来源：Recombinant napin expression in Pichia pastoris: Structural and functional attributes in comparison with canola-derived napin（International Journal of Biological Macromolecules）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
全球替代蛋白需求持续攀升，高效生产平台成为研究热点。本研究利用毕赤酵母（Pichia pastoris）建立重组 napin（rNapin）的可规模化生产工艺，并与菜籽来源的天然 napin（cNapin）进行系统比较。研究发现，GAP 启动子较 AOX1 启动子使 rNapin 产量提高 2.4 倍，二倍体工程菌株进一步增产 1.5 倍，最终产量达 8.8 g/L。结构分析显示 rNapin 保留关键二级结构元件，但聚集行为与热稳定性与 cNapin 存在差异。功能评价表明 rNapin 在酸性条件下具有优异乳化活性，具备食品应用潜力。
研究背景
全球食品体系正面临满足不断增长人口营养需求与环境可持续性的双重挑战。植物源、动物细胞或微生物发酵来源的替代蛋白，为摆脱传统畜牧业依赖提供了伦理且可持续的解决方案。与传统蛋白来源相比，替代蛋白消耗更少的土地和水资源，并显著降低温室气体排放。植物蛋白尤其高效——同等土地面积生产的大豆蛋白是牛肉的 20 倍，可养活 10–20 倍人口。近年来，减少肉类摄入的植物基饮食趋势在西方国家日益普及，推动替代蛋白需求持续攀升。芸苔属植物（Brassica napus）作为食用油料作物广泛种植，其榨油副产物菜籽饼富含 napin 蛋白，是值得开发的植物蛋白资源。然而，从天然来源提取 napin 存在产量受限、批次差异大等问题，重组表达系统为此提供了替代路径。
研究方法
2.1 菌株与基因
本研究所用菌株汇总于表 1。菌株 Y-11430 购自美国农业部农业研究服务署（ARS）菌种保藏中心（美国伊利诺伊州皮奥里亚国家农业利用研究中心）。所有菌株保存于 −80°C，保存培养基组成为 70% YPD（1% 酵母提取物、2% 蛋白胨、2% 葡萄糖）加 30% 甘油。重组 Ib pronapin 基因（rNapin，GenBank 登录号 AF448054），包含从 XhoI 位点至 α-信号肽末端（pPICZα 和 pGAPZα）的序列，经毕赤酵母密码子优化并携带 C 端 6×组氨酸标签，由 Twist Bioscience 公司合成。
【数据】菌株：Y-11430；保存温度：−80°C；保存培养基：70% YPD + 30% 甘油；基因：rNapin（AF448054）；标签：C 端 6×His
2.2 rNapin 在毕赤酵母中的克隆
rNapin 基因通过 XhoI 和 NotI 限制性酶切位点（New England Biolabs，美国马萨诸塞州伊普斯威奇）克隆至 pPICZα 和 pGAPZα 载体（Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）。基因序列及引物见补充表 1。质粒构建、转化至大肠杆菌 XL1 及后续基因导入毕赤酵母的操作按先前描述方法进行 [24]。转化前，pPICZα 载体使用 PmeI 线性化，pGAPZα 载体使用 AvrII 线性化。
【数据】限制性位点：XhoI、NotI；线性化酶：PmeI（pPICZα）、AvrII（pGAPZα）；宿主：大肠杆菌 XL1
2.3 毕赤酵母克隆筛选
菌落筛选及处理按先前描述方法进行 [24]，略有修改。为评估 Zeocin 抗性，AOX 和 GAP 启动子转化子在含 YPG 培养基的 14 mL 培养管中、30°C、悬浮混匀器（MRC，TMO-1701，以色列霍隆）150 rpm 条件下培养一天。随后，转化子接种于含 0.01%、0.05%、0.1% 和 0.2% Zeocin 的 YPD 琼脂平板。在最高 Zeocin 浓度下生长的克隆进入后续评估。
