来源：Optimization of lipid production from seaweed mannitol by engineered Yarrowia lipolytica strains（Microbiological Research）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
褐藻是富含甘露醇的海洋生物质资源，而甘露醇恰是工业褐藻胶提取过程的副产物。本研究利用基因工程改造的解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）菌株 AJD ΔEYD1 DGA1，系统评估了不同预处理方法对甘露醇回收率及酵母脂质合成的影响。结果显示，1%柠檬酸浸泡可获得最高甘露醇浓度（14.76 g/L），且该过程可成功放大至1 L生物反应器规模。脂肪酸谱分析表明油酸（C18:1）占总脂质的平均48%，单不饱和脂肪酸占比超过60%，为褐藻胶生产与微生物油脂生物过程的整合提供了可持续路径。
研究背景
褐藻是一类多样化的海洋生物，估计物种数约2000种，主要分布于较寒冷的大陆沿岸水域。全球海藻产量持续增长，亚洲占世界产量的97%以上，其中几乎全部为人工养殖。仅海带属和糖海带属就占人类用途总产量的30%以上，同时也被用作鱼类饲料。褐藻含有褐藻胶、海带多糖和岩藻多糖等多种工业重要化合物，其消费量在藻类群体中最高，占全球人类消费总量的66.5%，这主要归因于其复杂组成可能具有抗炎和抗氧化等治疗功效。褐藻生物量丰富、CO₂固定能力强、生长速度快、物种数量多、培养成本低且不占用农业用地，使其成为极具前景的研究对象。然而，褐藻胶提取过程中产生的大量含甘露醇废液尚未得到有效利用。本研究旨在通过工程化改造的解脂耶氏酵母菌株，将褐藻来源的甘露醇高效转化为微生物单细胞脂质，实现废弃资源的增值利用。
研究方法
2.1 培养基与预接种物制备
Y. lipolytica 菌株 AJD ΔEYD DGA1（Szczepańczyk et al., 2025）在 YPD 培养基中培养，该培养基含有 20 g/L 葡萄糖、20 g/L 蛋白胨和 10 g/L 酵母提取物（A&A Biotechnology），培养温度为 28°C。用于脂质合成实验的接种物在 YNB 培养基中培养，添加 20 g/L 葡萄糖，培养 48 小时，持续振荡 200 rpm。脂质合成在改良的藻类脂质合成培养基中进行，添加硫酸铵以获得 C/N 比为 60（取决于所分析的甘露醇含量），同时添加不含氨基酸和硫酸铵的 YNB 以及 0.5% 酵母提取物。对含藻类甘露醇的脂质合成培养基进行了额外调整，如补充 20 g/L 甘油或葡萄糖——C/N 比调整为 60，同时考虑培养基中的第二种碳源。类似地，在优化培养基至限氮条件时，柠檬酸的浓度也被纳入考量。培养基中还添加了 NaCl（3%）。盐的添加不需要调整培养基中硫酸铵的量。
【数据】菌株：AJD ΔEYD DGA1；培养基：YPD（葡萄糖 20 g/L、蛋白胨 20 g/L、酵母提取物 10 g/L）；温度：28°C；时间：48h；转速：200 rpm；C/N比：60；NaCl：3%
2.2 甘露醇提取
