerase 1500酶混合物（Danisco US Inc.，美国），在50°C旋转培养箱中进行，葡聚糖浓度为3%，缓冲液为0.05 M柠檬酸盐缓冲液（pH 4.8）。酶载量设为每克葡聚糖20 FPU，混合物在150 rpm振荡速度下孵育72 h。最后过滤收集富葡萄糖水解液组分。糖类使用配备示差折光检测器（Waters 2414，美国）和Aminex HPX-87P色谱柱（300 mm × 7.8 mm，Bio-Rad，CA，美国）的Waters HPLC系统测定。柱温85°C，流动相为水，流速0.5 mL/min。预处理/酶解液中的呋喃类（糠醛和5-羟甲基糠醛[HMF]）和有机酸采用配备示差折光检测器（Waters 2414）和PDA检测器（Waters 2998）的Waters HPLC系统分析。两根Aminex HPX-87H色谱柱（300 mm × 7.8 mm，Bio-Rad，CA，美国）依次维持在35°C和85°C，流动相为5 mM硫酸，流速0.5 mL/min。
【数据】甘蔗渣总量：40 kg；稀酸预处理：130°C、15 min、2.4 wt% H₂SO₄、液固比1:5；水洗：130°C、5 min×2；AG预处理：130°C、15 min、2.4 wt% H₂SO₄、固液比1:5；酶解：50°C、3%葡聚糖、0.05 M柠檬酸盐缓冲液（pH 4.8）、20 FPU/g葡聚糖、72 h、150 rpm；HPLC柱温：HPX-87P 85°C、HPX-87H 35°C/85°C；流动相流速：0.5 mL/min
2.4 微生物培养条件
所有培养均设至少三个生物学重复。小规模（1 mL）批次发酵在24孔板中进行，板孔用透气膜密封，于28°C、600 rpm振荡速度和高力设置在Varioskan Lux多功能酶标仪中培养，每30 min测量600 nm处吸光度（OD600 nm）作为光密度。培养物从28°C、10 mL YPD中指数期生长的预培养物接种至初始OD600 nm为0.05。摇瓶发酵中，预培养物在50 mL YPD中、28°C、160 rpm振荡的250 mL挡板瓶中培养。指数期培养物转移至500 mL挡板瓶中的110 mL培养基中，接种至初始OD600 nm为0.05。培养物在28°C、160 rpm振荡下培养7天。每天取1 mL样品测定生长、脂质积累以及葡萄糖、甘油、木糖、半乳糖、阿拉伯糖和总氮的消耗。7天后收获细胞并干燥测定细胞干重（DCW）。
【数据】培养温度：28°C；微孔板振荡：600 rpm；摇瓶振荡：160 rpm；初始OD600 nm：0.05；培养时间：7天；取样量：1 mL/天；预培养体积：10 mL（微孔板）/50 mL（摇瓶）；发酵体积：110 mL
2.5 Nile Red荧光筛选脂质积累
培养过程中的脂质积累在取样后立即采用改良的Nile Red荧光筛选法检测。Nile Red染料完全溶解于二甲基亚砜中制备1.0 mM储备液。培养样品稀释至OD600 nm为0.05，加入1 mL含1 μM Nile Red的磷酸盐缓冲液（PBS）中，室温避光孵育15 min。细胞通过离心（10 min，875 g）沉淀，洗涤一次，重悬于1 mL PBS中。
【数据】Nile Red储备液浓度：1.0 mM；染色浓度：1 μM；孵育：室温、避光、15 min；离心：875 g、10 min
研究结果
3.1 解脂耶氏酵母在合成培养基与甘蔗渣预处理培养基中的生长特征
