来源：Characterization of Pichia pastoris protease and its application in improving the quality and storage stability of dried pork jerky（Food Chemistry）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
肉干类产品的风味形成与蛋白质降解密切相关，而内源蛋白酶活力有限、易受抑制，外源蛋白酶成为提升产品品质的有效策略。本研究系统表征了毕赤酵母（Pichia pastoris）来源蛋白酶的酶学特性，将其应用于猪肉干加工，考察了其对肌原纤维蛋白的降解效果及对贮藏期间品质劣变的抑制作用。研究发现该蛋白酶在温和条件（pH 5、30°C）下活性最佳，0.06%添加量可显著抑制25°C贮藏42天期间TVB-N的积累（19.2 mg/100 g对对照组23.1 mg/100 g），同时抑制脂质氧化和微生物增殖，展现出作为肉制品多功能加工助剂和天然生物防腐剂的潜力。
研究背景
猪肉干因其独特风味和质地深受消费者喜爱，其风味化合物和质构特性的形成与加工过程中的蛋白质降解密切相关。蛋白酶介导的蛋白水解在风味发育中起关键作用，主要通过两条途径实现：肌肉组织中的内源蛋白酶和来源于微生物的外源蛋白酶。研究表明，这些蛋白酶催化蛋白质水解，产生肽和游离氨基酸等重要风味前体，再经复杂生化反应转化为醛类、醇类、有机酸、酯类和含硫化合物等挥发性风味物质。由于肉品发酵过程中内源蛋白酶活性有限且易受抑制，控制性添加外源蛋白酶是增强蛋白质水解的有效策略。乳酸菌和葡萄球菌来源蛋白酶的性质及风味增强功能已被广泛研究，而酵母来源蛋白酶在肉制品中的应用潜力尚待深入挖掘。
研究方法
2.1 材料
猪后腿肌肉取自哈尔滨大众肉联集团有限公司（中国黑龙江省哈尔滨市）。样品采集自经兽医部门官方检验认证健康的哈尔滨白猪。肌肉在宰后30分钟内切取，去除可见脂肪和结缔组织，4°C条件下运抵实验室进行后续分析。牛血清白蛋白（BSA）、酪蛋白、三氯乙酸（TCA）等所有化学试剂均为分析纯，购自北京索莱宝科技有限公司。
2.2 微生物与蛋白酶制备
本研究使用毕赤酵母菌株GS115（ATCC 20864）。将毕赤酵母在YPD培养基中（30°C，200 rpm）培养并监测OD600生长曲线36小时，二代培养物扩增48小时。随后通过离心（10,000 ×g，10 min，4°C）获得粗蛋白酶提取液，立即进行活性测定。
【数据】菌株：P. pastoris GS115（ATCC 20864）；培养基：YPD；温度：30°C；转速：200 rpm；离心：10,000 ×g，10 min，4°C；培养时间：36 h（生长监测）/48 h（扩增）
2.3 蛋白酶活性与蛋白浓度测定
蛋白酶活性采用改良Folin-酚法测定：稀释上清液与1%酪蛋白在37°C孵育10分钟，TCA终止反应，离心后上清液加入碳酸钠和Folin试剂在40°C显色20分钟，680 nm处读取吸光度。一个酶活单位（U）定义为每分钟释放1 μg酪氨酸所需的酶量。蛋白浓度采用双缩脲法测定。
【数据】底物：1%酪蛋白；反应温度：37°C；反应时间：10 min；显色温度：40°C；显色时间：20 min；检测波长：680 nm；酶活单位定义：1 U = 1 μg酪氨酸/min
2.4 毕赤酵母产酶条件优化
#### 2.4.1 培养时间
将活化后的二代毕赤酵母以1%（v/v）接种量接种于50 mL YPD培养基中，30°C、200 rpm振荡培养。分别在0、12、24、36、48和60小时取样10 mL。离心获得粗蛋白酶提取液，立即测定活性，构建时间-活性曲线并确定最佳产酶时间。
【数据】接种量：1%（v/v）；培养基体积：50 mL；温度：30°C；转速：200 rpm；取样时间点：0、12、24、36、48、60 h
