来源：Engineering and evolution of Yarrowia lipolytica for producing lipids from lignocellulosic hydrolysates（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）因强大的乙酰-CoA通量和成熟的遗传工具而备受工业发酵青睐，但其缺乏活跃的木糖代谢途径，限制了纤维素糖的利用。本研究通过代谢工程与适应性实验室进化（ALE）相结合，构建出高效木糖同化菌株XEV。全基因组测序与反向工程揭示，异源氧化还原途径的扩增及GTP酶激活蛋白基因（YALI0B12100g）的点突变是木糖同化提升的主因。以高粱水解液为底物时，XEV菌株的木糖消耗与脂质产量均显著优于亲本菌株。
研究背景
解脂耶氏酵母属于半子囊菌家族，因有别于酿酒酵母的独特性质被归为"非常规酵母"。它可利用正烷烃、脂肪和油脂等多种底物，并偏好呼吸代谢而非发酵代谢，不表现Crabtree效应，具有较高的NADH和ATP产率。这种独特的代谢流分布使其成为三羧酸循环中间产物（琥珀酸、α-酮戊二酸、柠檬酸）的优良生产菌株。作为产油酵母，解脂耶氏酵母天然积累超过细胞生物量20%的脂质，且可通过基因工程进一步提高。然而，缺乏活跃的木糖代谢途径成为其转化纤维素糖为高价值产物的主要瓶颈。本研究旨在通过代谢工程和ALE策略打破这一限制。
研究方法
2.1 菌株与质粒构建
大肠杆菌TOP10（New England BioLabs，美国马萨诸塞州伊普斯威奇）用于常规克隆和质粒繁殖。E. coli TOP10细胞在添加100 µg/mL氨苄青霉素或适当抗生素的LB培养基中，于250 rpm、37°C条件下培养筛选。解脂耶氏酵母PO1f菌株（亮氨酸和尿嘧啶营养缺陷型）作为工程改造的亲本酵母菌株。含有可选择亮氨酸标记的整合质粒pINT03用于构建携带氧化还原途径基因的表达盒，如前人Lane等（2015）所述。具体而言，来自树干毕赤酵母（P. stipitis）的木糖代谢途径基因XYL1、XYL2和XYL3经密码子优化以适应解脂耶氏酵母，并分别在GPM1、TDH1和FBA1启动子控制下通过Gibson组装导入pINT03，生成质粒pINT03-X123。将pINT03转化至PO1f菌株获得对照菌株以保证公平比较；将pINT03-XYL123转化至PO1f菌株则生成X123菌株。X123菌株在含木糖的YP培养基（20 g/L木糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物）中进行基于连续传代的ALE，最终分离获得XEV菌株。所得工程菌株（X123和XEV）及对照菌株随后用于发酵和全基因组测序（WGS）分析。质粒构建所用引物信息见Table S1。
【数据】菌株：E. coli TOP10、Y. lipolytica PO1f；抗生素：100 µg/mL氨苄青霉素；温度：37°C（E. coli）、28°C（酵母）；转速：250 rpm（E. coli）；培养基：LB、YP（20 g/L木糖、20 g/L蛋白胨、10 g/L酵母提取物）
2.2 培养基与培养条件
为评估解脂耶氏酵母菌株利用木糖的能力，将冻存酵母先接种于添加20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖和10 g/L酵母提取物的丰富培养基（YPD）中。YPD培养的细胞随后转移至20 mL YSC培养基中，该培养基含20 g/L或40 g/L木糖、0.79 g/L缺失亮氨酸的完全补充混合物（CSM-Leu）和1.7 g/L不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮源基础（YNB）。为促进脂质积累，使用浓缩木糖和硫酸铵溶液将C/N比维持在100:1，在40 g/L木糖的YSC培养基中硫酸铵终浓度为0.75 g/L。为进一步评估亲本和工程菌株利用纤维素水解液的能力，制备了高粱水解液。高粱水解液由生物能源高粱秸秆经水热预处理和盘磨处理，再经酶解释放纤维素糖而制得，详细制备流程见Cheng等（2019）。水解液随后补充硫酸铵至终浓度0.82 g/L以提供氮源，并经0.2 μm过滤装置（Thermo Scientific）过滤以预防污染并去除残余固体。过滤灭菌的水解液于−20°C冷冻保存备用，发酵前于4°C解冻一天。所有发酵步骤均设三次重复，在200 rpm、28°C条件下持续振荡。
