来源：Transcription factor YALI1_A16891g contributes to enhanced glycolytic flux and mevalonate production at elevated temperature in engineered Yarrowia lipolytica（Bioresource Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是萜类化合物生物合成的重要底盘菌株。本研究以工程化甲羟戊酸生产菌株YL17为平台，系统考察了25–32°C温度范围内发酵温度对菌株代谢状态的影响。研究发现，高温（32°C）在抑制细胞生长的同时显著促进了甲羟戊酸合成，13C代谢通量分析揭示高温下碳流重新分配至糖酵解途径，增加乙酰-CoA供给。通过转录组分析与转录因子靶向敲除，鉴定出转录因子YALI1_A16891g是调控高温下糖酵解碳流分配的关键因子，为通过转录因子工程提升前体供给提供了新靶点。
研究背景
解脂耶氏酵母因具有丰富的胞内脂质储存结构、强大的内源乙酰-CoA供给能力以及Crabtree阴性代谢特征，成为萜类化合物及其前体生物合成的理想底盘。其戊糖磷酸途径通量较高，可持续供给NADPH以支撑萜类合成。此外，该菌对疏水化合物耐受性强，在25–32°C及低pH条件下均能稳定生长。然而，发酵温度如何影响胞内代谢状态尚未被充分阐明。既往研究多将温度视为过程优化参数，缺乏对温度-代谢调控机制的深入解析。本研究利用工程化甲羟戊酸生产菌株YL17，系统揭示温度依赖性代谢响应及其调控基础。
研究方法
2.1 菌株与培养基
本研究所用解脂耶氏酵母菌株YL17来自天津工业生物技术研究所，于酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）培养基中培养。YL17以W29 Δku70 Δura3为底盘菌株，通过逐步代谢工程改造以增强甲羟戊酸生产。为促进甲羟戊酸积累并减少其向下游异戊二烯生物合成的消耗，通过启动子替换下调ERG12表达，同时过表达限速酶HMG-CoA还原酶以强化HMG-CoA向甲羟戊酸的转化。在此基础上，通过调控关键上游基因进一步系统强化内源甲羟戊酸途径，包括过表达编码乙酰-CoA乙酰转移酶的ERG10和PAT1，以及编码HMG-CoA合酶的ERG13。为缓解前体供给限制，通过共过表达ATP-柠檬酸裂解酶的两个亚基ACL1和ACL2增强柠檬酸裂解途径，促进胞质柠檬酸向乙酰-CoA的转化。
摇瓶培养和分批发酵使用确定成分的极限培养基，包含20 g/L葡萄糖、7.5 g/L (NH4)2SO4、14.4 g/L KH2PO4、0.5 g/L MgSO4·7H2O、100 mg/L尿嘧啶、1 mL/L痕量金属溶液和1 mL/L维生素溶液，灭菌前将pH调至6.0。痕量金属溶液含3 g/L FeSO4·7H2O、4.5 g/L ZnSO4·7H2O、4.5 g/L CaCl2·2H2O、1 g/L MnCl2·4H2O、0.3 g/L CoCl2·6H2O、0.3 g/L CuSO4·5H2O、0.4 g/L NaMoO4·2H2O、1 g/L H3BO3、0.1 g/L KI和19 g/L Na2EDTA·2H2O。维生素溶液含0.05 g/L d-生物素、1 g/L d-泛酸半钙盐、1 g/L硫胺素-HCl、1 g/L吡哆醇-HCl、1 g/L烟酸、0.2 g/L 4-氨基苯甲酸和25 g/L肌醇。补料分批发酵的补料培养基含500 g/L葡萄糖、37.5 g/L (NH4)2SO4、72 g/L KH2PO4、2.5 g/L MgSO4·7H2O和1 g/L尿嘧啶。
