来源：Lipid biosynthesis from HTC-AP of sewage sludge using engineered Yarrowia lipolytica（Journal of Environmental Management）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
污水处理厂产生的大量污泥既是环境负担，也是潜在资源。本研究以水热碳化（HTC）技术处理污水污泥，将其液相副产物（HTC-AP）作为解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）的发酵基质，实现“污泥—脂质”的整合生物转化。研究发现，温和条件（180°C、60 min）下产生的HTC-AP富含乙酸（4.90 g/L）和丙酸（6.62 g/L），野生型菌株A101及双突变株ΔEYD DGA1表现出最高的耐受性与挥发性脂肪酸同化能力。技术经济分析显示该集成工艺每吨污泥可产生约292.5美元的净利润，为污泥资源化提供了新路径。
研究背景
可持续发展要求在满足人类需求的同时维持自然生态系统稳定。循环经济理念推动下，从生物废弃物中回收有价值的材料和能源成为降低环境影响的重要策略。污水污泥（SS）作为污水处理过程的副产物，产生量逐年攀升——2019年中国产生3904万吨，2021年美国产生450万吨干固体，2017至2020年间欧盟年产870至950万吨干固体。水热碳化（HTC）可将高含水率生物质转化为增值产品，但反应后产生的水相（HTC-AP）长期未得到充分利用。本研究旨在评估以污泥来源的HTC-AP作为解脂耶氏酵母产脂培养基的可行性，填补污泥向高值产品整合生物转化的研究空白。
研究方法
2.1 实验流程概述
研究起始于对原料污水污泥（RSS）的制备与表征，用于水热碳化（HTC）处理。实验考察了温度和停留时间对关键产物——水热炭（HC）和水热碳化水相（HTC-AP）产率的影响。在不同HTC条件（温度、搅拌速率和时间）下生成HC和HTC-AP，并通过真空过滤分离。所得HTC-AP随后用于：（a）鉴定HTC-AP中挥发性脂肪酸（VFA）以外的化合物；（b）量化不同HTC条件下的VFA和脂质产量；（c）评估HTC参数对耶氏酵母生长和脂质积累效率的影响。数据分析采用单因素方差分析（ANOVA）和Fisher最小显著性差异（LSD）检验，以确定最大化HTC-AP产量的最优HTC条件并评估其潜在应用。此外，使用Gompertz模型分析微生物生长动力学，量化不同HTC-AP条件下解脂耶氏酵母菌株的初始群体（y0）和最大生长速率（μ_max，K值）。工艺模拟及技术经济与生命周期整合评估使用BioSTEAM平台完成。
【数据】HTC条件：温度180–300°C，时间60–120 min；统计分析：ANOVA + Fisher LSD检验；生长模型：Gompertz模型
2.2 原料制备
本研究所用RSS取自一座1 MWel污水处理设施（Best-Eko，波兰雷布尼克）。原料来自Boguszowice污水处理厂及其周边区域处理后的市政污水，在沉淀后取样。该RSS在脱水前已经过厌氧消化，得到具有高有机质含量且含水率超过90%的稳定化污泥。污泥在中温条件（37°C）下维持，确保后续增值实验的一致性和适用性。该RSS用作HTC实验的原料。采集至塑料桶后，RSS在室温下放置约24小时，随后均质化并在4500 RPM条件下离心25 min（MPW-54，波兰），分离固液相。固体部分（含水率约85%）按220 g分装至塑料容器中，于−27°C（Electrolux EC5231A0W，瑞典）冷冻保存至HTC处理。
【数据】原料：厌氧消化后污泥；含水率：>90%（原料）/~85%（固体部分）；离心：4500 RPM，25 min；储存温度：−27°C；分装量：220 g
2.3 实验测定——HTC-AP生产