【数据】培养基：YPD（20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖、10 g/L酵母提取物）、YSC（20或40 g/L木糖、0.79 g/L CSM-Leu、1.7 g/L YNB）；C/N比：100:1；硫酸铵：0.75 g/L（YSC）、0.82 g/L（水解液）；温度：28°C；转速：200 rpm；过滤孔径：0.2 μm
2.3 分析方法
细胞密度通过紫外-可见分光光度计（Biomate 5；Fisher，美国纽约州）在600 nm波长下测定光密度（OD600）来量化。细胞干重（DCW）通过去离子水洗涤细胞三次并于100°C干燥过夜测定。采用配备Rezex ROA-Organic Acid H+（8%）色谱柱（Phenomenex Inc.）的高效液相色谱仪（HPLC）（Agilent，美国加州圣克拉拉）测定糖（葡萄糖和木糖）及其他代谢物浓度。色谱柱和检测器温度保持在50°C，流动相为0.005 M硫酸，流速0.6 mL/min。总胞内脂质采用改良方法提取（Bligh & Dyer, 1959; Bourque & Titorenko, 2009; Yook et al., 2019）。简要流程如下：收集3–5 mL含酵母细胞的培养液，离心去除上清液，剩余细胞于−20°C保存待进一步分析。冷冻细胞于室温解冻，与有机溶剂混合物（氯仿与甲醇，2:1）剧烈混匀。加入等体积水使甲醇相分离，将氯仿相和甲醇相均转移至新收集瓶。向剩余细胞中再加入3 mL氯仿进行额外提取，确保脂质完全提取。含脂质提取物的溶剂混合物（氯仿相）通过3000 rpm离心15 min与水相（甲醇相）分离，仅将氯仿相转移至新瓶。含总脂质的氯仿相使用氮气蒸发系统（Caliper Life Sciences，美国）蒸发，脂质浓度和含量分别以g脂质/mL样品和g脂质/g DCW计算。
【数据】OD600波长：600 nm；DCW干燥：100°C过夜；HPLC柱温/检测器温度：50°C；流动相：0.005 M硫酸，0.6 mL/min；脂质提取：氯仿:甲醇=2:1；离心：3000 rpm，15 min；样品量：3–5 mL培养液
2.4 全基因组测序分析（WGS）
使用Wizard® Genomic DNA Purification Kit（Promega）提取总基因组DNA，随后在每个样品的Illumina Novaseq平台上进行双端150循环（2 × 150 bp）测序。每个样品的读数数量范围为4300万至5300万。在比对到参考基因组之前，使用Trimmomatic工具包（版本0.38）去除测序接头和引物序列。为分析突变菌株的基因组测序数据，采用了适用于酵母基因组的GATK最佳实践工作流程（Van and O'connor, 2020）。该工作流程包括GATK的"用于变异发现的预处理数据"和"种系短变异发现（SNPs + Indels）"流程（可在https://gatk.broadinstitute.org/hc/en-us/sections/360007226651-Best-Practices-Workflows获取）。对解脂耶氏酵母PO1f参考基因组（GenBank登录号：GCA_009372015.1）建立索引，并使用Burrows-Wheeler Aligner（BWA版本0.7.17）（Li & Durbin, 2009）进行短读长比对。根据GATK工作流程指南，使用GATK版本4.1.4.0（McKenna et al., 2010）和SAMtools版本1.11（Li et al., 2009）对比对文件进行变异检测前预处理。使用Genome Analysis Tool Kit（GATK）中的HaplotypeCaller进行变异检测，随后使用VariantFiltration工具（GATK版本4.1.4.0）进行过滤。使用SAMtools版本1.11和CNVKit版本0.9.8分别计算读长覆盖度和读长深度。最后，所有vcf文件使用R包进行功能注释，包括GenomicRanges、Biostrings、Rsamtools、VariantAnnotation和snpStats。使用ggplot2和ggpubr R包进行绘图和数据可视化。本分析所用脚本可在github.com/raogroupuiuc/yl_variantcalling获取。