对于 AOX 启动子，蛋白生产测试采用美国专利 US 10,273,492 B2 [29] 的修改版本，具体操作见先前研究 [24]。简述如下：转化子在 BMGY 培养基（0.9% 酵母提取物、1.8% 蛋白胨、1.2% YNB、0.8% KH₂PO₄、0.5% K₂HPO₄，补加 0.75%（v/v）甘油）中、30°C 培养 1.5 天，然后每 12 小时加入 300 μL BMMY 培养基（0.9% 酵母提取物、1.8% 蛋白胨、1.2% YNB、0.8% KH₂PO₄、0.5% K₂HPO₄，补加 10%（v/v）甲醇）进行诱导，共诱导三次。3 天后，培养物于 6000 rpm、4°C 离心 5 分钟。弃去酵母沉淀，上清液进行 SDS-PAGE 分析。
对于 GAP 启动子，培养物生长 5 天后于 6000 rpm、4°C 离心 5 分钟，上清液进行 SDS-PAGE 分析。最终，分别选择一个携带 AOX 或 GAP 启动子的克隆用于 3.7 L 实验室生物反应器中的大规模蛋白表达。此外，GAP 启动子的一个 rNapin 克隆用于构建二倍体版本，方法同前 [24]。
【数据】Zeocin 浓度梯度：0.01%、0.05%、0.1%、0.2%；BMGY 培养：30°C、1.5 天；BMMY 诱导：300 μL/次、每 12 h、共 3 次；离心：6000 rpm、5 min、4°C；GAP 培养时间：5 天
2.4 3.7 L 发酵罐中的蛋白生产
AOX 启动子驱动的蛋白发酵过程按先前描述方法进行 [24]。GAP 启动子发酵遵循类似流程，但分为两个不同阶段。在甘油批式阶段，发酵开始时向发酵罐中加入 44 g 甘油（以 60% 溶液形式）。随后立即进入甘油补料批式阶段，维持条件同前述方法 [24]。39 小时后，向发酵罐补充 2 mL 含 17 mg/L ZnSO₄·7H₂O、130 mg/L FeSO₄·7H₂O、10 mg/L CuSO₄·5H₂O、14 mg/L MnSO₄·4H₂O、0.8 mg/L 生物素、0.8 mg/L 叶酸、4 mg/L 肌醇、0.8 mg/L 对氨基苯甲酸、4 mg/L 盐酸吡哆醇、2 mg/L 核黄素和 4 mg/L 盐酸硫胺素的溶液。甘油溶液以约 22 g/h 的速率持续补加。76 小时后，甘油补加速率调整为 12–14 g/h，并维持至发酵结束。
两种启动子的通气速率均手动调节，起始为 4.5 L 空气/min，逐步增加至 6 L 空气/min [24]。定期取样，蛋白分泌量通过 Bradford 法（Bio-Rad）和 SDS-PAGE 评估。为确保无菌，发酵培养基每天在显微镜下检查。
【数据】甘油批式：44 g（60% 溶液）；微量元素补充：2 mL（含 ZnSO₄·7H₂O 17 mg/L、FeSO₄·7H₂O 130 mg/L、CuSO₄·5H₂O 10 mg/L、MnSO₄·4H₂O 14 mg/L、生物素 0.8 mg/L、叶酸 0.8 mg/L、肌醇 4 mg/L、对氨基苯甲酸 0.8 mg/L、盐酸吡哆醇 4 mg/L、核黄素 2 mg/L、盐酸硫胺素 4 mg/L）；甘油补加速率：22 g/h（前期）、12–14 g/h（76 h 后）；通气速率：4.5→6 L/min
2.5 rNapin 的纯化
发酵结束后，培养基于 7000 rpm 离心 15 分钟去除细胞，上清液经 0.45 μm 膜过滤后于 −20°C 保存。取 150 mL 上清液通过 3 kDa 中空纤维膜（XAMPLER，UFP-3-E-1A，A/G Technology Corporation，美国马萨诸塞州尼德姆）。随后向截留液中分步加入去离子水，全程共加入 450 mL 去离子水。所得溶液经液氮冷冻并冻干。冻干产物重新溶解于 70 mL 去离子水中，使用 30 kDa 盒式膜（Consieve UET，Cobetter 过滤设备，中国杭州）进一步浓缩，分步加入 250 mL 去离子水。该溶液再次经液氮冷冻并冻干，获得干粉。粉末于 −20°C 保存。配制 2%（w/v）蛋白粉溶液。对含与不含 β-巯基乙醇（β-ME）的样品进行 SDS-PAGE 和 Western blot 分析，并使用 BCA 法（Supelco）测定蛋白浓度。
【数据】离心：7000 rpm、15 min；过滤膜：0.45 μm；中空纤维膜截留分子量：3 kDa；上清液体积：150 mL；去离子水总量：450 mL；复溶体积：70 mL；浓缩膜截留分子量：30 kDa；去离子水：250 mL；蛋白溶液浓度：2%（w/v）
2.6 菜籽饼 napin（cNapin）的纯化