#### 2.3.1 HTC-AP生产的水热碳化工艺
HTC在高温高压反应器（Büchi AG，瑞士乌斯特）中进行，每次运行使用220 g RSS。密封反应器加热至目标温度（TT）（180、220、260和300°C），搅拌速率120 RPM。测试两个停留时间（RT）（60和120 min），每组三次重复，压力为自生压力。8种实验变体的能耗使用数字电表（SK-410，Starmeter，中国）监测。冷却至40°C后，反应器泄压，内容物称重（Radwag MA 50.R，波兰）。固液相通过真空过滤（Rocker 300，台湾）分离，HTC-AP称重后于−27°C（Electrolux EC5231A0W，瑞典）保存待进一步分析。
【数据】反应器：Büchi AG高温高压反应器；进料量：220 g RSS/次；温度：180/220/260/300°C；搅拌：120 RPM；时间：60/120 min；重复：3次；冷却温度：40°C；能耗监测：SK-410数字电表
#### 2.3.2 HTC-AP分析表征方法
挥发性脂肪酸（VFA）采用高效液相色谱（HPLC）测定。样品于−20°C保存。分析前，样品充分混匀，用Milli-Q水稀释，然后在10°C下以10,000 RPM离心10 min，最后在UltiMate 3000系统（ThermoFisher Scientific，英国）中进行分析，使用HyperREZ XP Carbohydrate H+ 8 μm色谱柱（Thermo Scientific，美国沃尔瑟姆）。使用参考溶液（Volatile Free Acid Mix，CRM46975，Merck，波兰）进行校准，校准液按制造商建议储存。洗脱采用等度系统，以0.25 mM三氟乙酸为洗脱液，流速1.1 mL/min，柱温35°C。检测使用UV/VIS-DAD检测器（208 ± 1 nm）和示差折光检测器（RI，Shodeo，日本荻町）。分析重复三次，结果使用Chromeleon 7.1软件处理。校准曲线在工作浓度范围内呈线性（R² ≥ 0.999）。所有VFA测定均重复三次。
采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）表征水相中的有机组分。样品制备时，取1 mL各样品转移至12 mL玻璃管中，加入1.5 mL乙酸乙酯和0.5 mL丙酮萃取，混合1小时。随后取1 mL有机相转移至2 mL玻璃进样瓶进行GC-MS分析。分析使用Shimadzu GC-MS-QP2020 Plus系统（Shimadzu，日本京都），配备AOC-20i自动进样器和ZB-5Msi毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm；Phenomenex Ltd.，美国加州托兰斯）。操作条件如下：进样口温度300°C；柱温箱程序起始50°C（保持5 min），以10°C·min⁻¹升至260°C并保持30 min；氦气为载气，流速1 mL/min；分流比1:10；溶剂切割时间3.5 min。MS检测器以扫描模式运行，m/z范围30–500。化合物鉴定通过将保留时间和质谱与NIST/EPA/NIH质谱库（NIST 20）比对完成。该分析为定性分析；各化合物被鉴定但未绝对定量。
【数据】HPLC条件：柱温35°C，流速1.1 mL/min，流动相0.25 mM三氟乙酸，检测波长208±1 nm；GC-MS条件：进样口300°C，程序升温50°C(5min)→10°C/min→260°C(30min)，载气He 1 mL/min，分流比1:10，m/z 30–500
#### 2.3.3 元素分析
HTC-AP中碳（C）、氢（H）、氮（N）和硫（S）的元素组成在液体样品干燥后，使用CHNS分析仪（PerkinElmer 2400 CHNS/O Series II，美国沃尔瑟姆）按照PN-EN ISO 16948:2015–07标准测定。氧含量通过差减法按公式(1)计算，该方法是生物质和废弃物来源材料中不直接测定氧时的常用做法。灰分含量采用标准马弗炉燃烧法单独测定；但灰分仅用于质量平衡闭合，不作为发酵性能评价的关键参数。由于本研究聚焦微生物利用，元素解读主要基于碳和氮含量，以评估与解脂耶氏酵母生长和脂质积累相关的C/N比。
