来源：Engineering Yarrowia lipolytica for enhanced lipid productivity in nutrient-rich conditions: A scalable approach to microbial lipid production（Metabolic Engineering）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
气候变化正在冲击作物产量，可可脂和棕榈油等大宗油脂的价格波动加剧，可持续替代来源需求迫切。解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）是极具潜力的微生物脂质生产平台，但传统上依赖氮限制策略，限制了富营养条件下的高产。本研究通过多基因工程改造——删除丝状生长调控基因MHY1、过表达TAG合成基因、阻断脂肪酸降解、削减CDP-DAG途径磷脂合成、阻断柠檬酸分泌——最终获得菌株CJ0415，在5-L发酵罐中实现54.6 g/L脂质产量、45.8%脂质含量和2.06 g/L/h的脂质生产率，较氮限制条件提升2.6倍。
研究背景
全球对脂肪和脂质的依赖持续上升，但传统动植物来源面临土地资源紧张、环境问题和供应链中断等挑战。欧盟计划于2026年禁止棕榈油，更凸显了开发可持续替代方案的紧迫性。微生物脂质生产因可再生、可规模化等优势成为有前景的解决方案。解脂耶氏酵母因其脂质积累能力可超过细胞干重的20%，且安全性良好，被视作理想的工业宿主。此前的代谢工程策略包括阻断脂质降解途径、削减竞争性代谢通量以及过表达脂质合成基因等。然而，氮限制策略虽能促进脂质积累，却严重抑制细胞生长，导致整体生产率偏低。如何在富营养条件下实现脂质积累与细胞生长的解偶联，是工业化生产的关键瓶颈。
研究方法
2.1 培养条件
Y. lipolytica 细胞在YPD培养基（10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖）中过夜培养，随后以初始OD600为1接种于30 mL YPDP培养基[10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20–40 g/L葡萄糖、100 mM磷酸钾（pH 7.0）]或YLMM1培养基[40 g/L葡萄糖、1.25 g/L酵母氮源（不含氨基酸和硫酸铵）、3.76 g/L硫酸铵、1 g/L尿嘧啶、0.03 mM氯化胆碱、100 mM磷酸钾（pH 7.0）]中，使用300 mL挡板摇瓶，30°C、200 rpm振荡培养。
【数据】培养基：YPD/YPDP/YLMM1；温度：30°C；转速：200 rpm；初始OD600：1；葡萄糖：20–40 g/L；磷酸钾：100 mM（pH 7.0）；氯化胆碱：0.03 mM
2.2 菌株构建
本研究所用菌株见表1。起始菌株为CJ1001，其KU70（YALI0C08701）基因被替换为含有源自Y. lipolytica Po1f的LEU2（YALI0C00407）标记基因的片段。基因删除、启动子替换和基因整合均基于同源重组，使用约500 bp同源臂的DNA片段进行染色体靶向。URA3标记用于整合片段的筛选。基因过表达时，目标基因两侧连接强启动子TEFINt或TEF以及CYC1终止子。所需DNA片段通过重叠PCR组装。Y. lipolytica转化参照优化的一步转化方案并略作修改：DNA混合物（0.5–1 μg DNA、90 μL 50% PEG 4000、10 μL 1M DTT、5 μL 2M LiAc、2.5 μL ssDNA）与细胞涡旋混匀至少10 s，39°C孵育60 min，涂布于选择性培养基，30°C培养3–4天。正确基因组修饰经菌落PCR确认后，在5-FOA平板[2 g/L葡萄糖、6.7 g/L YNB（不含氨基酸）、1.92 g/L SC-Ura、24 mg/L尿嘧啶、10 ml/L 5-FOA、20 g/L Bacto琼脂]上培养3–4天以去除URA3标记。菌株构建所用引物列于补充表S1。