#### 2.4.2 培养温度
毕赤酵母在不同温度（20、25、30、35和40°C）的YPD培养基中振荡培养（200 rpm）。培养结束后，各温度发酵液离心，所得粗提取液直接用于蛋白酶活性测定，确定最佳培养温度。
【数据】温度梯度：20、25、30、35、40°C；转速：200 rpm；培养基：YPD
#### 2.4.3 初始pH
使用0.1 M HCl或NaOH将YPD培养基初始pH调节至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。将活化菌株接种于不同pH培养基中培养。发酵结束后离心，粗提取液测定蛋白酶活性，确定最佳初始pH。
【数据】pH梯度：3.0-11.0；调节试剂：0.1 M HCl/NaOH；培养基：YPD
#### 2.4.4 接种量
考察不同接种量（1%、2%、3%、4%和5%，v/v）的活化毕赤酵母。菌株接种于YPD培养基中，在标准条件下发酵。在对数生长后期取样，离心收集粗蛋白酶提取液，立即分析活性以确定最佳接种量。
【数据】接种量梯度：1%、2%、3%、4%、5%（v/v）；培养基：YPD
2.5 蛋白酶纯化
#### 2.5.1 硫酸铵分级沉淀
粗蛋白酶采用80%硫酸铵沉淀进行纯化。将硫酸铵粉末在持续搅拌下逐渐加入粗酶液中至完全溶解，4°C孵育8小时。离心（10,000 ×g，15 min，4°C）收集沉淀，用20 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.0）复溶，透析过夜。选择高活性组分进行后续步骤。
【数据】硫酸铵饱和度：80%；孵育温度：4°C；孵育时间：8 h；离心：10,000 ×g，15 min，4°C；缓冲液：20 mM磷酸钠缓冲液（pH 6.0）
#### 2.5.2 阴离子交换色谱
透析后的蛋白酶上样至DEAE-Sepharose™ FF柱（2.1 × 15 cm），该柱预先用50 mM Tris-HCl缓冲液（pH 6.0，缓冲液A）平衡。结合蛋白用缓冲液B（50 mM Tris-HCl，pH 6.0）中0–1.0 M NaCl线性梯度洗脱，流速1 mL/min。收集280 nm处有吸收的组分进行进一步分析。
【数据】色谱柱：DEAE-Sepharose™ FF（2.1 × 15 cm）；平衡缓冲液：50 mM Tris-HCl（pH 6.0）；洗脱梯度：0–1.0 M NaCl；流速：1 mL/min；检测波长：280 nm
#### 2.5.3 凝胶过滤色谱
蛋白酶溶液上样至Sephadex G-75柱（1.8 × 40 cm），用缓冲液A洗脱。收集4 mL组分，合并280 nm处出现峰值的组分，冷冻干燥后于4°C保存。
【数据】色谱柱：Sephadex G-75（1.8 × 40 cm）；洗脱液：缓冲液A（50 mM Tris-HCl，pH 6.0）；组分体积：4 mL；检测波长：280 nm；保存条件：4°C
2.6 蛋白质水解度测定
#### 2.6.1 肌原纤维蛋白（MP）提取
MP从50 g猪背最长肌（长白×约克夏杂交猪，宰后24小时）中提取。同一批次的肌肉用于所有提取以确保一致性。肉样与提取缓冲液按1:4（w/v，g mL⁻¹）比例均质（缓冲液组成：10 mM NaH₂PO₄·2H₂O、0.01 mM Na₂HPO₄·12H₂O、0.1 M NaCl、0.02 M MgCl₂、0.01 M EGTA，pH 7.0），离心（3500 ×g，20 min）。收集沉淀，重复提取两次。沉淀用0.1 M NaCl（pH 7.0）洗涤两次，在相同溶液中重新均质，用纱布过滤，滤液用0.1 M HCl调节pH至6.0。最终离心后获得MP沉淀。蛋白浓度以BSA为标准品，采用Bradford法测定。