甘露醇提取在 2 L 烧杯中进行，向其中放入 100 g 干燥的墨角藻（Fucus vesiculosus，Dary Podlasia，波兰）。使用蒸馏水浸泡藻类，方法如前所述（Szczepańczyk et al., 2025）。在机械搅拌器 CAT R50（德国）持续搅拌下浸泡两小时后，收集样品用于 HPLC 分析甘露醇含量。剩余提取液（不含藻类碎片）转移至 50 mL 管中，在室温下以 2348 rcf 离心 15 分钟，以去除藻类小颗粒。离心后的提取液转移至玻璃瓶中并灭菌（121°C，1.1 bar，15 分钟）。提取过程的其他变更包括使用 HCl（0.1 N 和 0.3 N）以及 1%（Bojorges et al., 2023）和 3%（Fawzy and Gomaa, 2021）柠檬酸溶液进行浸泡。还使用人工海水代替蒸馏水，以分析高盐度对过程的影响。干藻生物量浸泡后的后续步骤与提取方法无关，均相同。
【数据】藻类用量：100 g 干燥墨角藻；浸泡时间：2h；搅拌器：CAT R50（德国）；离心：2348 rcf、15 min、室温；灭菌：121°C、1.1 bar、15 min；提取剂：蒸馏水、HCl（0.1 N、0.3 N）、柠檬酸（1%、3%）、人工海水
2.3 HPLC 分析
从生物反应器实验获得的样品在 15 mL 管中以 21130 rcf 离心 15 分钟。上清液小心转移至新管中，避免扰动沉淀。离心后的上清液额外以 21130 rcf 离心 10 分钟。来自摇瓶实验的样品收集至 1.5 mL 微量离心管中，并按上述方法离心两次。两种类型的样品随后使用 0.22 µm 针头式过滤器过滤至适合 HPLC 分析的玻璃小瓶中。为表征培养基中甘露醇和其他碳源以及柠檬酸的浓度，样品通过 HPLC 分析，使用 HyperRez Carbohydrate H+ 色谱柱（Thermo Scientific），耦合 UV 检测器（λ = 210 nm）（Dionex，美国）和示差折光检测器（Shodex，日本），运行时间为 20 分钟。洗脱使用 25 mM 三氟乙酸，流速为 600 µL/min，柱温设定为 65°C。
【数据】离心：21130 rcf、15 min + 10 min；滤膜：0.22 µm；色谱柱：HyperRez Carbohydrate H+；检测器：UV（210 nm）+ 示差折光；运行时间：20 min；流动相：25 mM 三氟乙酸；流速：600 µL/min；柱温：65°C
2.4 生物量分析
取培养后培养基（生物反应器和摇瓶研究）10 mL 收集至 15 mL 管中，以 2348 rcf 离心 10 分钟（室温），弃去上清液后用蒸馏水洗涤。沉淀重悬于水中并通过过滤系统。过滤使用 0.22 µm GSWP 硝酸纤维素膜。过滤后的生物量在先前使用的硝酸纤维素圆盘上干燥 24 小时，然后在 RADWAG 型号 MA 50/1.R.WH（波兰）干燥天平中于 105°C 称重。
【数据】样品量：10 mL；离心：2348 rcf、10 min、室温；滤膜：0.22 µm GSWP 硝酸纤维素膜；干燥：24h、105°C；天平：RADWAG MA 50/1.R.WH
2.5 生物反应器研究
为进行生物反应器研究，AJD ΔEYD1 DGA1 菌株在含 2% 葡萄糖的 YNB 培养基中于 0.25 L 锥形瓶（0.025 L 工作体积）中培养 48 小时，摇床条件为 28°C、180 rpm。培养物离心（5 分钟，2348 rcf），洗涤两次并重悬于蒸馏水中。生物反应器研究在 1 L 生物反应器（Sartorius）中进行，工作体积为 300 mL，含有各种藻类甘露醇提取培养基（如前所述）。培养过程中不调节 pH。初始空气流量设定为 500 ccm，温度设定为 28°C。整个研究过程中搅拌设定为 600 rpm。培养物的初始 OD600 设定为 1。每 24 小时收集 10 mL 样品用于 HPLC 分析。实验开始时加入 200 µL 消泡剂 204 A6426（Sigma Aldrich）以避免泡沫形成。