【数据】同源臂：约500 bp；PEG 4000：50%；DTT：1M；LiAc：2M；ssDNA：2.5 μL；孵育温度：39°C；时间：60 min；培养温度：30°C；时间：3–4天
2.3 分析方法
细胞干重（DCW）通过收取1 mL培养液、60°C干燥48 h后称重测定。培养液中葡萄糖浓度使用YSI 2900生化分析仪（YGS Inc.，美国）按说明书测定。有机酸使用配备ACQUITY Premier系统（Waters，美国）的高效液相色谱（HPLC）定量，分离柱为Dionex Aminex HPX 87H柱（300 mm × 7.8 mm，Bio-Rad Laboratories，美国），配导电检测器。洗脱在40°C下进行，流动相为2.5 mM H2SO4（95%）和乙腈（5%），流速0.55 mL/min。赤藓糖醇和甘露醇使用ICS-5000系统（Thermo Scientific，美国）分析，配备CarboPac PA1柱（4.0 × 250 mm，Thermo Scientific），30°C，电化学检测器（ECD）。流动相为20 mM氢氧化钠，等度洗脱，流速1.0 mL/min，进样量5 μL，总运行时间10 min。赤藓糖醇和甘露醇的保留时间分别约为2.8和3.2 min。标准品购自Fluka。铵离子使用940 Professional IC Vario（Metrohm，瑞士）离子色谱定量，配Metrosep C4柱（4.0 × 150 mm，Metrohm），40°C，电导检测器（CD）。流动相为1.7 mM硝酸和0.7 mM吡啶二甲酸，等度洗脱，流速0.9 mL/min，进样量20 μL，总运行时间25 min。阳离子标准品购自Metrohm。16种氨基酸（丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸）使用氨基酸分析仪（L-8900，Hitachi High-Technologies Corporation，日本）配紫外检测器定量。氨基酸经离子交换柱（4.6 × 60 mm，#2622 PH，Hitachi）分离后与茚三酮反应，流速0.35 mL/min，柱温35°C。分析物用MCI buffer™ PH-KIT在57°C、0.40 mL/min流速下洗脱。氨基酸混合标准溶液购自Wako Chemical。
【数据】DCW干燥：60°C、48h；HPLC柱温：40°C；流速：0.55 mL/min；ICS-5000柱温：30°C；流速：1.0 mL/min；进样量：5 μL；保留时间：赤藓糖醇2.8 min、甘露醇3.2 min；IC柱温：40°C；流速：0.9 mL/min；进样量：20 μL；氨基酸分析仪柱温：35°C；茚三酮流速：0.35 mL/min；洗脱流速：0.40 mL/min；温度：57°C
2.4 脂质提取与脂肪酸组成分析
酵母细胞总脂质含量通过提取后重量法测定。培养细胞经离心收集，用蒸馏水洗涤两次，60°C干燥24 h。干燥细胞与10 mL 8N HCl混合，80°C水浴孵育1 h。冷却至室温后加入30 mL乙醚，剧烈涡旋30 s提取脂质，4°C、4000 rpm离心5 min。上清转移至预先称重的烧瓶中。乙醚提取和上清收集过程重复两次。含总脂质的溶剂用氮吹系统蒸发。提取的脂质称重，以总脂质重量和占酵母干重百分比表示。脂肪酸组成分析时，约20 mg脂质提取物置于12 mL小瓶中，加入2 mL内标（ISTD）和1.5 mL NaOH，90°C水浴孵育5 min，冷却至室温。随后加入2 mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，再次90°C孵育30 min。冷却后加入2 mL异辛烷和5 mL饱和氯化钠溶液，涡旋混匀。