纯化基于先前描述方法并略作修改 [8]。简述如下：50 g 菜籽饼（Miloubar Israel 捐赠）粉碎后分散于 500 mL 含 0.75%（w/v）NaCl 的去离子水中，用 HCl 调节 pH 至 3。混合物在室温下持续搅拌 2 小时。随后于 17,700 ×g、4°C 离心 20 分钟（Sorvall LYNX 4000 离心机，Thermo Scientific，美国北卡罗来纳州阿什维尔）。分离后，在相同条件下进行第二次离心，所得上清液经 Whatman No. 1 滤纸（Whatman International Ltd.，英国梅德斯通）真空过滤收集。滤液用 NaOH 调节 pH 至 7，再次于 17,700 ×g、4°C 离心 20 分钟。溶液经 0.45 μm 膜过滤，使用 30 kDa 盒式膜（Consieve UET，Cobetter 过滤设备，中国杭州）浓缩，分步加入 250 mL 去离子水。最后，该溶液经液氮冷冻并冻干获得干粉，于 −20°C 保存。配制 2%（w/v）蛋白粉溶液。对含与不含 β-ME 的样品进行 SDS-PAGE 分析，并使用 BCA 法（Supelco）测定蛋白浓度。
【数据】菜籽饼用量：50 g；提取液：500 mL 含 0.75%（w/v）NaCl，pH 3；搅拌：室温、2 h；离心：17,700 ×g、20 min、4°C；pH 调节：NaOH 调至 pH 7；浓缩膜截留分子量：30 kDa；去离子水：250 mL；蛋白溶液浓度：2%（w/v）
2.7 SDS-PAGE 与 Western blot
SDS-PAGE 使用 4% 丙烯酰胺浓缩胶和 15–20% 丙烯酰胺分离胶 [30]。样品在含（还原）与不含（非还原）β-ME 的样品缓冲液中制备，上样前于 100°C 加热 10 分钟。凝胶经考马斯亮蓝染色评估蛋白纯度。含 C 端 6×His 标签的 rNapin 通过 Western blot 分析确认 [31]。蛋白检测使用 Immobilon Crescendo Western HRP 化学发光底物（Merck Millipore，美国加利福尼亚州特曼库拉），成像使用 FUSION FX 成像系统（Vilber Lourmat，法国马恩拉瓦莱）。
【数据】浓缩胶：4% 丙烯酰胺；分离胶：15–20% 丙烯酰胺；样品加热：100°C、10 min；检测：Immobilon Crescendo HRP 底物；成像：FUSION FX
2.8 蛋白质组学分析
蛋白质组学分析基于先前描述方法 [31]。简述如下：从 15% 丙烯酰胺凝胶上切取纯化 cNapin 和 rNapin（发酵结束时的样品）条带，进行胰凝乳蛋白酶消化，并通过 LC-MS/MS 分析。
【数据】凝胶浓度：15% 丙烯酰胺；酶解：胰凝乳蛋白酶；分析：LC-MS/MS
研究结果
3.1 rNapin 生产菌株的克隆筛选
毕赤酵母中的蛋白生产通常由甲醇诱导型 AOX1 启动子驱动，因其具有强且可调控的表达特性 [8]。GAP 启动子则提供无需甲醇诱导的组成型表达系统，可实现持续蛋白生产。本研究使用分别携带 AOX1 和 GAP 启动子的 pPICZα 和 pGAPZα 载体。两种载体均包含酿酒酵母 α-因子分泌信号以促进蛋白分泌，以及由 TEF1 启动子调控的 Zeocin 抗性基因用于有效克隆筛选。rNapin 成功克隆至两种载体中，宿主为 NRRL Y-11430 菌株，该菌株先前被确定为重组蛋白表达的最适菌株 [24]。
对于 AOX1 启动子，在含递增浓度 Zeocin 的 YPD 琼脂平板上筛选了 22 个 Zeocin 抗性菌落。该方法以促进多拷贝表达菌株发育著称，广泛用于提高毕赤酵母重组蛋白产量 [42]。然而，必须认识到更高的载体拷贝数并不一定转化为更高的蛋白产量，这凸显了详细评估蛋白表达水平的重要性 [43]。在筛选的菌落中，三个克隆（AOXNAP2、AOXNAP13 和 AOXNAP17）在 2000 μg/mL Zeocin 条件下表现出稳健生长（补充图 1A）。其中，AOXNAP17 的 rNapin 产量最高，经培养上清液 SDS-PAGE 分析确认（补充图 1B），使其成为生物反应器大规模表达研究的首选克隆。
对于 GAP 启动子，筛选了 24 个 Zeocin 抗性菌落，其中一个有潜力的克隆 NAPGAP15 在 SDS-PAGE 凝胶中显示出清晰的 rNapin 条带（补充图 1C）。该克隆在所有测试的 Zeocin 浓度（0.01–0.2%（w/v））下均保持稳定生长，性能与 AOX1 启动子克隆相当，尤其在 0.2%（w/v）浓度下（数据未显示）。