【数据】预培养：YNB + 2% 葡萄糖、48h、28°C、180 rpm、0.25 L 瓶（0.025 L 工作体积）；离心：5 min、2348 rcf；反应器：1 L（Sartorius）、300 mL 工作体积；pH：不调节；空气流量：500 ccm；温度：28°C；搅拌：600 rpm；初始 OD600：1；取样：每 24h 取 10 mL；消泡剂：200 µL 204 A6426
2.6 脂质含量分析
脂质合成在含有以下成分的脂质合成培养基中进行：酵母氮碱（1.7 g/L）、酵母提取物（5 g/L）、甘露醇和硫酸铵（C/N 比为 60）。培养基使用藻类甘露醇提取液制备，因此甘露醇和硫酸铵的量根据灭菌前不久从各种藻类物种获得的甘露醇提取液中的甘露醇值进行调整。脂质生产分析在脂质合成培养基中进行，使用 300 mL 锥形瓶（30 mL 工作体积）或 1 L 生物反应器（300 mL 工作体积）。培养物 OD600 设定为 1.0。含藻类甘露醇培养基中的脂质含量分析在 48 孔板中进行，工作体积为 3.5 mL。发酵研究中的生物量经冻干后用于脂肪酸生产分析。约 10–20 mg 冻干生物量与 2 mL 2.5% 硫酸-甲醇溶液混合，并加入内标 C17:0（50 mg/mL）。提取在带特氟龙盖的玻璃管中进行。混合 2 分钟后，样品在 80°C 下振荡孵育 90 分钟。加入 1 mL 己烷和 0.5 mL 水后进行脂肪酸甲酯的提取。混合和离心后出现含脂肪酸的有机相。该相小心转移至玻璃小瓶中，用于 GC−2010 Plus 气相色谱分析，配备火焰离子化检测器（FID）和自动进样器（AOC−20i）。分离在 70% 氰丙基聚硅苯基硅氧烷色谱柱上进行。
【数据】培养基：YNB（1.7 g/L）、酵母提取物（5 g/L）、甘露醇 + 硫酸铵（C/N=60）；摇瓶：300 mL 瓶、30 mL 工作体积；反应器：1 L、300 mL 工作体积；OD600：1.0；孔板：48 孔、3.5 mL 工作体积；样品量：10–20 mg 冻干生物量；衍生化：2 mL 2.5% H₂SO₄-MeOH、内标 C17:0（50 mg/mL）；孵育：80°C、90 min、振荡；提取：1 mL 己烷 + 0.5 mL 水；仪器：GC−2010 Plus、FID、AOC−20i
研究结果
对 Y. lipolytica 的基因修饰导致赤藓糖醇脱氢酶基因 EYD1（YALI0F01650g）的缺失，显著增强了该菌株利用甘露醇并将其作为唯一碳源的能力。此外，编码二酰甘油（DAG）酰基转移酶的基因 YALI0E32769g 的过表达，使得甘露醇能够转化为储存物质——单细胞脂质（Szczepańczyk et al., 2025）。本研究将修饰菌株培养在含有从褐藻中提取的甘露醇的培养基上，该褐藻经历了多种预处理步骤（Bojorges et al., 2023）。褐藻胶提取过程可能采用的多种方案，加上进一步优化培养条件参数的需要，促使研究者测试了 Y. lipolytica 生产生物量和单细胞脂质的最佳条件。因此，Y. lipolytica 菌株 AJD ΔEYD1 DGA1 在通过从藻类中提取甘露醇并补充其他碳源获得的培养基上进行了测试。此外，还分析了工业规模褐藻胶提取方案中可能使用的不同预处理方法对甘露醇浓度及后续酵母生长的影响（表1）。
首先，为确定通气的影响，将按前述方法（Szczepańczyk et al., 2025）用蒸馏水浸泡褐藻墨角藻获得的培养基置于摇瓶和带挡板摇瓶中。该实验基于 Mirończuk 等人（2017）的观察——赤藓糖醇生产和甘油利用与通气相关。由于赤藓糖醇和甘露醇的代谢途径相互交织，该分析作为更高规模发酵的预实验进行。实验中每 24 小时收集样品，分析基于条件的甘露醇利用率。Y. lipolytica 菌株 AJD ΔEYD1 DGA1 在两种条件下均能有效利用甘露醇。甘露醇在 48 小时后几乎耗尽，摇瓶中达到 0.612 g/L，带挡板摇瓶中达到 0.618 g/L（数据未显示）。增加通气在小实验室规模上影响非常有限。由于差异极小，后续实验在摇瓶中进行。
