毕赤酵母重组蛋白生产的新替代分泌信号序列评估

来源：Alternative secretory signal sequences for recombinant protein production in Pichia pastoris（Enzyme and Microbial Technology）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription

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导读

分泌信号序列是重组蛋白胞外生产的关键分子元件。本研究从乳酸克鲁维酵母、马克斯克斯鲁维酵母和多形汉逊酵母中分离了α-交配因子与PIR两类分泌信号序列，在毕赤酵母中测试其驱动α-淀粉酶和木聚糖酶分泌的效率，并与经典的酿酒酵母α-交配因子（Sc-MF）和毕赤酵母PIR（PpPIR）进行比较。结果显示，多形汉逊酵母PIR（HpPIR）和乳酸克鲁维酵母α-交配因子（Kl-MF）在木聚糖酶生产中产量最高，而马克斯克斯鲁维酵母PIR（KmPIR）和Kl-MF在淀粉酶生产中表现最佳。这些新信号序列展现了作为现有分泌信号替代方案的潜力。

研究背景

酵母是重组蛋白生产中重要的表达系统，兼具基础研究实验室和生物技术工业的双重优势。相较于从天然来源提取，该系统能以更高产量和工业规模条件实现蛋白质的经济高效生产，并简化下游加工流程。分泌信号序列是定位于合成蛋白N端的短肽序列，介导蛋白质向内质网的转运，其成功筛选已成为提高异源蛋白分泌效率的有效策略之一。目前，酿酒酵母α-交配因子前导序列仍是酵母重组蛋白分泌的首选方案，但并非对所有蛋白质都是最佳选择。已有研究表明，某些替代分泌信号在特定蛋白分泌中优于酿酒酵母α-交配因子。因此，探索新的分泌信号序列仍是提升酵母表达系统效率的迫切需求。

研究方法

2.1 生物信息学分析

本研究所测试的分泌信号序列包括来自乳酸克鲁维酵母（XP_454814）、马克斯克斯鲁维酵母（XP_022677429）和毕赤酵母（XP_002491685）的α-交配因子分泌信号，以及来自多形汉逊酵母（XP_018210244）、乳酸克鲁维酵母（XP_451858）和马克斯克斯鲁维酵母（XP_022676718）的PIR（含内部重复蛋白）分泌信号。这些序列是基于与已知分泌信号——酿酒酵母α-交配因子（AAA18405）和毕赤酵母PIR（XP_002491705）的同源性分析而选定的（图1）。

2.2 菌株与培养条件

质粒亚克隆实验在大肠杆菌XL1-Blue（recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F0 proAB lacIq ZDM15 Tn10 (Tetr)]）细胞中进行。细胞在含25 μg/mL zeocin抗生素的Luria-Bertani（LB）Lennox培养基（1%胰蛋白胨、0.5%酵母提取物和0.5% NaCl）中于37°C培养。蛋白表达研究在毕赤酵母X-33（野生型）中进行。转化子在含100 μg/mL zeocin的YPD平板（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖和1.5%琼脂）上筛选。细胞在YPD培养基中于28°C生长。重组蛋白生产研究在缓冲甘油复合培养基（BMGY；2%蛋白胨、1%酵母提取物、1.34% YNB、4×10⁻⁵%生物素和100 mM磷酸盐缓冲液pH 6.0及1%甘油）和缓冲甲醇复合培养基（BMMY；2%蛋白胨、1%酵母提取物、1.34% YNB、4×10⁻⁵%生物素和100 mM磷酸盐缓冲液pH 6.0及1%甲醇）中于28°C进行。

【数据】大肠杆菌培养温度：37°C；zeocin浓度：25 μg/mL；毕赤酵母培养温度：28°C；YPD平板zeocin浓度：100 μg/mL；BMGY/BMMY组分：2%蛋白胨、1%酵母提取物、1.34% YNB、4×10⁻⁵%生物素、100 mM磷酸盐缓冲液pH 6.0；BMGY含1%甘油；BMMY含1%甲醇