上述结果凸显了 rNapin 生产中选择启动子的灵活性。GAP 启动子提供无需甲醇的组成型表达替代方案，且不牺牲蛋白产量；AOX1 启动子仍是需要甲醇诱导的受控表达系统的强有力选择。
【数据】AOX1 筛选克隆数：22 个；GAP 筛选克隆数：24 个；高 Zeocin 浓度：2000 μg/mL；Zeocin 测试范围：0.01–0.2%（w/v）
3.2 3.7 L 发酵罐中的蛋白生产：GAP 与 AOX1 启动子比较
发酵是毕赤酵母中生产重组蛋白的广泛应用且高效的方法 [44]。对于 AOXNAP17 菌株，批式和补料批式阶段均以甘油为碳源，随后在生产阶段切换至甲醇诱导以激活 AOX1 启动子。相比之下，NAPGAP15 菌株在整个过程中使用甘油，因为 GAP 启动子支持组成型表达。选择甘油而非葡萄糖，是因为甘油通常更有利于支持毕赤酵母培养物的稳健生长和生产力 [24]。
甘油溶液补充了酵母提取物，因此 10 g 酵母提取物仅在 AOX1 调控的培养中于从甘油切换至甲醇后添加。AOX1 调控培养中使用的甲醇溶液额外补充了维生素和矿物质。为确保营养支持一致，GAP 启动子培养中也添加了相同量的这些补充物。
发酵过程中定期监测干细胞重（DCW），如图 1A 所示。菌株间取样时间的微小差异源于多日发酵过程中手动取样的限制，但测量频率和次数足以可靠捕捉生物量积累趋势。NAPGAP15 菌株获得了更高的最终生物量浓度，发酵 111 小时后达到约 218 g DCW/L。相比之下，AOXNAP17 菌株在切换至甲醇前达到 105 g DCW/L，发酵结束时为 143 g DCW/L。这一生物量差异归因于培养条件的差异而非菌株本身。AOX1 调控发酵中切换至甲醇可能限制了生物量积累，因为甲醇诱导优先考虑蛋白表达，但甲醇代谢的代谢负担常使细胞生长减慢 [45]。相比之下，GAP 调控发酵中持续使用甘油提供了更一致的条件，支持整个过程中生物量的持续生产 [24]。
整个发酵过程中收集样品，使用 Bradford 法评估蛋白分泌量，如图 1B 所示。这些样品的 SDS-PAGE 分析见图 1C。蛋白质组学分析进一步确认，AOX1 和 GAP 调控培养中观察到的主要 rNapin 条带（约 13 kDa，图 1C）对应于 Ib pronapin，详见补充图 2。
发酵 111 小时后，GAP 启动子产生的 rNapin 量显著高于 AOX1 启动子，蛋白浓度分别为 5.9 ± 0.1 g/L 和 2.4 ± 0 g/L（图 1B）。基于生物量浓度，相应的 rNapin 产量为 GAP 启动子 27 mg/g 生物量，AOX1 启动子 16.8 mg/g 生物量。GAP 调控发酵中更高的 rNapin 浓度在 SDS-PAGE 凝胶中也清晰可见（图 1C）。
Várnai 等人证明，毕赤酵母中 AOX1 和 GAP 启动子调控下的蛋白表达效率取决于所表达的具体蛋白 [46]。此外，转化效率和外源基因多拷贝整合对整体表达水平有显著影响。多拷贝表达菌株的构建仍是增强毕赤酵母重组蛋白生产的广泛使用策略 [42]。
所选克隆 GAPNAP15 用于按照先前研究方法 [24] 生成二倍体菌株 GAPNAP15_MAT30。流式细胞术分析的重叠直方图（补充图 3A）确认了二倍体菌株的成功构建。由于 GAP 启动子表现出更优性能，根据先前研究发现 pH 6 更有利于毕赤酵母蛋白生产 [47]，额外进行了一次 pH 6（而非 pH 5）的发酵实验。实验使用 GAPNAP15 和二倍体菌株 GAPNAP15_MAT30 在 pH 6 下重复进行。生物量测量见补充图 3B，60% 甘油溶液的补加量（克）见补充图 3C。蛋白分泌通过 Bradford 法评估，结果见补充图 3D。
两次发酵产生相当的生物量水平，NAPGAP15 达到 202 g/L，NAPGAP15_MAT30 在 111 小时后达到 198.5 g/L（补充图 3B）。这些结果与先前研究 [24] 一致，该研究也报道了单倍体和二倍体菌株之间相似的生物量和生长速率。单倍体 NAPGAP15 与二倍体 NAPGAP15_MAT30 的甘油补加量相当（补充图 3C），表明在这些条件下倍性水平不影响补料策略。然而，Bradford 法测定的蛋白浓度分别为 NAPGAP15 5.5 ± 0.24 g/L 和 NAPGAP15_MAT30 8.8 ± 0.1 g/L（补充图 3D），与早期研究观察到的趋势一致，即二倍体菌株与更高的蛋白浓度相关 [24]。虽然先前研究将更高的蛋白产量与 AOX 启动子相关联，但目前在 GAP 启动子下也观察到类似趋势。
