来源：Oral recombinant Pichia pastoris-CXCL20a optimized by combined approaches remarkably inhibits GCRV infection in grass carp (Ctenopharyngodon idella)（Aquaculture）| 编译：DNA Lab Space | 原文许可：elsevier-subscription
导读
草鱼呼肠孤病毒（GCRV）给草鱼养殖业造成严重经济损失。本研究通过密码子优化、多拷贝整合及诱导条件优化，在毕赤酵母中实现了草鱼趋化因子CXCL20a的高效胞内表达（Pp-C20a）。结果显示，300 mg/kg Pp-C20a饲喂28天使GCRV攻毒草鱼存活率较对照组显著提高24%（p < 0.05），并上调关键免疫基因表达、抑制病毒复制、减轻组织损伤。研究为草鱼出血病的绿色防控提供了"表达-递送"一体化的新策略。
研究背景
草鱼是全球养殖量最大的淡水鱼类，2023年产量约600万吨，经济价值巨大。然而，GCRV引起的草鱼出血病持续造成严重经济损失，并导致治疗药物的大量使用，引发养殖业关切。趋化因子是一类8–12 kDa的低分子量蛋白，通过受体结合调节免疫细胞迁移，在发育、炎症、免疫应答和伤口愈合中发挥关键作用。越来越多的证据表明，部分趋化因子除趋化活性外还具备直接抗菌活性，二者存在进化上的功能关联。CXCL20作为CXC趋化因子家族成员，其免疫调节与抗微生物潜力为开发新型水产免疫增强剂提供了思路。利用毕赤酵母作为表达宿主兼口服递送载体，可望解决生物活性蛋白在胃肠道中稳定性差的问题。
研究方法
2.1 实验鱼与毕赤酵母GS115
健康草鱼（平均体重：10 ± 1 g）购自华中农业大学淡水水产健康养殖协同创新中心（中国武汉）。驯化两周后，在28天实验期间每日投喂两次（09:00和17:00），投喂量为体重的2%，维持以下饲养条件：水温28 ± 1 °C，溶解氧9 ± 0.5 mg/L。实验方案经华中农业大学动物研究伦理委员会审查批准（批准号：HZAUFI-2023-0065）。毕赤酵母GS115（NRR01030）菌株购自Thermo Fisher Scientific，在YPD液体培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）中于28 °C培养24 h。
【数据】草鱼体重：10 ± 1 g；投喂量：体重的2%；水温：28 ± 1 °C；溶解氧：9 ± 0.5 mg/L；培养基：YPD（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖）；培养温度：28 °C；培养时间：24 h；伦理批准号：HZAUFI-2023-0065
2.2 质粒构建、CXCL20a胞内表达与鉴定
CXCL20a的编码DNA序列（CDS）（GenBank登录号：AB218609）通过将低频密码子替换为毕赤酵母偏好密码子进行优化。三个优化变体（cxcl20a-a、cxcl20a-b和cxcl20a-c）由GenScript（中国武汉）合成。密码子适应指数（CAI）和最小自由能（MFE）分别使用GenScript的稀有密码子分析工具和RNAstructure Web Server计算。每个优化序列随后克隆至表达载体pPIC3.5K中，构建pPIC3.5K-CXCL20a-a、pPIC3.5K-CXCL20a-b和pPIC3.5K-CXCL20a-c。为进一步筛选最优多拷贝菌株，将cxcl20a-b序列分别插入pPIC3.5K载体两次和三次，获得质粒pPIC3.5K-2CXCL20a-b和pPIC3.5K-3CXCL20a-b。
为获得酵母表达菌株，质粒经Sal I线性化后，使用Bio-Rad Gene Pulser Xcell电穿孔仪（1.5 kV，25 μF，200 Ω）电转入毕赤酵母GS115感受态细胞。转化细胞涂布于MD琼脂平板（1.34% YNB、0.00004%生物素、2%葡萄糖、2%琼脂）进行初步筛选。随后，MD平板上的菌落被转接到含遗传霉素（G418）浓度为0.5至8.0 mg/mL的YPD琼脂平板（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖、2%琼脂）上进行多水平抗生素筛选。阳性克隆最终通过PCR扩增验证。