【数据】测序平台：Illumina Novaseq，2 × 150 bp双端；读长数量：43–53百万/样品；参考基因组：GCA_009372015.1；软件版本：Trimmomatic 0.38、BWA 0.7.17、GATK 4.1.4.0、SAMtools 1.11、CNVKit 0.9.8
2.5 酶活测定
XR和XDH的酶活采用基于Lee等（2012）所述方案的测定方法。粗酶制备：1 mL解脂耶氏酵母细胞在YPD培养基中培养，室温下6000 rpm离心收集。用50 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.0）重悬沉淀后，使用珠磨破碎仪（Fastprep-24，MP Bio）进行细胞破碎，加入0.2 g珠子涡旋3个循环，每个循环后冰上冷却4 min。4°C、15,000 rpm离心后，含粗酶的上清液用于测定。XR测定：将0.4 mM NADPH、50 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.0）和200 mM木糖的混合物与提取的粗酶混合。XDH测定：将50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 8.5）、300 mM木糖醇、50 mM MgCl2和2 mM NAD+与粗酶混合。所有试剂均新鲜配制，反应前立即混合。
【数据】XR测定：0.4 mM NADPH、50 mM磷酸钾缓冲液（pH 6.0）、200 mM木糖；XDH测定：50 mM Tris-HCl（pH 8.5）、300 mM木糖醇、50 mM MgCl2、2 mM NAD+；破碎：0.2 g珠子，3个循环；离心：6000 rpm（室温）、15,000 rpm（4°C）
研究结果
3.1 异源氧化还原途径的引入与ALE
为增强解脂耶氏酵母的木糖同化能力，通过将来自树干毕赤酵母的氧化还原途径引入PO1f菌株，构建了木糖利用菌株X123。为进一步提高木糖同化能力，X123菌株在木糖条件下经历了适应性实验室进化（ALE）过程。在450小时的ALE过程中，PO1f菌株的木糖消耗可忽略不计，而X123菌株表现出木糖消耗的逐步改善，在第4轮连续传代后112小时内完全消耗了40 g/L的木糖（图S1）。经过六轮连续传代后，分离单菌落并进行木糖消耗测试。选择木糖代谢效率最高的菌株XEV用于后续研究。此外，为评估氧化还原途径的成功引入及ALE后氧化还原平衡的变化，测定了胞内NAD+/NADH和NADP+/NADPH比率。当以葡萄糖为碳源时，PO1f、X123和XEV菌株之间的NAD+/NADH和NADP+/NADPH比率无显著差异（图S2）。然而，当以木糖为碳源时，X123和XEV菌株的NAD+/NADH比率均显著低于葡萄糖发酵期间的水平，而NADP+/NADPH比率则显著升高。这些结果表明，尽管氧化还原途径已成功引入，但在工程化的解脂耶氏酵母菌株中，木糖利用过程中的辅因子不平衡即使在ALE后仍然存在。
为验证工程菌株的木糖同化和脂质生产能力，在氮限制的合成最小培养基（YSC）中以40 g/L木糖为唯一碳源进行木糖发酵。解脂耶氏酵母缺乏活跃的木糖同化酶，因此亲本菌株PO1f无法在木糖培养基中生长（图1a-b）。然而，引入异源氧化还原途径后，X123菌株能够在木糖上生长，在消耗所提供木糖的一半（20 g/L）后，160小时时细胞密度达到OD600 = 10.6。通过X123菌株ALE获得的XEV菌株显示出显著增强的生长和木糖利用能力，在完全消耗40 g/L木糖后，112小时时达到最高细胞密度OD600 = 14.1。然而，在较高木糖浓度（100 g/L）下，XEV菌株在最小培养基中140小时内仅消耗50 g/L木糖，表现出有限的木糖消耗能力（图S3a）。相比之下，在平行实验中使用丰富培养基（YPX）时，XEV菌株在100小时内完全消耗了80 g/L木糖（图S3b）。这种差异可能归因于最小培养基中营养物质和生长因子的有限可用性。然而，丰富培养基中的高氮含量不利于控制脂质最佳积累所需的C/N比。因此，本研究使用C/N比调整为100的YSC最小培养基以诱导菌株脂质合成。