分层后取1 mL上层转移至含100 mg Na2SO4的2 mL EP管中，颠倒数次去除残余水分。分层后取1 mL上清转移至2 mL分析瓶中用于脂肪酸甲酯（FAME）分析。FAME使用8890 GC系统（Agilent Technologies，美国）分析，配备DB-FastFAME GC柱（30 m × 0.25 mm，Agilent Technologies）和火焰离子化检测器（FID）。操作条件：进样口温度250°C，检测器温度250°C，进样量1 μL，分流比1:100。柱温程序：80°C保持0.5 min，以40°C/min升至165°C保持1 min，再以4°C/min升至230°C保持6 min。使用FAME Mix标准品（Supelco 37 Component，Sigma-Aldrich）进行校准和鉴定。
【数据】HCl浓度：8N；水浴温度：80°C；时间：1h；离心：4000 rpm、4°C、5 min；脂质样品量：20 mg；NaOH：1.5 mL；BF3-MeOH：14%、2 mL；孵育：90°C、30 min；GC进样口/检测器温度：250°C；进样量：1 μL；分流比：1:100；柱温程序：80°C→165°C→230°C
2.5 补料分批发酵
Y. lipolytica 细胞先在500 mL摇瓶YPDP培养基中培养。取100 mL培养液接种至5-L生物反应器（BIOCNS Co., Ltd.）中的1.5 L发酵培养基进行种子培养。培养基成分包括40 g/L葡萄糖、2 g/L MgSO4·7H2O、1.66 g/L H3PO4（85%）、0.95 g/L KOH（45%）、2 g/L尿嘧啶、7 g/L硫酸铵、5 g/L酵母提取物、26 mg/L CaCl2·2H2O、35.1 mg/L FeSO4·7H2O、18.2 mg/L ZnSO4·5H2O、25.9 mg/L CuSO4·5H2O、26 mg/L Na2MoO4·2H2O、6.5 mg/L H3BO3、26 mg/L MnSO4·H2O及微量元素溶液。补料分批发酵时，部分种子培养液接种至含40 g/L葡萄糖的1.4 L生产培养基中。
【数据】种子培养体积：1.5 L；发酵罐：5-L；葡萄糖：40 g/L；MgSO4·7H2O：2 g/L；H3PO4（85%）：1.66 g/L；KOH（45%）：0.95 g/L；尿嘧啶：2 g/L；硫酸铵：7 g/L；酵母提取物：5 g/L；微量元素：原文未详述
研究结果
3.1 富营养条件下脂质积累平台菌株的开发
为获得在富营养条件下兼具高脂质积累和强生长能力的菌株，研究以CJ1001为出发菌株——该菌株源自Y. lipolytica Po1f，通过删除KU70（YALI0C08701）基因实现高效同源重组。为增强脂质生产，研究删除了参与脂质降解的基因，包括PEX10（YALI0C01023）（对过氧化物酶体形成至关重要）以及β-氧化途径的关键基因POX2（YALI0F10857）、MFE1（YALI0E15378）和POT1（YALI0E18568）（图1a）。所得菌株CJ0021在C/N比为2.1的富营养2% YPDP（YPD+0.1 M磷酸盐缓冲液，pH 7）培养基中脂质含量为6.5%，与亲本菌株CJ1001相近（图1b）。随后在CJ0021中删除了调控菌丝生长的MHY1（YALI0B21582）基因，获得CJ0023。虽然控制菌丝形成曾被报道可增强ACL酶活性和脂质生产，但CJ0023的脂质含量仅比CJ0021略有增加（图1b）。然而，在C/N比更高（4.2）的4% YPDP培养基中培养时，CJ0021和CJ0023的脂质含量均显著高于CJ1001，说明营养条件对基因修饰效果有重要影响（图S1）。