2.3 含不同信号序列的表达载体构建与克隆

本研究所用载体源自本实验室先前构建的pPICZαA-XylB [24]和pPICZαA-AmyE载体。报告基因XylB和AmyE的NCBI登录号分别为AF490982.1和GeneID: 938356。这些载体中的酿酒酵母α-交配因子分泌信号通过酶切去除——α-交配因子用AsuII-XhoI酶切，PIR用AsuII和EcoRI酶切，随后连接待测分泌信号。分泌信号通过PCR从酵母基因组DNA中获取。本研究所用引物见补充表1。所得载体通过PmeI限制性内切酶在AOX1启动子处线性化，并通过电穿孔法（Gene Pulser Xcell Electroporation System, Bio-rad, CA, USA）以1500 V、25 μF、5 ms的参数转入感受态毕赤酵母X-33细胞[25]。

【数据】酶切位点：α-交配因子用AsuII-XhoI，PIR用AsuII和EcoRI；线性化酶：PmeI；电穿孔参数：1500 V、25 μF、5 ms

2.4 表达盒拷贝数整合的Southern blot分析

对克隆进行Southern blot分析以确认表达盒的整合并确定整合表达盒的拷贝数[26]。选定克隆在3 mL YPD液体培养基中于28°C、250 rpm过夜培养。孵育后，培养物中细胞达到约10 OD₆₀₀ₙₘ，通过10,000 ×g离心收集。使用MasterPure酵母DNA纯化试剂盒（Epicentre, Madison, WI, USA）从选定克隆中提取基因组DNA。木聚糖酶克隆的基因组DNA样本分别用EcoRV和KpnI消化（对应PIR和α-交配因子信号序列），淀粉酶克隆的样本用KpnI和BstEII消化。样本在0.8%琼脂糖凝胶中以1×TAE（Tris-乙酸-EDTA）缓冲液于75 V电泳4小时后，在10×SSC（柠檬酸钠盐）缓冲液中转移至带正电荷的尼龙膜（Roche, CA, USA）。样本与AOX1启动子制备的探针进行杂交。使用DIG-High Prime DNA标记和检测起始试剂盒II（Roche, CA, USA）按照制造商说明进行分析。根据整合盒的条带大小确定拷贝数。

【数据】培养体积：3 mL YPD；温度：28°C；转速：250 rpm；OD₆₀₀ₙₘ：约10；离心：10,000 ×g；琼脂糖凝胶：0.8%；电泳：75 V，4 h；限制酶：EcoRV/KpnI（木聚糖酶PIR/α-交配因子）、KpnI/BstEII（淀粉酶）

2.5 摇瓶条件下的蛋白生产研究

分泌信号序列在AOX1启动子调控下测试胞外淀粉酶和木聚糖酶的生产。生产分两步进行：BMGY培养基中的细胞积累阶段和BMMY培养基中的蛋白生产阶段。使用YPD培养基中过夜培养的菌液以初始OD₆₀₀为0.5接种BMGY培养基。第一阶段维持约24小时。随后，收集的细胞重悬于BMMY培养基中开始蛋白生产阶段。在BMGY中生长的细胞达到OD₆₀₀ₙₘ值12–15，在BMMY培养基中初始OD₆₀₀ₙₘ值均一化为12。首次试验进行72小时，每12小时以终浓度1%的100%甲醇诱导。

【数据】初始OD₆₀₀：0.5（BMGY接种）；BMGY生长后OD₆₀₀ₙₘ：12–15；BMMY初始OD₆₀₀ₙₘ：12；诱导剂：100%甲醇，终浓度1%，每12小时；发酵时间：72 h

2.6 木聚糖酶和淀粉酶酶活测定

信号肽的分泌能力通过测定上清液样本中的酶活性来确定。木聚糖酶活性按Karaoğlan等人（2016）[27]所述方法测定。淀粉酶活性采用根据Sigma-Aldrich方案（2015）[28]修改的3,5-二硝基水杨酸（DNS）法分析。底物溶液含1%（w/v）马铃薯淀粉，用含20 mM磷酸钠、6.7 mM氯化钠、pH 6.9的缓冲液配制。测定淀粉酶活性时，将100 μL用缓冲液适当稀释的酶溶液加入900 μL底物溶液中，于37°C孵育3分钟。孵育结束后，取100 μL反应液与900 μL DNS溶液混合以终止酶反应。随后混合物煮沸5分钟并在冰上冷却。样本吸光度在540 nm处测量。一个淀粉酶活性单位定义为在pH 6.9和37°C下每分钟从淀粉中释放1 μmol还原糖所需的酶量。为测定细胞沉淀中的胞内酶活性，从2 mL细胞培养物中收集细胞，用1 M山梨醇洗涤并重悬于1 mL细胞裂解缓冲液（20 mM HEPES pH 8.0、0.2 mM EDTA、0.5 mM二硫苏糖醇（DTT）、0.5 mM PMSF、0.42 M NaCl、1.5 mM MgCl₂和10% v/v甘油）中。使用玻璃珠在Vortex-Genie 2（M&S Instruments, Osaka, Japan）上以最大速度涡旋破碎细胞，收集上清液。细胞提取物的总蛋白量使用Coomassie（Bradford）蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）测定。上清液样本用酶活测定缓冲液稀释至500 ng/mL蛋白量，用于胞内淀粉酶和木聚糖酶活性测定。