当测定PO1f、X123和XEV菌株的总脂质含量和滴度时，XEV菌株在90小时时表现出最高的脂质浓度和含量，分别为2.47 g脂质/L和34.92%（g脂质/g细胞×100）（图1c）。X123菌株在90小时时仅积累0.4 g脂质/L和25%（g脂质/g细胞×100）。值得注意的是，这一结果与先前发现一致，即引入氧化还原途径的菌株在氮限制条件下可合成超过20%的胞内脂质（Rodriguez et al., 2016; Niehus et al., 2018）。尽管PO1f菌株确实表现出极少的脂质积累（如图1c所示），但与X123和XEV菌株在发酵过程中观察到的显著脂质产量相比，这一积累可忽略不计。先前开发的木糖利用菌株的比生长速率、木糖消耗速率和脂质含量的比较分析见表1。这些结果表明，XEV菌株在ALE过程中积累的一些遗传变异可能改善了固有木糖代谢向脂质积累的方向。因此，我们进行了WGS以鉴定XEV菌株中与木糖代谢相关的遗传变异。
【数据】ALE时长：450 h；木糖消耗：X123在4轮传代后112 h内耗尽40 g/L；XEV最高OD600：14.1（112 h）；X123最高OD600：10.6（160 h）；XEV脂质浓度：2.47 g/L（90 h）；XEV脂质含量：34.92%；X123脂质浓度：0.4 g/L（90 h）；X123脂质含量：25%；100 g/L木糖条件：140 h消耗50 g/L；YPX丰富培养基：100 h消耗80 g/L
3.2 XEV中异源氧化还原途径基因的扩增
由于解脂耶氏酵母PO1f的参考基因组可公开获取，将XEV菌株的全基因组测序DNA片段比对到PO1f参考基因组。通过比较参考基因组序列和比对后的DNA片段来鉴定遗传变异。此外，为确定异源氧化还原途径的整合位点，使用SPAdes（Baker, 2012; Pendleton et al., 2015）进行了从头组装。全基因组测序数据用于将原始读长组装成scaffolds（SPAdes版本3.15.5）。随后分析这些scaffolds以定位氧化还原途径两侧的序列，从而确定其整合位点。具体而言，组装了X123菌株的基因组，并从scaffolds创建了本地BLAST+（版本2.13.0）数据库，与氧化还原途径序列进行比对。分析显示，氧化还原途径整合在YALI0C00385g基因下游37 bp处，该基因编码一种假定蛋白（图S4）。然而，鉴于假定蛋白的性质，对木糖代谢的影响可能很小。
通过读长深度分析发现，XEV菌株基因组中导入的表达盒的读长深度比X123菌株高6.75至7.22倍（表2），表明异源氧化还原途径基因在ALE过程中发生了扩增。基因扩增在自然进化和ALE中都是记录充分的现象，选择压力可导致有利基因拷贝数增加，在特定条件下提供竞争性生长优势（Demeke et al., 2015; dos Santos et al., 2016; Oh et al., 2016）。在本研究中，ALE期间的选择压力旨在增强木糖同化，这可能驱动了氧化还原途径基因的扩增。基因拷贝数的增加可能导致关键酶（如XR、XDH和XK）的表达水平升高，这些酶对高效木糖代谢至关重要。
为验证异源氧化还原途径基因确实发生扩增的假设，我们从木糖利用突变株（X123和XEV）和对照菌株（PO1f）中提取粗酶，测定了XR和XDH的活性。结果显示，XEV菌株的XR和XDH活性分别比X123菌株高5.64倍和3.36倍（图2a）。然而，由于解脂耶氏酵母含有内源氧化还原途径基因（ylXR: YALI0D07634g，ylXDH: YALI0E12463g，ylXK: YALI0F10923g），尽管这些基因的活性不高，因此尚不能断定这些增强的酶活源于异源基因的扩增。在ALE过程中，相应内源基因的表达可能增加而异源基因未增加。为验证这一推测，我们通过qPCR比较了基因表达水平，以确定增强的酶活来自内源基因还是异源基因（图2b-c）。结果显示，内源基因的表达水平在ALE后略有增加，但倍数变化很小（1.2–2.4倍），而异源基因的表达倍数变化为5.2–8.3倍。这一发现表明，扩增的异源氧化还原途径基因（而非内源基因）可能是XEV菌株木糖同化能力增强的主要原因。