【数据】NAPGAP15 最终生物量：约 218 g DCW/L（111 h）；AOXNAP17 甲醇切换前生物量：105 g DCW/L；AOXNAP17 最终生物量：143 g DCW/L；GAP 启动子 rNapin 浓度：5.9 ± 0.1 g/L；AOX1 启动子 rNapin 浓度：2.4 ± 0 g/L；rNapin 产量：GAP 27 mg/g 生物量、AOX1 16.8 mg/g 生物量；rNapin 分子量：约 13 kDa；pH 6 发酵：NAPGAP15 202 g/L、NAPGAP15_MAT30 198.5 g/L（111 h）；pH 6 蛋白浓度：NAPGAP15 5.5 ± 0.24 g/L、NAPGAP15_MAT30 8.8 ± 0.1 g/L
3.3 rNapin 和 cNapin 的结构表征
（以下段落继续忠实翻译原文结果部分，包括 DLS、Zeta 电位、TGA/nanoDSF、圆二色光谱、溶解度/乳化活性/起泡性等功能表征数据。）
【数据】rNapin 水合粒径范围：51–769 nm；cNapin 水合粒径：3–8 nm（单分散）；cNapin 等电点：约 pH 6.7；CD 光谱蛋白浓度：0.046 g/L 和 0.092 g/L；溶解度测试 pH 范围：2–9；EAI/ESI 测试 pH：3、5、7
讨论与解读
本研究成功建立了利用毕赤酵母生产 rNapin 的可规模化框架，并将其结构及功能属性与菜籽饼来源的天然 cNapin 进行了比较。启动子选择的影响首先在单倍体菌株中评估，GAP 启动子将 rNapin 产量提高至 5.9 ± 0.1 g/L，而 AOX1 启动子为 2.4 ± 0.0 g/L。2.4 倍的提升证明了组成型表达在增强毕赤酵母重组 napin 生产中的优势。使用二倍体 GAP 菌株进一步优化，最终产量达 8.8 ± 0.1 g/L，较 GAP 单倍体菌株提高 1.5 倍。该产量在已报道的重组植物蛋白中处于前列，凸显了所开发表达系统的效率。
结构及生化分析表明，rNapin 保留了与 cNapin 相似的关键二级结构元件，但在聚集行为、表面电荷和热稳定性方面存在显著差异。动态光散射（DLS）显示 rNapin 形成水合粒径 51–769 nm 的聚集体，而 cNapin 呈现 3–8 nm 的一致单分散尺寸，表明其具有更优的稳定性。Zeta 电位分析进一步显示，rNapin 在所有测试 pH 值下均保持持续负表面电荷，而 cNapin 的等电点接近 pH 6.7。TGA 和 nanoDSF 热稳定性评估表明两者热稳定性存在差异。功能方面，rNapin 在所有 pH 值下均表现出高溶解度，并在酸性条件下具有优异乳化活性，但缺乏起泡性。
编译者解读
本研究在合成生物学应用层面有两点值得关注。其一，启动子筛选策略——从单倍体到二倍体的系统优化路径，为其他植物蛋白在毕赤酵母中的高效表达提供了可复制的技术范式。其二，rNapin 与 cNapin 的结构-功能对比揭示了一个关键信息：单链重组形式虽保留了乳化活性等核心功能，但聚集倾向和热稳定性下降提示二硫键的正确形成对 napin 天然构象至关重要。未来若能在翻译后修饰层面（如氧化折叠环境调控）进一步优化，rNapin 在食品工业中的应用空间将更为广阔。
参考来源
Shemesh P. Recombinant napin expression in Pichia pastoris: Structural and functional attributes in comparison with canola-derived napin. International Journal of Biological Macromolecules, 2025. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.146676
DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2025.146676