【数据】底物：1% w/v马铃薯淀粉；缓冲液：20 mM磷酸钠、6.7 mM NaCl、pH 6.9；反应条件：37°C、3 min；DNS终止；煮沸5 min；检测波长：540 nm；酶活单位定义：pH 6.9、37°C下每分钟释放1 μmol还原糖；裂解缓冲液组分：20 mM HEPES pH 8.0、0.2 mM EDTA、0.5 mM DTT、0.5 mM PMSF、0.42 M NaCl、1.5 mM MgCl₂、10% v/v甘油；胞内酶活测定蛋白量：500 ng/mL

2.7 SDS-PAGE蛋白分析

上清液中的分泌蛋白通过SDS-PAGE分析。上清液样本与4×上样缓冲液混合至总体积25 μL，然后在70°C变性10分钟。蛋白样本在10%聚丙烯酰胺凝胶上于150 V电泳60分钟进行分离。

【数据】上样缓冲液：4×；总体积：25 μL；变性条件：70°C、10 min；凝胶浓度：10%；电泳：150 V、60 min

2.8 统计分析

结果使用SigmaPlot 11（Systat Software, Inc., San Jose, CA, USA）软件进行单因素方差分析（ANOVA）。采用Duncan多重范围检验在95%置信区间（p < 0.05）下进行比较分析。

【数据】统计方法：单因素ANOVA；事后检验：Duncan多重范围检验；置信区间：95%（p < 0.05）

研究结果

3.1 不同酵母信号序列的克隆

本研究测试的新型分泌序列是基于与已知分泌信号——酿酒酵母α-交配因子（Sc-MF）（AAA18405）和毕赤酵母PIR（PpPIR）（XP_002491705）的同源性分析选定，并从乳酸克鲁维酵母、马克斯克斯鲁维酵母和多形汉逊酵母基因组DNA样本中通过PCR分离。Sc-MF从pPICZαA中切除，替换为HpPIR、KlPIR、KmPIR、Pp-MF、Kl-MF和Km-MF分泌序列。待测分泌序列分别亚克隆至编码淀粉酶和木聚糖酶的两个不同报告基因上游（图S1）。以Sc-MF和PpPIR作为对照评估信号肽性能。表达载体的构建详见方法部分。含有PpPIR、HpPIR、KlPIR、KmPIR、Pp-MF、Sc-MF、Kl-MF和KmPIR构建体（携带淀粉酶和木聚糖酶报告基因）的最终表达盒整合到毕赤酵母X-33（野生型）菌株的AOX1启动子位点。

【数据】对照信号序列：Sc-MF（AAA18405）和PpPIR（XP_002491705）；宿主菌株：毕赤酵母X-33野生型；整合位点：AOX1启动子

3.2 单拷贝转化子的筛选

按照方法部分所述，使用Southern blot方法确认整合并确定选定转化子的基因拷贝数。Southern blot分析所用探针由AOX1启动子区域制备。由于基因组DNA从启动子区域外部消化，只有正确定位的样本在杂交后显示理论预期条带大小。XylB表达菌株中单拷贝克隆的理论预期条带：PIR分泌序列约为6500和2000 kb，交配因子分泌序列约为8000 kb（图S2A）；AmyE表达菌株中PIR分泌序列约为8000 kb，Sc、Pp和Kl交配因子约为8000 kb，Km交配因子约为6500 + 1500 kb（图S2B）。条带大小随分泌信号长度的差异略有变化。随着表达盒整合数增加，条带大小预计增加一个表达盒大小。基因拷贝数的影响具有蛋白特异性，并不总是导致蛋白产量的线性增加[29,30]。因此，为精确比较，选择含单拷贝的克隆继续研究更为合适。在研究后续步骤中，使用选定的单拷贝克隆进行蛋白生产比较。