【数据】整合位点：YALI0C00385g下游37 bp；读长深度比：6.75–7.22倍（XEV vs X123）；XR活性比：5.64倍（XEV vs X123）；XDH活性比：3.36倍（XEV vs X123）；内源基因表达变化：1.2–2.4倍；异源基因表达变化：5.2–8.3倍
3.3 反向工程验证关键遗传变异
通过WGS分析鉴定了XEV菌株中多个遗传变异，包括基因扩增和点突变。为确定哪些变异对木糖同化增强起决定性作用，进行了反向工程实验。将鉴定的关键突变逐一导入X123菌株背景中，构建了多个反向工程菌株，包括X123-mt1（仅含YALI0B12100p的S409F点突变）等。发酵结果显示，X123-mt1菌株的木糖消耗速率和比生长速率均高于X123菌株，表明YALI0B12100g基因的S409F点突变对木糖同化有正向贡献。进一步的组合实验表明，将扩增的异源氧化还原途径基因与S409F点突变组合引入时，木糖同化能力的提升最为显著。图3展示了反向工程菌株的发酵特性，包括细胞生长（a）、木糖消耗（b）、比生长速率和木糖消耗速率（c）。t检验用于分析突变株与对照之间的统计差异。
【数据】X123-mt1：含YALI0B12100p S409F突变；统计方法：Student's t检验
3.4 遗传变异对木糖同化的贡献分析
综合上述结果，图4总结了扩增的XR、XDH和XK以及GTP酶激活蛋白（YALI0B12100p，S409F）点突变对XEV菌株木糖同化能力增强的贡献。分析表明，XEV菌株木糖消耗能力的90%来自扩增的氧化还原途径，而S409F点突变进一步提升了木糖同化效率。这一发现阐明了基因扩增和点突变在木糖代谢中的协同作用机制。
【数据】XEV木糖消耗能力来源：90%来自扩增的氧化还原途径
3.5 高粱水解液中的发酵性能
为评估工程菌株在实际木质纤维素水解液中的表现，使用高粱水解液进行了发酵实验。图5a显示了高粱水解液的组成成分。在发酵过程中，XEV菌株表现出优于X123菌株的木糖消耗能力。如图5b所示，XEV菌株的细胞生长（OD600）显著高于X123菌株。葡萄糖消耗方面（图5c），各菌株差异不大，但木糖消耗（图5d）显示XEV菌株具有明显优势。发酵结束后，XEV菌株的生物量显著高于X123菌株（图5e）。在脂质积累方面（图5f），67小时和98小时时XEV菌株的脂质浓度和含量均高于X123菌株。结果表明，在高粱水解液中，XEV菌株展现出优越的木糖消耗和脂质生产能力。
【数据】发酵时间点：67 h、98 h；底物：高粱水解液；指标：OD600、葡萄糖消耗、木糖消耗、生物量、脂质浓度和含量
讨论与解读
本研究通过代谢工程与ALE相结合的策略，成功构建了高效木糖同化菌株XEV。WGS、RT-PCR和酶学分析一致表明，XR、XDH和XK的高活性是高效木糖同化的必要条件，而YALI0B12100g基因的点突变可进一步增强木糖同化能力。利用木质纤维素水解液时，工程进化菌株XEV的脂质产量达到对照的2.3倍，从0.83 g/L提升至1.94 g/L。这些结果加深了对解脂耶氏酵母木糖代谢的理解，为其在工业上转化纤维素糖为高价值产物提供了有效的代谢工程策略。
编译者解读
本研究展示了经典代谢工程与ALE联用的典范——先引入异源途径建立基础能力，再通过定向进化挖掘宿主潜在适应性突变。关键在于将WGS与反向工程闭环验证，精准定位了基因扩增和单点突变两个层面的贡献。基因扩增贡献90%木糖消耗能力的定量分析尤为亮眼，为后续菌株优化提供了明确靶点。高粱水解液验证环节贴近工业实际，2.3倍脂质产量提升（0.83→1.94 g/L）具有应用参考价值。局限在于高浓度木糖（100 g/L）下最小培养基中同化能力受限，提示营养因素与渗透压耐受仍需优化。从合成生物学角度，该研究为产油酵母利用木质纤维素糖建立了一套"设计-构建-进化-解析"的完整范式。
参考来源
Yook S. Engineering and evolution of Yarrowia lipolytica for producing lipids from lignocellulosic hydrolysates. Bioresource Technology, 2025. DOI: 10.1016/j.biortech.2024.131806
DOI: 10.1016/j.biortech.2024.131806