【数据】菌株：AJD ΔEYD1 DGA1；甘露醇残留（48h）：摇瓶 0.612 g/L、带挡板摇瓶 0.618 g/L；取样间隔：24h
3.1 工艺放大
Y. lipolytica 菌株 AJD ΔEYD1 DGA1 经基因工程改造后，在小实验室规模上从藻类甘露醇有效生产脂质取得了极佳结果（Szczepańczyk et al., 2025）。因此，本研究将工艺放大至 1 L 生物反应器，工作体积为 300 mL。生物反应器中的甘露醇利用更为有效，培养基中几乎全部甘露醇（11.05 g/L）在 48 小时内被利用，如图2所示。实验在此时间点停止，培养基中残留 1.85 g/L 甘露醇，以避免储存脂质降解。实验结束时分析生物量，平均达到 9.16 g/L。脂质产量和脂肪酸谱已确定。脂质产量占总干生物量的 9.96%，考虑到培养基整体低碳含量，这一结果具有重要意义（表2）。甘露醇并非 Y. lipolytica 的偏好碳源，这一事实进一步增加了该发现的重要性。总产量中占比最大的是油酸（C18:1），占 47.68%。亚油酸（C18:2）和棕榈酸（C16:0）也以较高水平产生，分别达到 18.71% 和 13.61%。脂肪酸的主要部分为单不饱和脂肪酸（MUFA），达到 59.87%。饱和脂肪酸（SFA）占总产量的 21.41%，而多不饱和脂肪酸（PUFA）主要以亚油酸形式产生（表3）。脂质合成水平与 30 mL 工作体积的摇瓶实验相当，后者的脂质含量达到 9.47%。利用藻类甘露醇、生产生物量和干生物量中总脂质含量的能力在改变条件下进一步测试，以优化工艺并表征这些变化对脂肪酸生产及其谱图的影响。培养基的改变遵循褐藻胶提取过程中可能使用的预处理方法。
【数据】反应器规模：1 L（300 mL 工作体积）；甘露醇利用：48h 内利用 11.05 g/L；残留甘露醇：1.85 g/L；生物量：9.16 g/L；脂质含量：9.96% 干重；油酸（C18:1）：47.68%；亚油酸（C18:2）：18.71%；棕榈酸（C16:0）：13.61%；MUFA：59.87%；SFA：21.41%
3.2 预处理方法对甘露醇浓度的影响
从褐藻中提取褐藻胶的标准程序需要将它们浸泡在蒸馏水或弱酸溶液中。由于整个过程高度依赖水，研究者测试了使用海水代替淡水的可能性。这将显著减少对日益枯竭的淡水资源的不利影响。为获得藻类甘露醇培养基，按照 Nguyen（2018）的程序制备了人工海水（ASW）。此外，还测试了工业规模常用的盐酸（HCl）溶液。由于无机酸对环境的负面影响，褐藻胶提取过程也可使用柠檬酸进行（Bojorges et al., 2023; Fawzy and Gomaa, 2021），因此该预处理步骤也被纳入从 F. vesiculosus 获取甘露醇的考量中。甘露醇浓度分析和提取液 pH 的结果见表1。所有测试的预处理方法对漂洗液中甘露醇浓度均有积极影响，其中 1% 柠檬酸的差异最大，获得的甘露醇比蒸馏水提高了 14%。此外，除 0.3 N HCl 外，所有提取液的 pH 均适合直接开始培养而无需调节 pH，因为 Y. lipolytica 能够耐受约 3.0 的低 pH。
【数据】甘露醇提升（1%柠檬酸 vs 蒸馏水）：+14%；pH耐受：约 3.0；提取剂：蒸馏水、ASW、HCl（0.1 N、0.3 N）、柠檬酸（1%、3%）