【数据】肉样量：50 g；提取缓冲液比例：1:4（w/v）；离心：3500 ×g，20 min；洗涤：0.1 M NaCl（pH 7.0）×2次；pH调节：0.1 M HCl至pH 6.0；蛋白定量：Bradford法（BSA标准）
#### 2.6.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
参照Li等人（2026）的方法并适当修改。120分钟MP水解物（2 mg/mL）在载样缓冲液中变性后，采用SDS-PAGE（12%分离胶、5%浓缩胶）分析。电泳（80 V后120 V）结束后，考马斯亮蓝染色观察蛋白条带并记录。
【数据】样品浓度：2 mg/mL；分离胶：12%；浓缩胶：5%；电泳：80 V后120 V；染色：考马斯亮蓝
#### 2.6.3 水解度（DH）
MP水解物离心（10,000 ×g，10 min）。取400 μL上清液和400 μL丝氨酸标准品，分别与3 mL OPA试剂混合。反应2分钟后，在340 nm处测定吸光度。DH按给定公式计算。
【数据】离心：10,000 ×g，10 min；样品量：400 μL；OPA试剂量：3 mL；反应时间：2 min；检测波长：340 nm
#### 2.6.4 TCA可溶性肽含量
参照Li等人（2020）的方法并略作修改。将5 mL 15%（w/v）TCA加入5 mL蛋白酶处理的MP溶液中。混合孵育30分钟后，离心（5000 ×g，10 min）。上清液采用双缩脲法在540 nm处读取吸光度。
【数据】TCA浓度：15%（w/v）；样品与TCA体积：各5 mL；孵育时间：30 min；离心：5000 ×g，10 min；检测波长：540 nm；方法：双缩脲法
#### 2.6.5 蛋白酶对MP溶解度的影响
参照Song等人（2026）的方法并适当修改。MP溶液用PBS（20 mM，pH 7.0）稀释至3 mg/mL。取3 mL样品离心（10,000 ×g，10 min，4°C）。取1 mL上清液与4 mL双缩脲试剂混合，反应30 min，记录540 nm处吸光度。据此计算溶解度。
【数据】MP浓度：3 mg/mL；缓冲液：PBS（20 mM，pH 7.0）；离心：10,000 ×g，10 min，4°C；上清液/试剂：1 mL/4 mL；反应时间：30 min；检测波长：540 nm
#### 2.6.6 激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）
向1 mL各MP样品中加入20 μL 0.1%（w/v）尼罗蓝染液并混合。取8 μL染色样品滴加在载玻片上。使用激光共聚焦扫描显微镜在40×或20×物镜、25°C条件下观察并采集图像。
【数据】染液：0.1%（w/v）尼罗蓝；染液用量：20 μL/1 mL样品；上样量：8 μL；物镜：40×/20×；观察温度：25°C
2.7 猪肉干贮藏特性
#### 2.7.1 样品制备与贮藏
猪肉干制备流程包括：原料肉预处理、绞碎、配料混合、斩拌、腌制、摊筛、干燥（65°C，3 h）、烘烤（85°C，45 min）、压片、切片和包装。配方为瘦肥肉糜1:9（w/w）混合。相对总肉糜质量的添加剂包括：7.5%细砂糖、5%蚝油、1.25%食盐、0.75%味精、0.75%老抽、0.75%生抽、0.25%白胡椒粉，以及不同水平（0、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%）的毕赤酵母蛋白酶。猪肉干样品分别真空包装，在4°C、25°C和37°C下贮藏60、42和15天。
【数据】干燥：65°C，3 h；烘烤：85°C，45 min；肥瘦比：1:9（w/w）；添加剂：7.5%糖、5%蚝油、1.25%盐、0.75%味精、0.75%老抽、0.75%生抽、0.25%白胡椒粉；蛋白酶添加量：0-0.10%；贮藏条件：4°C/60天、25°C/42天、37°C/15天
研究结果
3.1 毕赤酵母蛋白酶的生化特性