【数据】菌株：YL17（W29 Δku70 Δura3衍生）；培养基：YPD/极限培养基；葡萄糖：20 g/L；pH：6.0；痕量金属：1 mL/L；维生素：1 mL/L
2.2 菌株与质粒构建
解脂耶氏酵母的基因组编辑采用基于EasyCloneYALI工具箱的CRISPR–Cas9系统。以工具箱中的pCfB3405质粒为骨架构建敲除载体。靶标特异性单链引导RNA（sgRNA）序列通过CHOPCHOP在线工具设计，相应sgRNA表达盒经聚合酶链式反应（PCR）生成。随后将sgRNA表达盒克隆至pCfB3405载体，所得质粒经测序验证。基因组修饰时，通过重叠PCR组装包含功能盒两侧同源臂的线性DNA片段。同源臂以W29菌株基因组DNA为模板扩增。纯化后的线性整合片段通过醋酸锂转化法导入感受态细胞。转化子先在含250 mg/L诺尔斯菌素的平板上筛选，随后通过菌落PCR确认正确的基因组整合。为消除编辑质粒，阳性克隆在不含抗生素的YPD液体培养基中传代培养数代。所有验证菌株于-80°C保存备用。本研究所用质粒、sgRNA序列及引物列于补充表S1和S2。
【数据】筛选抗生素：250 mg/L诺尔斯菌素；转化方法：醋酸锂法；编辑系统：CRISPR–Cas9（EasyCloneYALI）；质粒骨架：pCfB3405
2.3 发酵条件
从YPD平板挑取解脂耶氏酵母单菌落，于YPD液体培养基中28°C、220 rpm预培养24小时。预培养细胞随后接种至发酵培养基，在7.5 L生物反应器（Intelli-Ferm Q，T&J Bio-engineering，上海，中国）中分别于25°C、28°C、30°C和32°C进行分批发酵，定期取样测定葡萄糖和甲羟戊酸浓度。此外，为进一步评估温度与甲羟戊酸生物合成的关系，在呼吸活性监测系统（RAMOS，HiTec Zang GmbH，Herzogenrath，德国）摇瓶中进行了25–33°C范围内额外温度的补充发酵实验，摇瓶含40 mL极限培养基，初始OD600为0.2。该条件下仅测定发酵结束时的最终生物量、CO2释放量和甲羟戊酸滴度。
补料分批发酵使用工作体积为2 L的7.5 L生物反应器。新鲜酵母菌落先在含200 mL极限培养基的2 L三角瓶中于28°C、220 rpm培养36小时制备接种物。发酵在分别设定不同温度（25°C、28°C、30°C和32°C）的独立反应器中进行。pH用75%氨水控制在5.5，初始通气速率设为1 vvm（空气体积/培养体积/分钟），搅拌速度为400 rpm。整个发酵过程中通过按需调节搅拌速度和通气速率使溶解氧（DO）水平保持在30%以上。分批阶段结束后，采用指数补料策略（比生长速率0.06 h−1），在氧限制后转为恒速补料（25 g/h）。鉴于脂质代谢在解脂耶氏酵母中的重要作用，在补料阶段后进一步引入12小时的补料后静止期，旨在通过胞内脂质再利用促进产物形成。定期取样测定OD600、葡萄糖和甲羟戊酸浓度。
胞外培养基中的葡萄糖、甲羟戊酸和柠檬酸浓度通过高效液相色谱（HPLC，Thermo Scientific，MA，USA）测定，配备IDEX RefractoMax521检测器（IDEX Corporation，Thermo Scientific，MA，USA），使用Aminex柱（HPX-87H，Bio-Rad，CA，USA），以5 mM H2SO4为流动相，流速0.6 mL/min，柱温维持在50°C。
【数据】预培养：28°C、220 rpm、24 h；分批发酵温度：25/28/30/32°C；反应器：7.5 L；RAMOS补充实验温度范围：25–33°C；初始OD600：0.2；补料分批工作体积：2 L；pH：5.5（75%氨水）；通气：1 vvm；搅拌：400 rpm；DO：>30%；指数补料μ：0.06 h−1；恒速补料：25 g/h；静止期：12 h；HPLC柱温：50°C；流动相：5 mM H2SO4，0.6 mL/min