【数据】XylB单拷贝预期条带：PIR约6500和2000 kb，交配因子约8000 kb；AmyE单拷贝预期条带：PIR约8000 kb，Sc/Pp/Kl交配因子约8000 kb，Km交配因子约6500 + 1500 kb

3.3 新型分泌信号序列在重组淀粉酶和木聚糖酶生产中的比较

新型分泌序列在淀粉酶和木聚糖酶生产中进行了测试。蛋白生产实验在摇瓶条件下使用经确认含单拷贝表达盒的克隆进行。发酵诱导期持续72小时。每12小时采集上清液样本测定酶活性（图2）。需要指出的是，整个发酵过程中也监测了细胞生长，所有克隆在发酵72小时时在600 nm波长下测得的光密度值（OD₆₀₀ₙₘ）大致相同。

【数据】发酵时间：72 h；取样间隔：12 h；OD₆₀₀ₙₘ：各克隆在72 h时大致相同

3.4 毕赤酵母中PIR信号序列的蛋白分泌

使用PIR分泌序列记录的72小时木聚糖酶和淀粉酶产量如图2A和C所示。PpPIR变体作为对照。为两种蛋白提供最高产量的KmPIR被认定为100%，其他序列的产量按此计算。木聚糖酶产量第二高的分泌序列为HpPIR（89%），KlPIR的产量为58%。在淀粉酶分泌方面，KmPIR之后为HpPIR（82%）。KlPIR（22%）是最弱的变体。作为对照纳入分析的PpPIR，木聚糖酶产量为86%，淀粉酶为72%。结果表明，研究中测试的所有异源PIR序列均能引导分泌。在测试的PIR序列中，KmPIR是72小时发酵中两种测试蛋白的最佳选择。

【数据】木聚糖酶相对产量（以KmPIR为100%）：HpPIR 89%、KlPIR 58%、PpPIR 86%；淀粉酶相对产量（以KmPIR为100%）：HpPIR 82%、KlPIR 22%、PpPIR 72%

3.5 毕赤酵母中α-交配因子信号序列的蛋白分泌

使用α-交配因子分泌序列记录的72小时木聚糖酶和淀粉酶产量如图2B和D所示。结果通过与Sc-MF比较进行评估。Sc-MF的产量被认定为100%，其他序列按此计算。在测试的α-交配因子分泌序列中，木聚糖酶的最高蛋白产量由Kl-MF（98%）获得，与Sc-MF大致相同。Km-MF记录了约80%的产量，Pp-MF达到约50%。淀粉酶产量最高的变体虽未达到Sc-MF的水平（与木聚糖酶不同），但仍是Kl-MF（73%）。Km-MF和Pp-MF的淀粉酶分泌约为Sc-MF的50%。结果表明，所有测试的信号肽均有功能。此外，尽管不同蛋白的产量存在差异，Kl-MF的高潜力值得关注。综合来看，木聚糖酶生产的72小时结果显示，上清液样本中酶活性顺序为：PIR分泌序列为KmPIR>HpPIR=PpPIR>KlPIR（图2A），α-交配因子为Sc-MF=Kl-MF>KmMF>PpMF（图2B）。淀粉酶发酵的72小时样本显示，蛋白生产水平为：PIR分泌序列为KmPIR>HpPIR>PpPIR>KlPIR（图2C），交配因子为Sc-MF>Kl-MF>KmMF=PpMF（图2D）。结果统计分析见图3。观察到木聚糖酶分泌最高的KmPIR和Kl-MF信号序列之间无显著差异。然而，KmPIR和Kl-MF的淀粉酶分泌存在显著差异（p < 0.05）。从发酵中收集的蛋白样本的SDS-PAGE结果分别见图S3（木聚糖酶）和图S4（淀粉酶）。结果表明，所测试的分泌信号成功实现了胞外生产。

【数据】木聚糖酶相对产量（以Sc-MF为100%）：Kl-MF 98%、Km-MF约80%、Pp-MF约50%；淀粉酶相对产量（以Sc-MF为100%）：Kl-MF 73%、Km-MF约50%、Pp-MF约50%；72 h木聚糖酶产量排序：PIR类KmPIR>HpPIR=PpPIR>KlPIR，α-交配因子类Sc-MF=Kl-MF>KmMF>PpMF；72 h淀粉酶产量排序：PIR类KmPIR>HpPIR>PpPIR>KlPIR，交配因子类Sc-MF>Kl-MF>KmMF=PpMF；KmPIR与Kl-MF木聚糖酶分泌无显著差异，淀粉酶分泌差异显著（p < 0.05）