公式(1)：O% = 100 − C% − H% − N% − S% − Ash%
该分析可详细表征HTC-AP中存在的化学成分。
【数据】分析标准：PN-EN ISO 16948:2015–07；仪器：PerkinElmer 2400 CHNS/O Series II；氧含量：差减法计算
2.4 实验测定——酵母生产
#### 2.4.1 微生物与培养基
选取四株解脂耶氏酵母菌株，系统评估特定遗传修饰对HTC-AP培养基中生长性能和脂质积累的贡献（表1）。菌株A101作为野生型参照；ΔEYD因其对胁迫条件的耐受性而被纳入——鉴于HTC-AP中存在抑制性化合物，这一特性具有相关性；DGA1因其增强的三酰甘油生物合成能力而被选择；双突变株ΔEYD DGA1旨在结合两种性状以实现脂质产量最大化。四株菌代表了遗传复杂性的梯度：A101为野生型参照，ΔEYD和DGA1为分别靶向胁迫耐受性和脂质生物合成的单修饰变体，ΔEYD DGA1为结合两种性状的双突变株。
酵母菌株根据实验设置在不同培养基中培养。菌株维持和常规传代使用酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）培养基，以葡萄糖为碳源。实验接种物按后续实验要求制备。
【数据】菌株：A101（野生型）、ΔEYD（赤藓醇脱氢酶敲除）、DGA1（二酰甘油酰基转移酶过表达）、ΔEYD DGA1（双突变）；培养基：YPD
研究结果
3.1 HTC质量产率与能耗
水热碳化（HTC）实验中的总电能消耗和相对电能消耗如图2所示。结果清楚表明，总能耗和相对能耗均随处理温度（TT）升高和停留时间（RT）延长而增加。最低能耗出现在TT180，总能耗为2.88 MJ（RT60）至3.24 MJ（RT120），对应相对能耗为0.3–0.4 MJ g⁻¹。相比之下，最高能耗出现在TT300，总能耗从7.92 MJ（RT60）升至10.08 MJ（RT120），相对能耗从1.0增至1.3 MJ g⁻¹。数据还表明，延长停留时间会放大能耗，在较高温度下尤为明显。例如，在TT300条件下，将RT从60 min延长至120 min使相对能耗增加30%，而在TT180条件下该效应微乎其微。这些趋势与先前研究一致，即较高温度和较长停留时间与能耗增加相关（Rasaq et al., 2024）。
就HTC水相（HTC-AP）质量产率（MY）而言，能耗趋势总体上与产率提升相关。HTC-AP（液相）产率在各操作条件下变化不大，从TT180–RT60的0.115 kg增至TT300–RT120的0.130 kg，表明随着能量输入增加，产率有适度改善（补充表1）。较高的温度和较长的RT通常导致MY增加，表明额外能量输入有助于更充分的生物质转化。然而，在最高处理条件下产率的相对增益减小，表明能量需求与产品效率之间存在权衡。这些结果强调了优化TT和RT的重要性，以在最大化HTC-AP产率和最小化能耗之间取得平衡，特别是对于可扩展和可持续的HTC应用而言。
【数据】最低能耗：2.88 MJ（TT180-RT60）–3.24 MJ（TT180-RT120）；相对能耗0.3–0.4 MJ/g；最高能耗：7.92 MJ（TT300-RT60）–10.08 MJ（TT300-RT120）；相对能耗1.0–1.3 MJ/g；RT延长能耗增幅（300°C）：+30%；HTC-AP产率：0.115–0.130 kg
3.2 HTC-AP表征