获得阳性转化子后，将细胞接种至25 mL BMGY培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、1.34% YNB、0.00004%生物素、1%甘油；用磷酸钾缓冲液调pH），28 °C振荡培养至OD600达到2–6。室温下3,000 × g离心5 min后，将酵母重悬于BMMY培养基（BMGY中以甲醇替代甘油）至OD600为1.0。为启动诱导，加入100%甲醇并每24 h补充一次以维持诱导。在诱导条件优化前，诱导参数为：72 h、1.0%甲醇、pH 6.5、28 °C。
诱导结束后，收集酵母细胞，裂解后加入5 × SDS上样缓冲液于100 °C加热10 min。蛋白随后经15% SDS-PAGE分离并转印至硝酸纤维素膜。膜用TBST配制的5%脱脂牛奶封闭，然后与兔抗CXCL20a多克隆抗血清（1:200稀释）在25 °C孵育2 h（Zhang et al., 2021）。TBST洗涤三次后，膜与HRP标记的山羊抗兔IgG（1:5000；ABclonal，中国北京）在25 °C孵育1 h。蛋白信号使用Clarity™ Western ECL底物（Bio-Rad）检测，并以Amersham Imager 600成像。条带强度使用ImageJ软件定量。
【数据】电转化参数：1.5 kV、25 μF、200 Ω；MD平板成分：1.34% YNB、0.00004%生物素、2%葡萄糖、2%琼脂；G418筛选浓度：0.5–8.0 mg/mL；BMGY体积：25 mL；诱导起始OD600：1.0；甲醇补充间隔：每24 h；初始诱导条件：72 h、1.0%甲醇、pH 6.5、28 °C；SDS加热：100 °C、10 min；SDS-PAGE浓度：15%；一抗稀释度：1:200；孵育条件：25 °C、2 h；二抗稀释度：1:5000；二抗孵育：25 °C、1 h
2.3 口服给药与病毒攻毒
共500尾草鱼随机分为五个实验组。三个处理组分别投喂添加100、200或300 mg/kg Pp-C20a的饲料，另外两组分别给予PBS或100 mg/kg pPIC3.5K/GS115。为制备实验饲料，毕赤酵母培养物经离心、冻干，并按先前描述的方法（Wang et al., 2024）掺入饲料颗粒中。实验饲料在第2周和第4周投喂，第1周和第3周换回标准商品饲料。第29天，按先前建立的方法（Wang et al., 2025）通过浸泡方式对鱼进行GCRV攻毒。简要流程：草鱼先在6% NaCl溶液中浸泡，然后转移至GCRV-II（GCRV-097）悬液中（滴度为1.60 × 10³ RNA拷贝/μL，使用10倍稀释），浸泡30 min。
【数据】实验鱼总数：500尾；Pp-C20a剂量：100、200、300 mg/kg；攻毒方式：浸泡；NaCl浓度：6%；病毒滴度：1.60 × 10³ RNA拷贝/μL；稀释倍数：10倍；浸泡时间：30 min；攻毒时间：第29天
2.4 样品采集
在指定时间点，鱼先用MS-222（100 mg/L）麻醉后再取样。分别于第0天（基线）、第28天（攻毒前）、第30、32、36和43天采集血液，用于血清分离和生化检测。头肾、脾脏和肠道组织于第28、30、32、36和43天采集，立即在液氮中速冻，-80 °C保存，用于后续RNA提取和RT-qPCR分析。第36天进行组织病理学评估时，每组采集脾脏和肠道样本（每组n = 6），置于4%多聚甲醛中固定。
【数据】麻醉剂：MS-222（100 mg/L）；采血时间点：第0、28、30、32、36、43天；组织采集时间点：第28、30、32、36、43天；组织病理学样本量：每组n = 6；固定液：4%多聚甲醛
2.5 RT-qPCR
使用RNAiso Plus Kit（Takara，中国北京）从头肾、脾脏和肠道组织中提取总RNA（每个组织三个生物学重复）。RNA完整性通过1%琼脂糖凝胶电泳验证。随后，1 μg总RNA逆转录为cDNA。合成的cDNA用无RNase水稀释至100 ng/μL，并使用AceQ® qPCR SYBR Green Master Mix（Vazyme，中国南京）进行RT-qPCR分析，以18S rRNA作为内参基因。扩增程序为：95 °C初始变性1 min，然后40个循环的95 °C 10 s、60 °C 20 s、72 °C 20 s。RT-qPCR所用引物序列列于表1。所有反应均进行三次技术重复，相对基因表达水平采用2−ΔΔCt法计算。