3.3 高盐浓度培养基上的脂质生产
在使用人工海水进行甘露醇提取的过程中，培养基中甘露醇的最终水平达到 14.62 g/L，比蒸馏水获得的值高 13%。这表明人工海水可用于该过程，但可能对褐藻胶提取的后续步骤或其性质产生限制作用，这一点未在本研究中测试。此外，高盐浓度可能对 Y. lipolytica 的生长和脂质合成产生负面影响，尽管最终培养基中甘露醇浓度略高。该生物体具有耐受恶劣环境条件（包括高盐度）的能力，但这些条件对甘露醇利用和脂质生产的影响此前尚未被分析。此外，培养基中盐的最终浓度可能因程序而异。因此，甘露醇利用过程在以下两种条件下进行分析：使用 ASW 获得的藻类甘露醇，以及提取后添加盐的培养基，以更好地控制培养基中盐的最终浓度。使用 ASW 提取甘露醇的培养物在初始 OD 设定为 0.5 的条件下，能够在 72 小时内几乎完全利用碳源。此时培养基中平均仍有 0.58 g/L 甘露醇残留，如图3所示。实验随即停止，因为残留甘露醇保护了储存脂质免于在碳耗竭培养基中被降解。分析所得生物量达到 13.25 g/L。进一步分析转向用蒸馏水漂洗藻类并在之后添加盐以控制其浓度的培养基。选择 3% NaCl 作为培养条件，因其接近 ASW 中 NaCl 的浓度且 Y. lipolytica 能在该条件下生长。
【数据】ASW提取甘露醇浓度：14.62 g/L（比蒸馏水高 13%）；初始 OD600：0.5；甘露醇残留（72h）：0.58 g/L；生物量：13.25 g/L；NaCl：3%
讨论与解读
Y. lipolytica 菌株 AJD ∆EYD1 DGA1 被证明是利用褐藻漂洗液中藻类甘露醇并从这种废弃材料生产脂质的有效途径。利用褐藻胶提取步骤中获得的废弃漂洗液的能力，是发挥该废弃物全部潜力的有前景的路径。由于该过程缺乏通用方案，本研究考虑了多种因素。分析在人工生产的藻类漂洗液上进行，以根据获得的初步结果筛选可在未来研究中纳入的潜在工业废弃物来源。由于先前的结果令人鼓舞（Szczepańczyk et al., 2025），更大规模的脂质生产在生物反应器中进行。结果表明，尽管培养基整体碳含量低，该过程可以放大并保持高水平的脂质产量。这一问题可通过添加 Y. lipolytica 易利用的其他碳源来解决，然而，两种不同碳源可能导致迟滞期，这是由酵母适应新条件引起的。培养培养基在氮含量方面可进一步优化。漂洗液富含多种不同化合物，其中一些可用作氮源或碳源。这些化合物在碳分析时已被纳入考量。
编译者解读：本研究巧妙地将褐藻胶工业提取的废弃物流与工程化酵母的脂质合成相耦合，体现了合成生物学"废弃物变原料"的循环设计理念。选择柠檬酸作为预处理剂既提升了甘露醇回收率（+14%），又避免了无机酸的环境负担，兼顾了工艺效率与绿色化学原则。值得注意的是，作者对高盐条件的系统评估为海水直接利用提供了数据支撑——这对沿海褐藻胶工厂尤为重要。局限在于当前 C/N 比 60 和批式培养模式下脂质含量仍偏低（约10%干重），未来若引入补料策略或两阶段培养（先增殖后产脂），有望进一步提升油脂产率。该工作为褐藻胶产业与微生物油脂工业的整合提供了可放大的技术原型。
参考来源
Szczepańczyk M. Optimization of lipid production from seaweed mannitol by engineered Yarrowia lipolytica strains. Microbiological Research, 2026. DOI: 10.1016/j.micres.2026.128567
DOI: 10.1016/j.micres.2026.128567