污水污泥（RSS）碳化过程中产生的HTC-AP含有大量有机化合物，表明其是潜在的有价值碳源而非废物流。元素分析和靶向化学表征揭示了异质组成，既反映了初始底物的复杂性，也反映了所采用的HTC条件。定量分析确认了挥发性脂肪酸（VFA）的存在，其中乙酸和丙酸为主要种类。这些化合物容易被微生物同化，因此是HTC-AP营养潜力的关键组分。与此同时，液相中还含有与微生物生长抑制相关的化合物，凸显了HTC-AP作为营养源和潜在毒性介质的双重角色。乙酸和丙酸的主导地位与先前研究一致——这些VFA被鉴定为来自各种原料的HTC-AP中的主要碳源（Atallah et al., 2020）。然而，RSS来源的HTC-AP中抑制性化合物的共存，强调了对其他生物应用适用性进行审慎评估的必要性。
HTC-AP的分析结果汇总于表2。VFA浓度相对较低，最高值出现在180°C、60 min停留时间条件下，乙酸为4.90 ± 0.40 g/L，丙酸为6.62 ± 1.48 g/L。在相同温度下将停留时间延长至120 min，两种酸含量分别降至1.91 ± 0.14 g/L和4.01 ± 0.52 g/L。在较高HTC温度（220–300°C）下，VFA浓度持续偏低，乙酸在1.82 ± 0.26至3.22 ± 0.32 g/L之间，丙酸不超过0.27 ± 0.01 g/L，或完全检测不到（如220°C/120 min条件下）。在HTC过程中，乙酸主要通过碳水化合物中间体的脱水和脱羧反应以及葡萄糖降解产物的逆醛醇断裂形成。丙酸可能来源于丙烯酸酯中间体的还原或亚临界水条件下丙酮酸的降解。在较长停留时间和较高温度下观察到的两种酸含量下降，与其通过脱羧和氧化反应进一步分解一致（Langone and Basso, 2020）。此外，在所有测试条件下，HTC-AP中均未检出丁酸和甲酸。
HTC-AP中VFA含量低与先前关于其升级利用潜力的研究一致——来自厌氧消化污泥的HTC-AP中VFA浓度约为2 g/L，其中乙酸约占总VFA的80%（Langone et al., 2021）。相比之下，以园林废弃物为底物时，HTC-AP中VFA含量可达20 g/L，乙酸约占VFA总量的85%（对应乙酸浓度约17 g/L）（Ciuffi et al., 2021）。
单因素方差分析（ANOVA）显示，不同处理对乙酸含量有显著影响，处理效应高度显著（F₇,₁₆ = 43.39，p < 0.001；补充表2），表明至少有一个处理均值与其他处理不同（表2）。处理均值比较显示，TT180 RT60产生最高值（均值 = 4.90），统计上显著优于所有其他处理；而最低乙酸浓度出现在TT180 RT120和TT220 RT60，两者统计上相似，但显著低于所有其他处理（分别为1.91和1.82）。使用Fisher最小显著性差异检验（LSD = 0.441，α = 0.05），处理被分为不同组别：TT300 RT60和TT300 RT120构成第二高组，两者间无显著差异；TT220 RT120、TT260 RT60和TT260 RT120表现居中且统计上相当。TT180 RT120处理组间统计相似，但显著低于所有其他处理。总体而言，结果表明延长保留时间或调整处理条件显著影响性能，其中TT180 RT60在所有测试处理中提供了最优结果。
单因素方差分析（ANOVA）显示处理对丙酸有高度显著影响（F₇,₁₆ = 59.64，p < 0.001；补充表3），表明处理均值间存在显著变异（表2）。最高响应出现在TT180 RT60（均值 = 6.62），显著大于所有其他处理；其次是TT180 RT120（均值 = 4.01），构成第二高且统计上不同的组别。Fisher最小显著性差异检验（LSD = 0.961）进一步显示，其余处理——包括TT220 RT60、TT220 RT120、所有TT260处理和两个TT300处理——彼此间无显著差异，均表现出一致的低值。这些结果表明，180°C下较长的保留时间显著促进了丙酸的产生，而较高温度则导致响应极小或可忽略。总体而言，处理性能以TT180 RT60为主导，凸显了其在测试条件下的优越性。
除VFA组成外，HTC液体的元素特征同样是评估其生物技术适用性的重要参数。HTC-AP的CHNS分析（补充表2）显示中等碳含量（42–49%）和相对较高的氮含量（7–12%），表明C/N比对于脂质生物合成而言并非最优。这种组成表明，当这些HTC-AP作为唯一碳源使用时，可能需要补充碳源或进行氮含量调节以优化脂质积累。