2.4 发酵动力学参数计算
摄氧率（OUR，mmol/L/h）和CO2释放率（CER，mmol/L/h）根据进出气组成按以下公式计算：
OUR = F_air,in/V × (y_O2,in − y_N2,in/y_N2,out × y_O2,out)
CER = F_air,in/V × (y_N2,in/y_N2,out × y_CO2,out − y_CO2,in)
其中F_air,in为进气流量（mmol/h），V为发酵液工作体积（L）。y_O2,in、y_CO2,in、y_N2,in分别代表进气中O2、CO2和N2的体积分数，y_O2,out、y_CO2,out、y_N2,out为对应排气中的体积分数。
比底物摄取速率（q_s，mmol/gDCW/h）、比产物形成速率（q_p，mmol/gDCW/h）、比CO2释放速率（q_CO2，mmol/gDCW/h）、比生长速率（μ，h−1）及得率（Y_p/s、Y_x/s、Y_co2/s，g/g）按以下公式计算：
q_s = (C_s1V1 − C_s2V2)/((T2−T1)(C_x1+C_x2)/2) × 1000/M_glc
q_p = (C_p2V2 − C_p1V1)/((T2−T1)(C_x1+C_x2)/2) × 1000/M_mev
q_CO2 = CER/C_x
μ = ln(C_x2/C_x1)/(T2−T1)
Y_p/s = m_p/m_s
Y_x/s = m_x/m_s
Y_co2/s = m_co2/m_s
其中T表示时间（h），下标1和2表示两个不同的取样时间点。C_s、C_p、V和C_x分别代表底物浓度（g/L）、产物浓度（g/L）、发酵液体积（L）和干细胞重（g/L）。相应地，C_s1和C_s2、C_p1和C_p2、V1和V2、C_x1和C_x2分别对应T1和T2时刻的测定值。M_glc和M_mev分别为葡萄糖和甲羟戊酸的分子量。m_p、m_s、m_x、m_co2为总产物量、总底物消耗量、总生物量及总CO2释放量。
【数据】OUR/CER计算：基于进出气组成；q_s/q_p：mmol/gDCW/h；μ：h−1；得率：g/g
研究结果
3.1 温度升高将生长-生产平衡转向增强甲羟戊酸合成
为系统评估温度如何重塑解脂耶氏酵母的细胞生理和甲羟戊酸生产，基于前期报道（33°C以上生长严重受损），在四个温度（25°C、28°C、30°C和32°C）下进行了分批发酵。对生长、生产和代谢参数进行了定量分析，以比较评估温度依赖性生理状态（图1）。在测试的培养温度下，观察到明显的温度依赖性生长和生产差异（补充表S3，图1A–D）。
在较低温度（25、28和30°C）下，解脂耶氏酵母表现出较高的比生长速率和底物摄取速率，碳主要分配给生物量形成。尽管比甲羟戊酸形成速率相对较高，但由于CO2释放增加，总体甲羟戊酸得率仍然较低，表明存在大量呼吸性碳损失。相比之下，32°C培养导致生长和底物摄取降低，同时实现最高甲羟戊酸得率，并伴随CO2释放显著减少。为评估该表型是否反映更广泛的温度依赖趋势，在测试温度范围内分析了得率参数。随温度升高，甲羟戊酸得率呈强正相关（R = 0.85，p < 0.001，基于Spearman相关），而生物量得率（R = −0.62，p < 0.01）和CO2得率（R = −0.47，p < 0.05）逐渐下降（图1E–G）。综上，这些结果表明温度升高系统性地将工程化解脂耶氏酵母的碳分配从生物量形成和呼吸损失转向产物合成。
【数据】温度范围：25–32°C；甲羟戊酸得率相关性：R = 0.85，p < 0.001；生物量得率：R = −0.62，p < 0.01；CO2得率：R = −0.47，p < 0.05
3.2 高温改变中心碳通量分布并重塑生长与甲羟戊酸生产之间的平衡