基于上述修饰，研究聚焦于过表达TAG生物合成基因。已有研究表明，过表达编码二酰甘油酰转移酶（将DAG转化为TAG）的DGA1基因和编码酰基甘油-3-磷酸酰转移酶（将LPA转化为PA）的SLC1基因可增强脂质生产（图1a）。据此，在CJ0023菌株中通过将DGA1（YALI0E32769）的启动子替换为强启动子TEFINt实现过表达，获得菌株CJ0028。该菌株生物量与CJ0023相近，但脂质含量达到14.4%，较CJ0023提升2.03倍（图1b）。随后在CJ0028中通过将SLC1（YALI0E18964）启动子替换为TEF启动子实现过表达，所得菌株CJ0060的脂质含量增至17.6%，较CJ1001提升2.79倍（图1b）。
由于增强TAG合成途径在富营养条件下提高脂质产量方面效果显著，研究进一步在CJ0060基础上优化该途径——在POT1位点插入额外拷贝的DGA1，或将LRO1（YALI0E16797）启动子替换为TEF启动子。然而所得菌株CJ0069和CJ0096的脂质含量与CJ0060相当（图1b）。这些结果表明脂质生物合成中的竞争性途径可能制约脂质生产，单纯过表达TAG合成基因不足以实现脂质积累的进一步提升。
【数据】CJ0021脂质含量：6.5%（2% YPDP，C/N 2.1）；CJ0028脂质含量：14.4%（较CJ0023提升2.03倍）；CJ0060脂质含量：17.6%（较CJ1001提升2.79倍）；CJ0069/CJ0096脂质含量：与CJ0060相当
3.2 通过CDP-DAG途径抑制磷脂酰胆碱合成提升脂质生产
酵母脂质分为膜脂和储存脂。膜脂（如磷脂和鞘脂）是细胞膜和细胞器的结构组分；储存脂则主要由TAG和甾醇酯组成，积累于脂滴中。在Y. lipolytica中，TAG占储存脂的绝大部分，甾醇酯水平相对较低。磷脂酸（PA）是TAG和磷脂生物合成的共同前体（图2a）。磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰肌醇（PI）和磷脂酰胆碱（PC）等磷脂通过CDP-DAG途径由PA合成。此前研究表明，在S. cerevisiae中删除参与PC合成的CDP-DAG途径基因CHO2和OPI3，在无胆碱的SC最低培养基中可提高脂质含量。值得注意的是，PC占细胞膜总磷脂的50%以上。
为探究通过CDP-DAG途径抑制PC生产的影响，研究在CJ1001中分别删除了CHO2（YALI0E06061）和OPI3（YALI0E12441），获得CJ0162和CJ0123。这些菌株在2% YPD培养基上生长正常，但在SC培养基上生长显著受限（图2b）。在SC培养基中补充0.03 mM胆碱——可通过Kennedy途径利用DAG和CDP-胆碱合成PC（图2a）——成功恢复了菌株生长（图2b）。在补充0.03 mM胆碱的YLMM1液体最低培养基（C/N比为20）中，CJ0162和CJ0123的脂质含量分别为16.3%和16.4%，较亲本菌株CJ1001分别增加41.7%和42.6%（图2c）。补充胆碱后，CJ0162和CJ0123的磷脂谱与亲本菌株相似（图2d）。这些结果表明胆碱的可利用性可补偿CDP-DAG途径的缺失，支持PC合成并促进TAG积累。
基于这些结果，研究进一步考察了在富营养培养基中CHO2或OPI3缺失菌株的脂质含量是否也能提高。在2% YPDP培养基中，CJ0162和CJ0123的脂质含量（分别为7.8%和7.7%）高于CJ1001（6.1%），但仍低于补充0.03 mM胆碱的YLMM1培养基（图2e）。研究还在脂质生产能力增强的CJ0060中删除了OPI3，所得菌株CJ0107在2% YPDP培养基中的脂质含量较CJ0060增加8.5%（图2f）。
Kennedy途径利用胆碱合成PC需要消耗一分子DAG——DAG是TAG生物合成的中间产物（图2a）。为在竞争Kennedy途径的同时进一步增强TAG生产，研究在CJ0107中整合了额外拷贝的DGA1。所得菌株CJ0125的脂质含量达24.3%，较CJ0107提升27.2%（图2f）。需要注意的是，在未删除OPI3的CJ0060中整合额外拷贝的DGA1并未有效提高脂质含量（图1b）。这些结果表明，抑制CDP-DAG途径并增强TAG生物合成，可在富营养条件下有效提升脂质积累。