【数据】乙酸最高值：4.90±0.40 g/L（TT180-RT60）；丙酸最高值：6.62±1.48 g/L（TT180-RT60）；乙酸ANOVA：F₇,₁₆=43.39，p<0.001；丙酸ANOVA：F₇,₁₆=59.64，p<0.001；LSD值：乙酸0.441，丙酸0.961；碳含量：42–49%；氮含量：7–12%；丁酸/甲酸：未检出
3.3 菌株生长与VFA消耗
图3展示了野生型和工程化解脂耶氏酵母菌株在YE培养基（10 g/L）中、添加不同浓度（2–20% v/v）水热碳化（HTC）工艺液（T180 RT60、T300 RT60、T300 RT120）条件下的生长曲线。
图4显示了菌株A101和ΔEYD DGA1在深孔板和摇瓶培养中、添加20%（v/v）HTC液体时挥发性脂肪酸的消耗情况。
【数据】培养基：YE（10 g/L）；HTC液添加浓度：2–20% v/v；VFA消耗实验：20% v/v HTC液
3.4 脂质积累与脂肪酸组成
图5展示了不同培养规模下解脂耶氏酵母菌株的脂肪酸组成：（A）深孔板培养和（B）摇瓶培养。（C）各实验变体的总脂质产量。柱状图表示均值±标准差。
【数据】培养规模：深孔板/摇瓶；统计表示：均值±SD
3.5 工艺建模、技术经济分析与生命周期评估
图6展示了将原料污水污泥（RSS）通过水热碳化（HTC）和解脂耶氏酵母发酵转化为微生物脂质的工艺建模框架。HTC后，产物分离为水热炭和HTC水相（HTC-AP）。HTC-AP随后用作发酵基质。
图7（A-B）展示了不同操作条件下原料污水污泥的脂质产量（A）和技术经济分析（TEA）盈利能力（B）。尽管脂质产量存在差异，所有情景均产生负年利润，凸显了在缺乏进一步工艺优化情况下经济可行性的局限。
【数据】TEA结果：所有情景年利润为负值
讨论与解读
本研究证实，污水污泥（RSS）的水热碳化（HTC）过程形成了化学组成复杂的HTC水相（HTC-AP），其中含有挥发性脂肪酸（VFA）和多种具有潜在毒性效应的化合物。分析表明，温度和停留时间显著影响HTC产物的数量和质量。较低温度（180°C）有利于形成更简单、更易消化的有机酸，同时毒性酚类和杂环化合物的生成有限；而300°C下进行的工艺则产生更高比例的疏水性和细胞毒性化合物。解脂耶氏酵母能够在HTC-AP存在下生长，尤其是来源于较温和工艺条件（TT180 RT60）的HTC-AP。最佳结果来自野生型菌株A101——其对培养基中毒素具有最高耐受性并有效同化VFA；在修饰菌株中，双突变株ΔEYD DGA1具有最佳的适应性和脂质形成潜力，这归功于其克服渗透胁迫的能力以及通过基因工程改善的脂质合成通路。代谢工程方法此前未在HTC-AP上测试过，但结果强烈表明这是实现更高效增值、提高脂质等增值产品产率的可行路径。挥发性酸消耗分析进一步证实了这些发现。
编译者解读： 本研究巧妙地将废弃物处理与微生物脂质生产耦合，以HTC-AP替代传统发酵碳源，在废弃物资源化链条中嵌入了一个高值转化节点。方法上的亮点在于系统比较了野生型与代谢工程菌株对复杂底物的适应性，为工程菌株在真实废弃物基质中的表现提供了宝贵数据。技术经济分析坦诚地揭示了当前工艺在经济性上的短板——所有情景年利润均为负值，这种不回避局限性的态度值得肯定。后续若能在HTC条件精细化调控、菌株耐受性定向进化及发酵工艺放大等方面协同优化，该技术路线有望实现从实验室可行到工业可用的跨越。
参考来源
Szczepańczyk M. Lipid biosynthesis from HTC-AP of sewage sludge using engineered Yarrowia lipolytica. Journal of Environmental Management, 2026. DOI: 10.1016/j.jenvman.2026.130244
DOI: 10.1016/j.jenvman.2026.130244