为阐明温度如何影响生物量形成与甲羟戊酸生产之间的平衡，在指数生长期使用13C-MFA定量了胞内代谢通量。为实现跨条件可比性，所有胞内通量均以葡萄糖摄取速率归一化，从而评估中心代谢网络内的相对碳分配。通量分析揭示了32°C下中心碳代谢的明显温度依赖性重组，其特征是关键分支点相对通量的重新分配，而非整体代谢活性的均匀增加（图2A）。
尽管高温下进入中心代谢的总碳通量降低（补充表S8），但Embden–Meyerhof–Parnas（EMP）途径的相对通量增加，表明碳优先分配至糖酵解。这一转变在葡萄糖-6-磷酸（G6P）节点最为明显。32°C下，更大比例的G6P被导向糖酵解，同时戊糖磷酸途径的通量减少（图2B）。这种重新分配表明碳利用在NADPH生成途径和乙酰-CoA生成途径之间存在温度依赖性再平衡。戊糖磷酸途径通量降低可能限制生长所需的还原力和生物合成前体供给，而增强的糖酵解通量增加了下游乙酰-CoA的可利用性。与此趋势一致，三羧酸（TCA）循环的相对通量在28°C和30°C时高于32°C，反映较低温度下碳更多投入能量生成和生物量合成（图2A）。相反，在32°C下，柠檬酸通量分析表明进入线粒体TCA循环的通量减少，而胞质柠檬酸分流增加（图2C），有利于甲羟戊酸形成。综上，这些结果表明高温重塑了中心碳通量分布，将碳分配从生长相关途径转向乙酰-CoA供给和甲羟戊酸生物合成。这种温度依赖性重新分配为观察到的生物量积累与产物形成之间的权衡提供了代谢解释。
【数据】13C-MFA归一化：以葡萄糖摄取速率为基准；32°C下G6P节点：糖酵解比例↑、PPP通量↓；TCA通量：28/30°C > 32°C；柠檬酸分流：32°C胞质↑、线粒体↓
3.3 温度诱导全局转录变化并揭示碳通量分配的候选调控因子
为进一步阐明温度依赖性代谢通量重分配的分子基础，对不同温度下指数生长期的解脂耶氏酵母进行了转录组测序。主成分分析（PCA）显示生物学重复间具有良好的可重复性，且不同温度条件之间明显分离（图3A），表明菌株对温度变化存在一致的转录响应。值得注意的是，25°C与32°C之间的比较显示出最大的整体基因表达模式变化（图3A），表明高温下存在广泛的细胞响应。
以32°C为参考条件，差异表达分析分别相对于25°C、28°C和30°C鉴定出1282、1178和887个差异表达基因（DEGs）。其中，669个DEGs在所有三组比较中均一致变化，构成核心温度响应基因集（图3A）。该核心基因集的KEGG通路分类显示与应激响应、膜转运和代谢调控相关的通路显著富集（图3C），支持温度在全局水平而非选择性靶向个别代谢途径影响细胞生理的观点。
尽管13C-MFA结果显示32°C下糖酵解通量增加且流向甲羟戊酸生物合成的碳通量增强，转录组分析却显示该条件下EMP途径、戊糖磷酸途径和TCA循环相关基因总体下调（图3B）。转录本丰度与代谢通量之间的这种明显解偶联表明，温度依赖性代谢调控并非仅在转录水平主导，而可能涉及更高级的调控机制。
为探究观察到的转录本丰度与代谢通量解偶联的潜在调控贡献因子，进一步分析了酿酒酵母中与碳源利用和中心代谢调控相关的转录因子。ERT1、NRG1、AZF1、MTH1、ARG82、GAL83和CAT5在解脂耶氏酵母中的同源基因，即YALI1_E04060g（log2FC = −1.95，p < 0.05）、YALI1_C17453g（log2FC = −1.89，p < 0.05）、YALI1_A16891g（log2FC = −1.89，p < 0.05）、YALI1_B06607g（log2FC = −1.31，p < 0.05）、YALI1_B14978g（log2FC = −1.89，p < 0.05）、YALI1_C00503g（log2FC = −1.89，p < 0.05）和YALI1_E18269g（log2FC = −1.08，p < 0.05），在32°C下均显著下调（补充表S9，图3D）。因此，这些转录因子被选为后续温度依赖性碳通量分配功能分析的候选调控因子。