【数据】RNA提取试剂盒：RNAiso Plus Kit；总RNA用量：1 μg；cDNA稀释浓度：100 ng/μL；内参基因：18S rRNA；扩增程序：95 °C 1 min；40个循环（95 °C 10 s、60 °C 20 s、72 °C 20 s）；技术重复：3次；定量方法：2−ΔΔCt法
2.6 血清生化指标测定
血清总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性使用商业检测试剂盒（南京建成生物工程研究所，中国南京）进行定量。补体C3浓度通过ELISA测定（江苏麦曼实业有限公司，中国盐城）。所有检测均设三个生物学重复。
【数据】T-SOD检测试剂盒来源：南京建成生物工程研究所；补体C3检测方法：ELISA（江苏麦曼实业有限公司）；生物学重复：3次
2.7 组织病理学检查
脾脏和肠道组织在4%多聚甲醛中固定24 h，随后进行脱水、石蜡包埋，并以4 μm厚度切片。组织切片贴附于粘附载玻片上，经二甲苯脱蜡、梯度乙醇系列复水，苏木精-伊红（H&E）染色。最后使用Case Viewer软件（3DHISTECH Ltd.）采集全切片图像。
【数据】固定时间：24 h；固定液：4%多聚甲醛；切片厚度：4 μm；染色方法：H&E；图像采集软件：Case Viewer
2.8 统计分析
所有数据均以平均值 ± 标准差（SD）表示。统计分析使用SPSS 26.0软件进行。存活率采用log-rank（Mantel-Cox）检验比较，星号（）表示差异具有统计学意义。组间比较采用单因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey事后检验。差异显著性标准为p < 0.05、p < 0.01、*p < 0.001。不同小写字母上标（a、b、c、d）表示组间差异显著。
【数据】统计软件：SPSS 26.0；显著性阈值：p < 0.05、p < 0.01、p < 0.001；存活率检验：log-rank（Mantel-Cox）；组间比较：单因素ANOVA + Tukey事后检验
研究结果
3.1 通过密码子优化和基因拷贝数增加提升CXCL20a在毕赤酵母中的表达
前期研究已证明CXCL20a具有强效广谱抗菌活性（Zhang et al., 2021）。去除N端信号肽后，CXCL20a由102个氨基酸组成（图1A），分子量（MW）为11.29 kDa，等电点（pI）为10.72，pH 7.0时净电荷为+23.1。其总平均亲水性（GRAVY）为-1.149，不稳定指数（II）为29.10，表明CXCL20a是一种稳定的亲水性蛋白（图1B）。为实现异源表达，将cxcl20a基因克隆至pPIC3.5K载体并电转入毕赤酵母GS115（图1C）。随后，转化子在MD平板上筛选，并进一步在YPD-G418平板上筛选，阳性克隆经PCR确认（图1C）。
基于毕赤酵母密码子使用数据库及前期报道（De Schutter et al., 2009; Zhao et al., 2000），设计并克隆了三个密码子优化变体（cxcl20a-a、cxcl20a-b和cxcl20a-c）至pPIC3.5K载体（图2A）。cxcl20a、cxcl20a-a、cxcl20a-b和cxcl20a-c的鸟嘌呤-胞嘧啶（GC）含量分别为44.2%、44.6%、33.3%和38.3%（图2B）。优化变体的密码子适应指数（CAI）显著提高（0.88、0.91和0.99），明显高于原始序列（0.69）（图2B）。原始序列的最小自由能（MFE）为-21.6 kcal/mol，而优化变体cxcl20a-a、cxcl20a-b和cxcl20a-c的MFE值分别为-34.2、-16.8和-23.9 kcal/mol（图2B）。值得注意的是，cxcl20a-b变体具有最低的MFE，提示其mRNA结构可能更有利于表达。Western blot（WB）分析证实CXCL20a-b实现最高表达水平，约为CXCL20a-a的8倍（图2C和D）。
确定最优密码子优化变体后，我们获得了单拷贝菌株（命名为F1），并进一步通过多拷贝整合提升表达。将含有cxcl20a-b基因及两侧AOX1启动子和AOX1终止子的表达盒组装，构建双拷贝菌株pPIC3.5K-2CXCL20a-b/GS115和三拷贝菌株pPIC3.5K-3CXCL20a-b/GS115，分别命名为F2和F3（图3A）。诱导后，三拷贝菌株F3的CXCL20a表达显著增加，比双拷贝菌株F2高出一倍（图3B和C）。