3.6 α-交配因子和PIR信号序列的分泌能力

为分析分泌序列的分泌能力，还在细胞沉淀中测定了酶活性水平。按方法部分所述破碎72小时样本中收集的细胞。样本上清液和细胞裂解物中检测到的酶活性如图3所示。确定所有测试分泌序列获得的总蛋白中约95%被分泌。结果表明，两种报告蛋白均能被所测试的分泌序列有效分泌。

【数据】分泌效率：约95%的总蛋白被分泌

3.7 α-交配因子和PIR信号序列的延长发酵实验

如图2所示，结果表明蛋白生产在72小时发酵期间持续增加。随后，进行了216小时的延长发酵，以在更长时间和更高细胞密度下监测所测试信号肽的性能。分析了发酵72、144和216小时的样本（图4）。发酵216小时样本的结果显示，在所有测试的分泌信号中，木聚糖酶产量最高的是PpPIR和Kl-MF（图4A），淀粉酶产量最高的是Sc-MF和KmPIR（图4B）。此外，Kl-MF在淀粉酶分泌方面相比其他分泌序列也表现出相当大的潜力，尽管不如木聚糖酶那样突出。上清液样本中的蛋白通过SDS-PAGE分析，观察到预期蛋白条带（图S5）。结果统计分析（95%置信区间，p < 0.05）显示，所测试分泌序列的胞外蛋白生产水平为：木聚糖酶PpPIR=Kl-MF>HpPIR=KmMF=Sc-MF>KmPIR>KlPIR>PpMF；淀粉酶Sc-MF>KmPIR>Kl-MF>Hp…

【数据】216 h木聚糖酶最高产量：PpPIR和Kl-MF；216 h淀粉酶最高产量：Sc-MF和KmPIR；216 h木聚糖酶产量排序：PpPIR=Kl-MF>HpPIR=KmMF=Sc-MF>KmPIR>KlPIR>PpMF；216 h淀粉酶产量排序：Sc-MF>KmPIR>Kl-MF>Hp…（原文截断）

讨论与解读

重组DNA技术的优势之一在于大规模生产的经济性。高产量和易纯化成为功能性蛋白生产的主要目标，重组蛋白的胞外生产因此受到青睐。分泌信号序列如同定位标签，位于靶蛋白N端，引导蛋白进入宿主细胞的分泌途径。酵母因其在重组蛋白生产和分泌方面的成功而成为有吸引力的表达系统，但多数研究局限于酿酒酵母α-交配因子分泌序列。然而，这并不总意味着最大效率的最佳选择。Vadhana等人（2013）报道使用蛋白天然信号肽相比酿酒酵母α-交配因子可使蛋白产量提高三倍[8]。为更有效地利用酵母表达系统，寻找新的分泌信号序列仍是必要之举。本研究测试了来自乳酸克鲁维酵母、马克斯克斯鲁维酵母和毕赤酵母的α-交配因子信号以及来自多形汉逊酵母、乳酸克鲁维酵母和马克斯克斯鲁维酵母的PIR信号，在毕赤酵母中实现了两种不同蛋白（α-淀粉酶和木聚糖酶）的分泌生产，并与已知的Sc-MF和PpPIR进行了比较。

【编译者解读】本研究系统比较了六种来自不同酵母的替代分泌信号与两种经典对照在毕赤酵母中的分泌效率，方法设计严谨——通过Southern blot确认单拷贝整合，排除了拷贝数差异对产量比较的干扰。从合成生物学应用角度看，Kl-MF和KmPIR在两种报告蛋白中均表现优异，具备替代Sc-MF的潜力，尤其适用于对Sc-MF分泌效率不佳的目标蛋白。值得注意的是，信号序列的最优选择具有蛋白特异性，这提示在实际应用中需要针对目标蛋白进行个性化筛选。本研究的局限在于仅在摇瓶条件下验证，工业发酵罐中的表现有待进一步评估。

参考来源

Karaoğlan M. Alternative secretory signal sequences for recombinant protein production in Pichia pastoris. Enzyme and Microbial Technology, 2023. DOI: 10.1016/j.enzmictec.2023.110256

DOI: 10.1016/j.enzmictec.2023.110256