#### 3.1.1 毕赤酵母生长曲线
在延滞期（0–6 h），细胞浓度增长缓慢，表明细胞处于对培养环境的适应阶段（图1A）。6至9小时之间，毕赤酵母细胞密度迅速上升至2.5，对应对数生长期。9至15小时，细胞密度逐渐稳定并达到最大值2.75，进入稳定期。培养27小时后观察到细胞密度略有下降，标志着衰亡期的开始。为排除盐离子对蛋白酶结构的潜在影响，同时提高纯度和相对活性，首先对经70%硫酸铵沉淀获得的蛋白酶样品进行透析。透析后样品采用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱系统进行分级分离。如表1所总结，评估了不同纯化阶段毕赤酵母蛋白酶的活性、总蛋白含量、纯化倍数和回收率。从培养液中提取的粗蛋白酶初始活性为21.46 U，总蛋白含量为18.32 mg。经硫酸铵沉淀和透析后，部分可溶性杂质被去除，总蛋白含量降至9.98 mg，但纯化倍数仅为1.12，表明这些步骤对蛋白酶的纯化效果有限。随后的离子交换色谱和凝胶过滤纯化将总蛋白含量显著降至0.42 mg，比活力提高至10.49 U/mg，纯化倍数达9.20。
【数据】延滞期：0-6 h；对数期细胞密度：2.5（6-9 h）；稳定期最大细胞密度：2.75（9-15 h）；衰亡期起始：27 h；粗酶活性：21.46 U；粗酶总蛋白：18.32 mg；硫酸铵沉淀后总蛋白：9.98 mg；纯化倍数：1.12；纯化后总蛋白：0.42 mg；比活力：10.49 U/mg；纯化倍数：9.20
#### 3.1.2 培养时间对毕赤酵母产酶的影响
蛋白酶作为生物催化剂，在肉品加工中将蛋白质水解为肽和游离氨基酸，对风味形成具有重要贡献。毕赤酵母培养过程中胞外蛋白酶活性的变化如图1B所示。蛋白酶活性呈现典型的先升高后逐渐下降的趋势。具体而言，蛋白酶活性在培养早期（0–12 h）即可检测到，48小时达到峰值4.78 U/mL，随后至72小时显著下降至3.25 U/mL（P < 0.05）。这一模式与微生物生长和代谢特征密切相关：在早期阶段（0–12 h），蛋白酶合成随生物量积累而增加；在稳定期，蛋白酶活性达到最大值；在后期（24 h以后），营养消耗和代谢产物积累可能形成不利环境，导致细胞活力降低以及胞外蛋白酶的潜在不稳定或失活。此外，pH波动和代谢物抑制等环境因素的变化也可能导致蛋白酶活性的下降。
【数据】峰值酶活：4.78 U/mL（48 h）；72 h酶活：3.25 U/mL（P < 0.05）
#### 3.1.3 初始pH、培养温度和接种量对粗蛋白酶产量的影响
培养环境的初始pH不仅影响微生物的生长和代谢，还不同程度地影响细胞膜通透性和胞外蛋白酶分泌。当pH从3升至11时，蛋白酶活性呈先升高后降低的趋势，在pH 5时达到最高值12.28 U/mL。培养基的初始pH可能通过影响生长因子的跨膜转运间接干扰微生物蛋白酶的合成。适宜的pH环境支持更高的微生物代谢效率，有利于蛋白酶表达和活性维持。初始pH在5至8之间时蛋白酶活性维持在相对较高水平，而在过低（pH 3–4）或过高（pH 9–11）的初始pH条件下，蛋白酶产量显著降低（P < 0.05）。
培养温度同样显著影响微生物蛋白酶的合成与活性。不同微生物（如假单胞菌、乳酸菌和芽孢杆菌）的产酶最适温度差异较大，通常在20至50°C之间。蛋白酶活性与培养温度显著相关（P < 0.05），呈先升高后降低的趋势（图1D）。30°C时观察到最高蛋白酶活性（17.33 U/mL），显著高于其他温度（P < 0.05）。因此，30°C被确定为毕赤酵母产蛋白酶的最佳培养温度。
接种量是影响毕赤酵母生长和蛋白酶分泌的另一关键因素，直接影响细胞状态和代谢效率。蛋白酶活性与接种量之间存在显著的剂量依赖关系（P < 0.05），呈先升高后降低趋势（图1E）。2%接种量时获得最高蛋白酶活性（18.24 U/mL），偏离该水平均导致活性显著降低。这可能归因于低接种量下生物量积累不足，限制了总蛋白酶合成；而过高接种量可能加剧营养竞争和环境胁迫，从而抑制代谢活性和蛋白酶产生。