【数据】DEGs数量：25°C vs 32°C：1282个；28°C vs 32°C：1178个；30°C vs 32°C：887个；核心DEGs：669个；YALI1_A16891g：log2FC = −1.89，p < 0.05
3.4 敲除YALI1_A16891g重现高温通量状态并增强甲羟戊酸生产
对候选转录因子进行了靶向敲除。敲除YALI1_C00503g和YALI1_E18269g导致不可存活表型，而其余突变体均可存活并表现出不同的生产特征（图4A）。其中，敲除YALI1_A16891g（ΔYALI1_A16891g）导致甲羟戊酸滴度显著增加。随后进行补料分批发酵以比较YL17和ΔYALI1_A16891g菌株。在指数补料阶段，甲羟戊酸滴度持续……
（原文此处截断，后续内容未提供。根据图4图注，补料分批发酵在32°C下进行，测定了OD600、残留葡萄糖和甲羟戊酸产量的时间曲线。）
【数据】敲除YALI1_C00503g：不可存活；敲除YALI1_E18269g：不可存活；敲除YALI1_A16891g：甲羟戊酸滴度显著增加
3.5 YALI1_A16891g的功能表征及其在高温下的潜在调控机制
（原文该节内容未完整提供。根据图5图注，该部分包括：对照菌株YL17和ΔYALI1_A16891g菌株在不同温度下的甲羟戊酸产量和OD600测定；YALI1_A16891g的表达响应分析。）
【数据】原文未详述
讨论与解读
在解脂耶氏酵母中，温度被广泛认为是影响生长和代谢产物生产的重要生物过程参数。然而，既往研究主要将温度视为过程优化操作因素，而温度与代谢调控之间的内在机制仍不清楚。本研究表明，高温（32°C）在解脂耶氏酵母中诱导了明显的生长-生产权衡——生物量积累减少但甲羟戊酸合成增强。13C代谢通量分析揭示高温将中心碳通量重新导向糖酵解，从而在生长减弱的情况下增加甲羟戊酸途径的乙酰-CoA供给。值得注意的是，转录组分析显示中心碳代谢相关基因全局下调，表明观察到的通量重分配并非直接在转录水平驱动，而是与更高级的调控机制相关。进一步分析鉴定出转录因子YALI1_A16891g是与糖酵解通量重分配相关的关键调控因子。YALI1_A16891g可能在高温条件下调控下游糖酵解相关基因，从而特异性地影响高温下解脂耶氏酵母的糖酵解碳分配和甲羟戊酸生产。
编译者解读：该研究揭示了"转录下调-通量上调"这一看似矛盾却富含调控信息的现象，提示代谢通量调控存在转录水平之外的层次。从合成生物学应用角度看，鉴定YALI1_A16891g为高温下糖酵解通量的负调控因子，为"通过敲除负调控因子来重构碳流"提供了直接靶点——这是一种比过表达多个途径基因更简洁的工程策略。然而，该研究仍停留在菌株表型与转录组关联层面，YALI1_A16891g的直接下游靶基因及分子结合机制尚未完全阐明。未来若能解析其调控网络并与其他温度响应元件联用，有望建立"温度-转录因子-代谢通量"的理性设计框架。
参考来源
Sun, Y. (2026). Transcription factor YALI1_A16891g contributes to enhanced glycolytic flux and mevalonate production at elevated temperature in engineered Yarrowia lipolytica. Bioresource Technology. DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135335
DOI: 10.1016/j.biortech.2026.135335