【数据】CJ0162脂质含量：16.3%（较CJ1001增加41.7%）；CJ0123脂质含量：16.4%（较CJ1001增加42.6%）；CJ0162/CJ0123在2% YPDP中脂质含量：7.8%/7.7%；CJ1001在2% YPDP中脂质含量：6.1%；CJ0107较CJ0060脂质含量增加8.5%；CJ0125脂质含量：24.3%（较CJ0107提升27.2%）
3.3 富营养条件下脂质生产率的提升
通过代谢工程和合成生物学手段提高脂质产量至接近理论最大值（0.27 g/g葡萄糖）的研究已有探索。然而，提高脂质生产率面临外部环境因素的显著影响，尤其是氮等特定营养物质的限制。为评估不同C/N比下摇瓶培养的脂质生产率，研究将菌株CJ0125分别在氮限制（含0.03 mM胆碱的4% YLMM1，C/N 20）和富氮（4% YPDP，C/N 4.2）条件下培养。氮限制条件下，脂质含量达35.7%，脂质滴度为5.06 g/L，但生物量受限（OD600 61.8）。相比之下，富氮条件下脂质含量较低（25.4%），但脂质滴度更高（5.52 g/L），归因于生物量增加（OD600 94.3）（图3a）。尽管脂质含量较低，富氮条件下的脂质生产率为0.153 g/L/h，高于氮限制条件下的0.118 g/L/h。研究进一步在5-L发酵罐中考察了脂质生产。
【数据】氮限制条件：脂质含量35.7%、脂质滴度5.06 g/L、OD600 61.8、脂质生产率0.118 g/L/h；富氮条件：脂质含量25.4%、脂质滴度5.52 g/L、OD600 94.3、脂质生产率0.153 g/L/h；理论最大脂质产量：0.27 g/g葡萄糖
讨论与解读
脂质是细胞膜、信号分子和能量储备的重要组分，在诸多工业应用中扮演关键角色。传统脂质来源面临土地稀缺、环境问题和供应链中断等挑战。Y. lipolytica因高脂质合成能力和安全性成为有前景的生产平台。然而，工业规模脂质生产仍受限于低脂质生产率——根源在于对氮限制条件的依赖。氮限制虽能通过触发柠檬酸衍生的乙酰-CoA合成增强脂质积累，却严重限制细胞生长。突破这一瓶颈需要将脂质积累与营养饥饿解偶联。此前有研究通过引入NADH转NADPH的酶并耦合异源乙酰-CoA合成途径，将脂质生产率提升至1.2 g/L。本研究通过系统代谢工程策略——删除MHY1、过表达TAG合成基因、阻断脂肪酸降解、削减CDP-DAG途径磷脂合成、阻断柠檬酸分泌——实现了富营养条件下脂质积累与细胞生长的协同优化。
【数据】CJ0415：脂质产量54.6 g/L、脂质含量45.8%、脂质生产率2.06 g/L/h（5-L发酵罐，较氮限制条件提升2.6倍）
编译者解读
本研究的关键价值在于将脂质积累从"氮限制依赖"中解放出来——通过削减CDP-DAG途径的磷脂合成通量，将PA通量重新导向TAG合成，同时阻断柠檬酸分泌以减少碳流失，实现了富营养条件下生长与产脂的并行。2.06 g/L/h的脂质生产率在同类研究中具有竞争力，且操作策略（基因删除+启动子替换）均基于标准同源重组工具，具备工业菌株开发的直接可迁移性。值得关注的是，CDS1点突变（P367S）的引入提示精细调控酶活而非简单敲除可能是平衡生长与合成的更优路径。后续若能在更廉价的碳源（如木质纤维素水解液）和更大规模反应器中验证该菌株的稳健性，将进一步提升其工业应用前景。
参考来源
Lee, D. (2025). Engineering Yarrowia lipolytica for enhanced lipid productivity in nutrient-rich conditions: A scalable approach to microbial lipid production. Metabolic Engineering. DOI: 10.1016/j.ymben.2025.05.004
DOI: 10.1016/j.ymben.2025.05.004