【数据】最适pH：5（酶活12.28 U/mL）；最适温度：30°C（酶活17.33 U/mL）；最适接种量：2%（酶活18.24 U/mL）
#### 3.1.4 碳源和氮源对蛋白酶产量的影响
毕赤酵母蛋白酶产量受培养基中碳源和氮源类型的显著影响，反映了其优化用于高效蛋白质合成的独特代谢特征。在测试的氮源中，有机氮比无机氮支持显著更高的蛋白酶活性（P < 0.05）。胰蛋白胨产生最高活性（图2A），这归因于其富含氨基酸、肽和维生素，为蛋白质合成提供直接前体和辅因子，从而降低从头合成的代谢成本，将资源重新导向蛋白酶分泌。相比之下，无机氮源（如硫酸铵、硝酸钾）严重限制蛋白酶产量，与该菌株将简单氮同化为复杂生物分子的能力有限一致。
对于碳源，葡萄糖产生最高的蛋白酶活性，显著超过蔗糖、淀粉或半乳糖（图2B）。葡萄糖可被快速同化并进入中心糖酵解途径，确保高ATP产量和丰富的代谢中间产物（如磷酸烯醇式丙酮酸、α-酮戊二酸），为生长和能量密集型的胞外蛋白酶合成提供燃料。相反，乳糖产生的活性最低，可能归因于该菌株中β-半乳糖苷酶途径的缺失或低表达，导致碳摄取不良和代谢能量不足。总之，毕赤酵母的蛋白酶产量由复合有机氮（胰蛋白胨）和易代谢单糖（葡萄糖）的组合最优支持，与其作为设计用于高密度生长和高效重组蛋白分泌的微生物宿主的生理特征相一致。
【数据】最佳氮源：胰蛋白胨；最佳碳源：葡萄糖；最差碳源：乳糖
3.2 毕赤酵母蛋白酶对肌原纤维蛋白的降解
#### 3.2.1 毕赤酵母蛋白酶对肌原纤维蛋白的水解作用
SDS-PAGE是研究蛋白质降解的重要方法，可清晰揭示肌原纤维蛋白水解过程中特定蛋白的变化，已被广泛用于肌原纤维蛋白的定性分析。蛋白质水解被认为是发酵肉制品特征风味和口感形成的关键因素。
【数据】分析方法：SDS-PAGE；样品：肌原纤维蛋白水解物
（以下为原文后续内容，因节选截止未提供完整结果数据）
讨论与解读
本研究证实毕赤酵母来源的蛋白酶具有优良的酶学特性和在肉制品中的应用潜力。该蛋白酶在温和条件（pH 5、30°C）下表现出最佳活性，能有效降解肌原纤维蛋白，其中肌球蛋白被确定为主要底物。经硫酸铵沉淀和色谱技术纯化后，比活力提高至10.49 U/mg，达到9.20倍纯化。值得注意的是，0.06%浓度的毕赤酵母蛋白酶显著增强了猪肉干的贮藏稳定性——在25°C贮藏42天后，处理组TVB-N维持在19.2 mg/100 g，而对照组为23.1 mg/100 g。此外，蛋白酶处理在不同贮藏温度下持续抑制脂质氧化（以TBARS值衡量）和微生物生长。
编译者解读：该研究将酵母源蛋白酶从"产酶条件优化—纯化表征—底物降解—产品应用"全链条打通，方法学上的亮点在于系统性地建立了蛋白酶特性与肉制品保质期之间的定量关联。0.06%的添加量即能同时抑制微生物腐败（TVB-N）、脂质氧化（TBARS）和微生物增殖三条劣变途径，说明定向蛋白水解可以成为多靶点品质保持的杠杆策略。值得关注的是，该酶在温和酸性条件下的活性特征与肉制品加工环境的适配性，这为其工业化应用减少了额外的工艺调整成本。不过，研究中蛋白酶对风味轮廓的具体影响（如挥发性风味物质的组成变化）未在节选部分展开，后续若能与感官评价和风味组学数据结合，将更完整地支撑其"多功能加工助剂"的定位。
参考来源
Zhang Z. Characterization of Pichia pastoris protease and its application in improving the quality and storage stability of dried pork jerky. Food Chemistry, 2026. DOI: 10.1016/j.foodchem.2026.149244
DOI: 10.1016/j.foodchem.2026.149244