【数据】CXCL20a成熟肽：102个氨基酸；分子量：11.29 kDa；等电点：10.72；pH 7.0净电荷：+23.1；GRAVY：-1.149；不稳定指数：29.10；GC含量：原始44.2%、cxcl20a-a 44.6%、cxcl20a-b 33.3%、cxcl20a-c 38.3%；CAI：原始0.69、优化变体0.88/0.91/0.99；MFE：原始-21.6 kcal/mol、cxcl20a-a -34.2 kcal/mol、cxcl20a-b -16.8 kcal/mol、cxcl20a-c -23.9 kcal/mol；CXCL20a-b表达量：约为CXCL20a-a的8倍；F3表达量：为F2的2倍
3.2 诱导条件优化提升CXCL20a表达
为最大化最优菌株F3的产量，我们系统优化了关键诱导参数，包括诱导时间、甲醇浓度、诱导pH和诱导温度。SDS-PAGE分析显示，CXCL20a的最佳诱导时长首先确定为96 h，显著高于72 h的表达量，120 h时未见进一步增加（图4A）。随后，1.0%甲醇被确定为最有效浓度，产量显著高于1.5%，而0.5%和2.0%的表达量相当（图4B）。此外，诱导pH显著影响产量，pH 8.0时表达量最高（图4C）。再者，32 °C诱导产量显著高于较低温度，而34 °C未提供额外收益（图4D）。综上，最佳诱导条件确定为：96 h、1.0%甲醇、pH 8.0、32 °C。
【数据】最佳诱导时间：96 h（显著高于72 h，120 h无进一步增加）；最佳甲醇浓度：1.0%（显著高于1.5%；0.5%和2.0%相当）；最佳pH：8.0；最佳温度：32 °C（显著高于低温；34 °C无额外收益）
3.3 口服Pp-C20a提升GCRV感染草鱼的存活率和血清生化指标
建立高效表达体系并获得添加型Pp-C20a后，我们评估了其对GCRV感染草鱼存活率剂量依赖性的保护效果（图5A）。存活率分析显示，300 mg/kg Pp-C20a组存活率最高（44%），其次为200 mg/kg组（40%）和100 mg/kg组（34%）（图5B）。然而，pPIC3.5K/GS115组和对照组的存活率分别仅为22%和20%（图5B）。这些结果表明，饲料中添加300 mg/kg Pp-C20a可显著提高GCRV攻毒后的存活率。
为探究存活率改善的潜在机制，我们分析了关键血清免疫相关参数——T-SOD活性和补体C3水平。200和300 mg/kg Pp-C20a组在所有时间点的T-SOD活性均显著高于对照组，峰值活性出现在第32天（图5C）。此外，第32天时200和300 mg/kg组的补体C3水平显著高于其他组，且所有Pp-C20a处理组在第32和36天的C3水平均高于对照组和pPIC3.5K/GS115组（图5C）。综上，这些发现表明口服Pp-C20a增强了GCRV感染草鱼的抗氧化能力和先天免疫。
【数据】存活率：300 mg/kg组44%、200 mg/kg组40%、100 mg/kg组34%、pPIC3.5K/GS115组22%、对照组20%；T-SOD峰值时间：第32天；补体C3显著升高时间点：第32、36天
3.4 饲料Pp-C20a上调关键免疫相关基因的表达
为在分子水平进一步阐明免疫调节效应，我们评估了主要组织（头肾、脾脏和肠道）中免疫相关基因（IL1β、IFN1、IFNγ2和IgM）的表达。第32天，200和300 mg/kg组的头肾和脾脏中IL1β表达较对照组显著上调（图6A和B），其中300 mg/kg组在所有检测组织中转录水平最高（图6A至6C）。第36天，200和300 mg/kg组三个组织中的IFN1表达较对照组显著升高（图6D至6F）。第32天，300 mg/kg组在脾脏和头肾中也表现出最强的IFN1表达（图6D至6F）。类似地，第32天300 mg/kg组头肾和脾脏中的IFNγ2表达显著高于其他组（图6G至6I）。IgM转录水平在整个实验期间逐渐升高，第36和43天时200和300 mg/kg组在所有组织中均表现出显著更高的表达（图6J至6L）。这些结果共同表明，口服Pp-C20a增强了关键免疫基因的表达，并在GCRV感染后激活了草鱼的先天性和适应性免疫通路。