适合工业化放大的木质纤维素发酵培养基应源自具有国际意义的农业残留物（此处为甘蔗渣），且性能应与合成培养基相当，理想情况下无需额外补充碳源或维生素。本研究比较了解脂耶氏酵母在富培养基、氮限制合成培养基以及分别富含葡萄糖、木糖或甘油的甘蔗渣预处理分级组分培养基中的生长和脂质积累。具备木糖利用能力的W29Xyl变体通过基因组整合第二拷贝的木糖氧化还原酶途径获得，该途径经木糖醇和木酮糖中间体将木糖转化为木酮糖-5-磷酸，由强组成型启动子控制表达。
利用氮限制合成培养基的初步实验确定了每种培养基组成的C/N比和起始pH。批次培养中C/N比为30（即30 mol葡萄糖、木糖或甘油中的碳对应1 mol氯化铵中的氮）时，可获得足够分析用生物量，同时通过氮饥饿激活脂肪生成。三种主要碳源的脂质积累最适pH各不相同（葡萄糖为pH 5.8，木糖为pH 6.8，甘油为pH 7.8）。低pH条件在解脂耶氏酵母发酵中较为典型，但该菌株的宽pH耐受性已被广泛认可，碱性条件下高产也有报道。pH对脂肪生成的影响尚未在多种碳源下系统研究过，针对任何特定培养基和发酵产物优化pH是重要考量因素。发酵pH变化可产生多效性效应，改变形态、碳源摄取、氧需求和胞内碳通量。
甘蔗渣水解液分级组分经定量后稀释，将葡萄糖、木糖或甘油浓度归一化至20 g/L。向水解液组分和甘油残渣中添加氮源（氯化铵）和磷酸盐缓冲液配制甘蔗渣预处理培养基（BP-），配制后重新定量培养基组成。BP-培养基中未添加额外碳源、维生素或金属元素，这与先前在木质纤维素水解液中培养解脂耶氏酵母的尝试不同。除水解液组分中的三种主要碳源外，半乳糖和阿拉伯糖约占富木糖甘蔗渣预处理培养基中可发酵糖的10%。阿拉伯糖据报道可抑制木糖摄取，可能因竞争木糖转运蛋白而减缓木糖代谢速率。
野生型W29和木糖消耗型W29Xyl在富培养基（YP+葡萄糖、木糖或甘油；YPD、YPX、YPG）、氮限制合成培养基（YNB-D、YNB-X、YNB-G）和甘蔗渣预处理分级组分培养基（BP-D、BP-X、BP-G）中的生长和脂质积累特征如图2所示。W29Xyl在所有含木糖培养基中积累的生物量均高于W29（W29与W29Xyl最大OD600 nm的配对t检验比较：YPX、YNB-X和BP-X培养基中p < 0.005；BP-D中p < 0.05）。然而，W29Xyl在以木糖为唯一碳源的YNB-X中生长时，其生物量积累与YNB-D和YNB-G相比表现较差。YNB-X中的生长不良可归因于木糖同化第一步（木糖到木糖醇）的额外NADPH需求，以及通过非氧化磷酸戊糖途径同化木酮糖-5-磷酸所需的核糖-5-磷酸。在缺乏葡萄糖的情况下，核糖-5-磷酸必须通过磷酸己糖变位酶和氧化磷酸戊糖途径从果糖-6-磷酸再生，这使得木糖为唯一碳源时的生长承受了可观的能量和碳成本。YNB-X中观察到的生长代价在BP-X培养基中得到缓解——其中微量葡萄糖（1.9 g/L）和甘油（0.7 g/L）的存在支持了75%以上的生物量积累。批次发酵过程中培养基组成的分析证实，BP-X培养基中半乳糖和阿拉伯糖与木糖被共消耗（图3）。木糖为唯一碳源时的生长不良也可以通过修饰磷酸戊糖途径增加辅因子产生和循环，或通过适应性实验室进化来补救。
除YNB-X和BP-X之间的生物量积累差异外，氮限制合成培养基与对应的甘蔗渣预处理培养基之间发酵性能相当（YNB-D与BP-D、YNB-G与BP-G的最大OD600 nm配对t检验无显著差异，p > 0.05）。脂质积累（通过Nile Red荧光筛选推断）在合成培养基和甘蔗渣来源培养基的稳定期增加（图2），伴随氮消耗（图3），富培养基除外——其中氮可用性不受限制。氮饥饿的起始（脂质积累的关键触发因素）在甘蔗渣来源培养基（BP-）中相对于等效合成培养基（YNB-）未出现延迟。
【数据】C/N比：30；最适pH：葡萄糖5.8、木糖6.8、甘油7.8；BP-X中葡萄糖：1.9 g/L、甘油：0.7 g/L、生物量提升：75%；W29Xyl vs W29最大OD600 nm：YPX/YNB-X/BP-X中p < 0.005，BP-D中p < 0.05；YNB-D vs BP-D、YNB-G vs BP-G最大OD600 nm：p > 0.05
3.2 甘蔗渣水解液培养基中有机酸和生长抑制物分析
木质纤维素生物质水解液通常含有有机酸、呋喃类和酚类化合物的复杂混合物，可能抑制微生物发酵。了解抑制性化合物的存在和影响对于评估甘蔗渣来源发酵培养基的实用性至关重要。甘蔗渣来源培养基中常见抑制物和有机酸在发酵前后进行了测定（表2）。检测到的有机酸和呋喃类包括甲酸、乙酸和5-羟甲基糠醛（5-HMF）。此前使用合成培养基的研究确定，甲酸、乙酸和5-HMF分别在大于0.9 g/L、2.3 g/L和0.4 g/L浓度时延长解脂耶氏酵母发酵的延迟期，更高浓度可完全抑制生长。这些化合物在甘蔗渣来源培养基中均低于抑制浓度，唯BP-X培养基中的乙酸（4.2 g/L）例外。乙酸盐可通过乙醛酸循环被解脂耶氏酵母同化，本研究中W29Xyl在BP-X培养基发酵中乙酸被完全消耗，且相对于YPX富培养基或YNB-X合成培养基的发酵未观察到延迟期延长，表明乙酸盐的任何抑制效应均极小。富木糖BP-X培养基中存在的草酸可能通过抑制异柠檬酸裂解酶、降低乙醛酸支路的代谢通量进一步支持脂肪生成。此前已有研究通过添加草酸（3.6 g/L）触发解脂耶氏酵母发酵中的异柠檬酸积累。柠檬酸也可被解脂耶氏酵母用作碳源，但其摄取受葡萄糖阻遏调控。
【数据】甲酸抑制阈值：0.9 g/L；乙酸抑制阈值：2.3 g/L；5-HMF抑制阈值：0.4 g/L；BP-X中乙酸浓度：4.2 g/L（发酵中被完全消耗）；草酸参考添加量：3.6 g/L
讨论与解读
两步酸催化甘油预处理甘蔗渣制备的发酵培养基，在解脂耶氏酵母脂质生产中表现出与实验室级合成培养基等同或更优的性能。培养基仅补充氯化铵和矿物磷酸盐缓冲液，不添加额外碳源、金属或维生素。所有糖类、甘油和乙酸均被利用，平均每克细胞干重产生0.38 g脂质，未观察到对生长或脂质积累的任何负面影响。这些数据为实验室规模合成生物学与低成本预处理甘蔗渣培养基工艺放大之间的高保真性能复制提供了可行路径。
编译者解读：本研究的关键价值在于直接回应了合成生物学领域的"培养基鸿沟"问题——绝大多数工程菌株的性能数据来自实验室级合成培养基，而工业放大必须面对真实生物质原料的复杂性。作者选择甘蔗渣这一全球性农业残留物，以两步酸催化甘油预处理获取三种碳源分级组分，系统评估了菌株生长、氮消耗、抑制物耐受和脂质积累。值得注意的是，BP-X培养基中微量葡萄糖和甘油对木糖生长的"辅助效应"以及乙酸被完全消耗的现象，提示真实水解液中组分间存在合成培养基难以模拟的交互作用。该方法为工业相关底物的标准化评估提供了可复制的框架，但水解液批次间的组分波动对发酵稳定性的影响仍需进一步考察。
参考来源
Peralta, F. T. (2024). Pretreated sugarcane bagasse matches performance of synthetic media for lipid production with Yarrowia lipolytica. Bioresource Technology. DOI: 10.1016/j.biortech.2024.131558
DOI: 10.1016/j.biortech.2024.131558