【数据】IL1β显著上调：第32天，200和300 mg/kg组头肾和脾脏；IFN1显著升高：第36天，200和300 mg/kg组三个组织；IFNγ2显著升高：第32天，300 mg/kg组头肾和脾脏；IgM显著升高：第36和43天，200和300 mg/kg组所有组织
3.5 饲料Pp-C20a抑制GCRV感染草鱼的病毒复制并减轻组织损伤
我们进一步定量病毒复制以直接评估Pp-C20a的抗病毒效果。通过定量头肾、脾脏和肠道中VP56 mRNA表达来评估病毒复制。感染后7天，200和300 mg/kg组的VP56水平低于对照组（图7A）。到第43天，300 mg/kg组在头肾和脾脏中表现出显著降低，与其他实验组相比差异显著（图7A）。
最后，我们考察了观察到的免疫增强是否转化为具体的病理改善。组织病理学检查显示各实验组间组织完整性存在显著差异。脾脏中，对照组表现出严重的细胞空泡化和含铁血黄素沉积，表明GCRV感染引起实质性结构损伤（图7B）。相比之下，300 mg/kg组表现出轻微的组织病理学变化，组织形态与空白对照相似（图7B）。类似地，对照组的肠道切片表现出绒毛萎缩、黏膜下层与肌层分离（图7C）。然而，300 mg/kg组保持了明显更轻的肠道损伤，表明Pp-C20a补充有效减轻了GCRV诱导的组织损伤。
【数据】VP56降低：感染后7天（第36天）200和300 mg/kg组低于对照组；第43天300 mg/kg组头肾和脾脏显著降低；组织病理学：对照组脾脏严重细胞空泡化和含铁血黄素沉积；对照组肠道绒毛萎缩、黏膜下层与肌层分离；300 mg/kg组组织形态接近空白对照
讨论与解读
生物制品如抗菌蛋白和肽的治疗应用常受限于其体内固有不稳定性，尤其在胃肠道转运过程中酶解会严重损害其生物利用度。前期研究已表明，由多糖和壳聚糖组成的酵母细胞壁可作为包封抗原的保护屏障，促进生物活性蛋白在消化道中的靶向释放。因此，本研究采用毕赤酵母GS115不仅作为表达宿主，还作为口服递送载体，生产抗GCRV感染的免疫刺激剂。研究证明，毕赤酵母胞内表达的CXCL20a对草鱼GCRV感染具有显著保护作用，凸显了该系统在表达和有效口服递送方面的双重用途。
为实现CXCL20a的高水平胞内生产，本研究采用了多策略分子工程手段。密码子优化是提高异源基因表达的关键步骤，同义密码子使用直接影响翻译效率和mRNA稳定性。研究并未仅依赖CAI指标，而是通过平衡GC含量和MFE等多重因素设计了三个变体，最终CXCL20a-b的优异表达验证了这一策略的有效性。多拷贝整合进一步将表达量翻倍，而诱导条件的系统优化（96 h、1.0%甲醇、pH 8.0、32 °C）最终实现了产量最大化。
在动物水平上，口服Pp-C20a以剂量依赖方式提升存活率、增强抗氧化与补体活性、上调免疫基因表达并抑制病毒复制。组织病理学结果确认了Pp-C20a对GCRV诱导组织损伤的缓解作用。该研究为水产养殖中利用酵母底盘实现"表达-递送"一体化的口服免疫策略提供了完整范例。
【编译者解读】本研究的技术路线具有清晰的工程逻辑——从密码子层面（CAI、GC、MFE多指标权衡）到基因剂量层面（多拷贝整合），再到发酵条件层面（四参数系统优化），层层递进地解决了外源蛋白在酵母中表达量不足的瓶颈问题。值得注意的是，研究者选择胞内表达而非分泌表达，主动利用酵母细胞壁作为天然微囊化载体，这一设计思路巧妙地将"表达宿主"与"递送载体"合二为一，降低了纯化成本，契合水产养殖对低成本疫苗/免疫增强剂的现实需求。从合成生物学角度看，该策略的模块化特征明显——表达元件、拷贝数、诱导条件均可独立优化，为其他鱼类抗菌肽的酵母表达提供了可复制的技术框架。不足之处在于，研究未深入探究CXCL20a在鱼体内的具体作用受体及信号通路，其抗病毒机制仍停留在免疫指标关联层面。未来若能结合荧光标记追踪蛋白在肠道中的释放与吸收动态，将进一步完善该口服递送系统的理论依据。
参考来源
Li W. Oral recombinant Pichia pastoris-CXCL20a optimized by combined approaches remarkably inhibits GCRV infection in grass carp (Ctenopharyngodon idella). Aquaculture, 2026.
DOI: 10.1016/j.aquaculture.2025.743454
DOI: 10.1016/j.aquaculture.2025.743454